Состояние иммунной системы при абдоминальном сепсисе

Полный текст

ИЛ - интерлейкин ИП - индекс переваривания ЛПС - липополисахарид НСТинд - стимулированное зимозаном восстановление нитросинего тетразолия HCTспонт - спонтанное восстановление нитросинего тетразолия ФА - фагоцитарная активность ФНО-α - фактор некроза опухоли-α ФЧ - фагоцитарное число CARS - компенсаторный антивоспалительный ответ (compensatory anti-inflammatory response syndrome) SIRS - синдром системной воспалительной реакции (systemic inflammatory response syndrome) Сепсис - тяжелый генерализованный процесс, сопровождающийся множественной дисфункцией органов и дисрегуляцией иммунного ответа пациента на инфекцию [1]. При этом доля грамотрицательных бактерий среди всех возбудителей сепсиса достигает 45% [2]. При этом летальность от грамотрицательного сепсиса значительно выше, чем от грамположительного [3]. Это обусловлено тем, что почти в 15-22% случаев грамотрицательные бактерии устойчивы практически ко всем цефалоспоринам, карбопенемам, фторхинолонам, аминогликозидам [4, 5]. В нашей стране летальность от сепсиса в реанимационных отделениях также остается высокой и соответствует общемировым показателям [6, 7]. Несмотря на накопленный опыт и достижения современной науки, летальность при сепсисе остается стабильно высокой, при этом отмечается постоянный рост количества больных и стоимости лечения. В последнее десятилетие произошла существенная трансформация представлений в патогенезе грамотрицательного сепсиса. Одним из главных факторов, запускающих системную воспалительную реакцию, является эндотоксин грамотрицательных бактерий, являющийся облигатным липополисахаридом бактериальной стенки [8]. Циркулирующий эндотоксин активирует множество биологических систем: систему коагуляции, комплемента, клетки крови - моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, а также эндотелиоциты с инициированием высвобождения медиаторов иммунного ответа [8, 9]. На фоне повреждения естественных барьеров, роста количества сапрофитных микроорганизмов, перекрестной устойчивости микрофлоры к антибиотикам и др. формируется сначала местная, а позднее генерализованная воспалительная реакция. Запускается каскадный механизм активации медиаторов (интерлейкин-1 - ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, фактор некроза опухоли-α - ФНО-α, простагландины и др.), и формируется системная воспалительная реакция. Микробные токсины активируют систему комплемента, нейтрофилы, моноциты, макрофаги, эндотелиоциты и тромбоциты. У последних повышаются их адгезивные свойства, развиваются дегрануляция и выделение кислородных радикалов, протеаз. В результате происходит активация гуморальных и клеточных механизмов иммунной системы. Конечно, одновременно выделяются противовоспалительные медиаторы (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-13), которые ограничивают воспалительную реакцию. Прогрессирование системной воспалительной реакции приводит к нарушению баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Именно это приводит к срыву регуляции гомеостаза [1, 10-12]. R.C. Bone [13] ввел термин «компенсаторный антивоспалительный ответ» (compensatory anti-inflammatory response syndrome - CARS) с тремя клиническими вариантами: преобладание синдрома системной воспалительной реакции (systemic inflammatory response syndrome - SIRS); преобладание CARS («иммунный паралич», повышенная опасность инфекционной инвазии); сбалансированность SIRS и CARS как благоприятный вариант воспалительной реакции. Таким образом, в настоящее время общепризнано, что основная роль в патогенезе сепсиса принадлежит не инфекционному агенту, а чрезмерной и неадекватной воспалительной реакции, вызванной медиаторами, которые образуются под действием бактериальных токсинов. Возникающий порочный круг приводит к тому, что обменные процессы в организме направлены не на регенерацию, а в большей степени на деструкцию тканей [1, 7, 11, 12, 14]. Цель - оценить прогностическую ценность показателей цитокинового профиля, активности фагоцитоза, концентрации и активности эндотоксина в крови при грамотрицательном сепсисе. Материалы и методы В исследование было включено 78 пациентов с гнойно-септическими осложнениями заболеваний органов брюшной полости. Медиана возраста больных составляла 45 лет, интерквартильный размах - от 34 до 55 лет (минимум - 23 года, максимум - 73 года). Все пациенты находились в МОНИКИ или стационарах Московской области. У всех пациентов был диагностирован сепсис на основании критериев «Сепсис-3» [1]. У данных больных среднее количество баллов по шкале SOFA [Sequential (Sepsis-Related) Organ Failure Assessment Score] составило 6,8±0,8 балла, а по шкале APACHE II (Acute Physiology And Chronic Health Evaluation II) - 16,2±4,8 балла. Всем больным проводили комплекс стандартного интенсивного лечения согласно европейским рекомендациям лечения сепсиса [15]. Из 78 пациентов умерло 45. Концентрацию циркулирующих антител цитокинов (ФНО-α, интерферон-γ - ИНФ-γ, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10) определяли методом иммуноферментного анализа. Результаты иммуноферментного анализа регистрировали на вертикальном фотометре Multiskan