Hydrogen effect on the mechanisms of mucosal immunity in patients with COVID-19

Cover Page

Cite item

Abstract

Aim. To study the inhalation of an active form of hydrogen effect to mucosal and system immunity in a rehabilitation program for health workers.

Materials and methods. The study involved patients that survived COVID-19 after therapy with inhaled hydrogen for 90 minutes (n=30), and a control group of patients treated according to standard protocol for managing patients that survived COVID-19 during the rehabilitation period (n=30). Biomaterial was carried out in 2 stages: on the first day of the study, before the accepted therapy and on the 10th day of the study. The indicators of humoral and cellular immunity were studied. The levels of secretory immunoglobulin A (sIgA) and IgG were investigated using the method of enzyme-linked immunosorbent assay. Phagocytosis was assessed on a Beckman Coulter FC-500 flow cytometer. Statistical data processing was carried out in the GraphPad Prism 7.00 software using nonparametric methods.

Results. It was shown that the phagocytic index (PI) of monocytes in nasal scrapings after inhaled hydrogen treatment did not significantly change relative to the first day of treatment and control, while the PI of granulocytes in nasal scrapings significantly increased relative to the first day by 2.5 times (p=0.000189), as well as relative to the control by 1.1 times (p=0.047410). PI of monocytes in pharyngeal scrapings showed a significant increase relative to the first day of treatment by 2.8 times (p=0.041103), however, did not differ relative to the control. PI of granulocytes of pharyngeal scraping did not differ significantly relative to the first day and control. PI of granulocytes and blood monocytes of the studied group did not change significantly. PI of granulocytes and monocytes of peripheral blood relative to control during therapy did not change. The sIgA level in nasal scrapings significantly increased by 2.9 times, while in pharyngeal scrapings the level of sIgA significantly decreased by 2 times.

Сonclusion. We have shown an increase in granulocytes PI in the nasal cavity and oral monocytes, as well as in the level of sIgA in the nasal cavity during therapy with active hydrogen. The data obtained indicate the effectiveness of therapy, which can be used both in the treatment of COVID-19, and in post-COVID syndrome as an additional therapy. The absence of changes in blood parameters, as well as individual links in nasal and pharyngeal scrapings, requires further study to develop ways to overcome treatment tolerance.

Full Text

Список сокращений

ФИ – фагоцитарный индекс

ФИТЦ – флуоресцеин-5-изотиоцианит

sIgA – секреторный иммуноглобулин А

Ig – иммуноглобулин

ФСБ – фосфатно-солевой буфер

Введение

Заболевание, вызванное коронавирусом SARS-CoV-2 (COVID-19), появившееся в декабре 2019 г., представляет собой глобальную проблему, особенно в связи с быстрым увеличением числа тяжелобольных пациентов с пневмонией и отсутствием окончательного лечения. В настоящее время не существует режима специфических противовирусных препаратов, используемых для лечения пациентов в критическом состоянии. Ведение пациентов в основном сосредоточено на оказании поддерживающей терапии, например оксигенации, вентиляции и инфузии. Кроме того, неясными остаются как молекулярные механизмы действия вируса на входные ворота инфекции (слизистые оболочки ротовой и носовой полости), так и адаптивные и врожденные компоненты иммунитета, проявляющие себя во входных воротах инфекции.

В этом контексте достаточно перспективным является метод инфузии водорода, обсуждаемый в статье. Проведены многочисленные исследования, доказывающие эффективность терапии ингаляционным кислородом [1–3]. Национальная комиссия здравоохранения Китая и Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний рекомендовали эффективные меры кислородной терапии в качестве элемента общего лечения пациентов с новой коронавирусной пневмонией (COVID-19). Состав газовой смеси для ингаляции – водород и кислород (от 66,6% H2 до 33,3% O2). Кислород – при явной дисфункции легких при COVID-19, газообразный водород – инертная часть дыхательного газа, но сам по себе может оказывать положительное воздействие на активацию врожденного и адаптивного иммунитета. Свою эффективность терапия газообразным водородом показала при купировании астмы, снимая воспалительный процесс. Именно этот эффект может улучшать состояние, вызываемое цитокиновым штормом, у пациентов с инфекцией, вызванной вирусом SARS-CoV-2. Таким образом, как и другие многообещающие и крайне необходимые лекарственные средства от COVID-19, лечение газообразным водородом требует доскональных исследований и одобрений с достаточной эффективностью и гарантиями безопасности. Лечение газообразным водородом способно активировать сигнальный путь NRF-2 (NF-E2-related factor 2 – фактор 2, связанный с NF-E2), которые обеспечивает цитопротективную активность и уменьшает повреждение тканей, вызванное SARS-CoV-2, способно активировать антиапоптотические эффекты в лимфоцитах, связанные со способностью газообразного водорода улавливать свободные радикалы, что может предотвратить прогрессирование заболевания и использоваться для профилактики и лечения пациентов с COVID-19. Лечение водородом подавляет активацию провоспалительных цитокинов, через NF-kB-путь (nuclear factor κB – транскрипционный фактор NF-κB) также способен подавлять ангиотензинпревращающий фермент 2 [4–6].

Однако до конца остается неясным, как лечение газообразным водородом влияет на иммунную систему пациентов, перенесших вирусную пневмонию, вызванную SARS-CoV-2. Иммунная система слизистых оболочек является крупнейшим компонентом всей иммунной системы, эволюционировавшей для обеспечения защиты от инфекционной угрозы. Поскольку SARS-CoV-2 первоначально поражает верхние дыхательные пути, его первые взаимодействия с иммунной системой происходят преимущественно на поверхности слизистой оболочки дыхательных путей как во время индуктивной, так и во время эффекторной фаз ответа. Иммунная система слизистых оболочек на сегодняшний день является крупнейшим компонентом всей иммунной системы, включающей как клеточный, так и гуморальный иммунитет [2].

Несмотря на значимость местного иммунного ответа в предотвращении дальнейшего распространения вирусов, исследований факторов врожденного иммунитета на уровне слизистых респираторного тракта у пациентов с инфекцией, вызванной новым коронавирусом, проводилось достаточно мало. В связи со сказанным актуальным является изучение местного клеточного и гуморального, а также системного иммунных ответов при COVID-19, а также влияние газообразного водорода на данные показатели.

Цель исследования – изучить влияние ингаляций активной формы водорода на клеточные и гуморальные факторы мукозального и системного иммунитета в реабилитационной программе у медицинских работников после СOVID-19.

Материалы и методы

В исследовании принимали участие пациенты, перенесшие СOVID-19 и принимающие лечение ингаляционным водородом через носовую канюлю (Intersurgical Ltd, Великобритания), соединенную с аппаратом SUISONIA (Япония). Все пациенты получали процедуру ежедневно в течение 90 мин/сут на протяжении 10 дней в течение 90 мин (n=30). Контрольная группа пациентов находилась на лечении согласно стандартному протоколу ведения пациентов, перенесших COVID-19, в период реабилитации в соответствии с клиническими рекомендациями Минздрава России (n=30). У всех пациентов произведен забор биоматериала (кровь, соскоб эпителиальных клеток со слизистой оболочки ротовой и носовой полости). Забор биоматериала осуществлялся в 2 этапа: на 1-й день исследования до принимаемой терапии и на 10-й день исследования. Все пациенты подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании согласно этическим требованиям, изложенным в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 г. и в декларации ЮНЕСКО «Всеобщая декларация по биоэтике и правам человека» 2005 г.

Уровни секреторного иммуноглобулина А (sIgA) и IgG исследованы с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа («Вектор Бест», РФ). Метод определения основан на двухстадийном «сэндвич»-методе твердофазного иммуноферментного анализа с применением моноклональных антител к секреторному компоненту а-цепи IgA. Калибровочные пробы с известной концентрацией sIgA и анализируемые образцы инкубируются в лунках планшета с иммобилизованными моноклональными антителами к sIgA. Степень окраски пропорциональна концентрации sIgA в анализируемом образце. После измерения величины оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывалась концентрация sIgA в анализируемых образцах.

Исследование фагоцитоза проводится методом проточной цитофлуориметрии и включает три этапа: инкубацию Staphylococcus aureus с флуоресцентным красителем флуоресцеин-5-изотиоцианит – ФИТЦ, инкубацию клеток с меченым S. aureus и оценку фагоцитарной функции на проточном цитофлуориметре. Работа выполнена с использованием штаммов коллекции центра коллективного пользования ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова».

Суточные культуры, второй пересев S. aureus Wood 46 смывали изотоническим раствором хлорида натрия, убивали нагреванием 96–98°С в течение 40 мин, после чего осаждали при 1000 g в течение 25 мин и дважды отмывали в 10 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ; «ПанЭко», РФ) рН 7,4. По стандарту мутности концентрацию бактерий доводили до 200 млн/мл карбонатно-бикарбонатным буфером рН 9,5. К взвеси бактерий добавляли ФИТЦ (Sigma-Aldrich, США) в конечной концентрации для убитых бактерий 0,1 мг/мл и инкубировали при 4°С в течение 12 ч. Затем несвязавшийся ФИТЦ удалялся при 3-кратной отмывке 1000 g 25 мин ФСБ. Концентрацию бактерий доводили до 500 млн/мл по стандарту мутности.