MСС 340 (Labsystems, Финляндия). Иммунофенотипические исследования проводили на проточном цитометре Beckman Coulter Cytomics FC 500 с использованием моноклональных антител фирмы Beckman Coulter (США) с реактогенной направленностью против дифференцировочных антигенов и маркеров активации: CD3, CD45RO, CD95, HLA-DR. Для оценки бактерицидной активности нейтрофилов проводили реакцию спонтанного восстановления нитросинего тетразолия (HCTспонт) или стимулированного зимозаном (НСТинд). Интенсивность фагоцитоза нейтрофилов периферической крови оценивали по фагоцитарной активности (ФА - доля клеток, вступивших в фагоцитоз) и фагоцитарному числу (ФЧ - среднее число бактерий, захваченных фагоцитами) через 30 и 120 мин инкубации со штаммом Staphylococcus aureus 209Р. Индекс переваривания (ИП) рассчитывали по формуле: ИП = (ФИ120 - ФИ30)/ФИ30 · 100. Концентрацию эндотоксина (липополисахарида - ЛПС) исследовали при помощи гель-тромб теста Сambrex. В основе этого метода лежит LAL-тест (LAL - limulus amebocyte lysate). Определение активности эндотоксина в цельной крови проводили по методу ЕАА (endotoxin activity assay). Сущность метода заключается в том, что к эндотоксину присоединяются специфические антитела, которые поглощаются рецепторным аппаратом нейтрофилов, затем в присутствии зимозана происходит усиленная респираторная реакция внутри нейтрофилов, которая определяется методом люминол-зависимой хемолюминесценции. ЕАА является количественным методом оценки активности эндотоксина и широко используется для диагностики грамотрицательного сепсиса. Данный метод прошел одобрение FDA (Food and Drug Administration) США [16]. Полученный результат выражается в процентах от максимальной возможной активности. Помимо этого рассчитывается показатель «response», который косвенно отражает максимальную активность выделения кислородных радикалов нейтрофилами. Статистическая обработка. Соответствие распределения выборки нормальному оценивали при помощи критерия Шапиро-Уилка. Количественные данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Для попарного сравнения двух групп использовали парный или непарный критерий Стьюдента с учетом равенства дисперсий. На втором этапе исследования мы проанализировали информативность лабораторных критериев (площадь под ROC-кривой - area under curve, AUC), уровень статистической значимости, пороговое значение параметра. Кроме того, определяли относительный риск смертельного исхода при показателях каждого параметра хуже порогового значения, а также чувствительность и специфичность данного теста (см. таблицу). Анализ проводили в программе SPSS v.24 (SPSS: An IBM Company, США). Оценивали двусторонний уровень значимости. Критическим уровнем значимости считали значения p-value менее 0,05. Результаты Для оценки прогностической значимости на первом этапе было проведено сравнение по основным показателям у выживших и умерших больных: концентрации цитокинов (рис. 1), доли HLA-DR-позитивных CD3-клеток, доли CD3-клеток, экспрессирующих молекулу - индуктор апоптоза (CD95+); показатели бактерицидной и фагоцитарной активности нейтрофилов (рис. 2); показатели тяжести эндотоксинемии (рис. 3). Из рис. 1 видно, что в целом для сепсиса характерно высокое содержание уровня цитокинов, однако у выживших больных концентрации всех цитокинов были несколько ниже. При этом значимые различия были отмечены в концентрациях ФНО-α (p=0,001), ИЛ-6 (p=0,001), ИЛ-8 (p=0,007). Экспрессия молекул HLA-DR (p=0,055) и CD95 (p=0,146) у выживших и умерших больных различалась, но не достигла необходимого уровня статистической значимости. При этом показатели фагоцитарной (p=0,002 для HCTинд и p=0,001 для HCTспонт) и бактерицидной активности (p<0,001) нейтрофилов значительно различались. У умерших впоследствии больных уровень эндотоксиновой нагрузки был выше, чем у выживших больных (см. рис. 3). Это свидетельствует в пользу того, что тяжелая эндотоксинемия в обязательном порядке подлежит коррекции. Информативность исследованных нами показателей представлена в таблице. Обсуждение ФНО-α, продуцируемый макрофагами, тучными клетками, эндотелиальными клетками, Т-лимфоцитами и моноцитами, активирует макрофаги, гранулоциты и цитотоксические клетки, повышает проницаемость капилляров, усиливает адгезию лейкоцитов к эндотелию, индуцирует синтез белков острой фазы и экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости [17]. ИЛ-6 синтезируется Т-хелперами 2-го типа, В-клетками, фибробластами, макрофагами и способствует пролиферации В-лимфоцитов и синтезу белков острой фазы. J.A. Kellum и соавт. [18] установили, что повышенный уровень ИЛ-6 ассоциирован с наибольшим риском смерти у больных сепсисом и имеет лучшую корреляционную зависимость по сравнению с другими провоспалительными цитокинами. ИЛ-8, синтезируемый моноцитами, фибробластами, способствует выделению кислородных радикалов [19]. По данным S. Mera и соавт. [20], высокие начальные уровни концентрации ИЛ-8 являются важным прогностическим фактором смерти у пациентов с сепсисом. Как видно из таблицы, уровни провоспалительных цитокинов (ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8) достоверно различаются у выживших и умерших пациентов и потенциально могут служить диагностическим тестом. H. Chaudhry и соавт. [21] также предполагают, что оценка содержания ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-10 в периферической крови имеет большое патогенетическое значение и может играть важную роль для диагностики и оценки эффективности лечения сепсиса. ИЛ-10 - один из основных противовоспалительных цитокинов, синтезируется Т-хелперами 2-го типа, моноцитами, Т-регуляторными клетками и другими клетками, подавляет дифференцировку Т-клеток в хелперные клетки 1-го типа, является инактиватором макрофагов. Повышение уровня ИЛ-10 в сыворотке крови также коррелирует с высоким риском летального исхода при сепсисе, особенно при увеличении соотношения ИЛ-10/ФНО-α [21]. Хотя уровень ИЛ-10 в нашем исследовании обладает достаточной прогностической ценностью (см. таблицу), различия в концентрации у выживших и умерших пациентов не достигли необходимого уровня статистической значимости (см. рис. 1), несмотря на то что у умерших впоследствии пациентов уровень был выше. Диагностическую ценность этого параметра, по нашему мнению, снижает тот факт, что продукция ИЛ-10 значительно уменьшается у пациентов в крайне тяжелом состоянии. При количестве баллов по шкале APACHE II 31-40 баллов концентрация ИЛ-10 составила 29±4 пг/мл, при средней тяжести состояния (APACHE II 11-30 баллов) концентрация ИЛ-10 составила 75±16 пг/мл, при легкой (APACHE II 1-10 баллов) - 57±12 пг/мл. Следует отметить, что, несмотря на прогностическую информативность уровня цитокинов, их концентрация в крови подвержена значительной вариабельности, что также отмечено другими авторами [5, 11, 14]. Кроме того, существуют различные изоформы цитокинов и компонентов их рецепторного комплекса, синтезируемых за счет альтернативного сплайсинга, которые, возможно, имеют патогенетическое значение [19, 22]. В связи с этим для оценки эффективности терапии необходимо выявить пиковое («наихудшее») значение и оценивать концентрацию в динамике. Поскольку цитокины как прогностический критерий имеют некоторые ограничения, мы оценили информативность других параметров. Значительной прогностической ценностью обладают показатели функции нейтрофилов - результаты спонтанного и индуцированного НСТ-теста, а также индекс переваривания. Выраженные отклонения этих показателей от нормы при тяжелых гнойно-септических осложнениях значительно увеличивает риск летального исхода [23, 24]. Тяжелая эндотоксинемия не только ухудшает состояние пациента, но и является значимым фактором риска смертельного исхода [8, 10, 24]. Как мы установили, показатели концентрации и активности ЛПС связаны не напрямую: имеется умеренная отрицательная связь - r=0,675, р=0,004. По мере роста концентрации ЛПС увеличивается и его активность, которую косвенно отражает показатель EAA. Однако EAA в значительной степени зависит от состояния нейтрофилов, которое выражается показателем «response». При этом связь с EAA отрицательная - r=-0,586, р=0,017, т. е. при увеличении концентрации ЛПС способность нейтрофилов продуцировать кислородные радикалы снижается и, как следствие, нейтрофилы начинают слабее хемилюминесцировать в EAA, что снижает информативность теста. Данный факт подтверждается нашими исследованиями (см. рис 3), наличием умеренной отрицательной связи response и концентрации ЛПС - r=-0,87, р<0,001, а также зарубежным исследованием [25]. По мере прогрессирования тяжести эндотоксинемии показатель EAA может не совсем адекватно отражать тяжесть эндотоксиновой нагрузки. Таким образом, параметры EAA и показатели «response» не заменяют, а дополняют друг друга и должны оцениваться вместе. Заключение Оценка уровня цитокинов является информативной, но, в связи с высоким разбросом показателей у разных пациентов, должна проводиться в динамике. Наиболее информативными прогностическими показателями при сепсисе являются концентрация и активность ЛПС (эндотоксина), фагоцитарная и бактерицидная активность нейтрофилов. Оценка EAA (endotoxin activity assay) должна проводиться совместно с оценкой «response» нейтрофилов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Руслан Викторович Кошелев

ГБУЗ МО «Московский областной научно-клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

Email: koshelevrv@yandex.ru
к.м.н., зам. гл. врача по консультативно-диагностической работе, доц. курса клинической трансфузиологии при каф. анестезиологии и реанимации факультета усовершенствования врачей Москва, Россия

Андрей Владимирович Ватазин

ГБУЗ МО «Московский областной научно-клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

д.м.н., проф., руководитель отд. трансплантологии, нефрологии и хирургической гемокоррекции Москва, Россия

Алексей Батыргараевич Зулькарнаев

ГБУЗ МО «Московский областной научно-клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

д.м.н., гл.н.с. хирургического отд-ния трансплантологии и диализа Москва, Россия

Александр Павлович Фаенко

ГБУЗ МО «Московский областной научно-клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

ассистент курса клинической трансфузиологии при каф. анестезиологии и реаниматологии факультета усовершенствования врачей Москва, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы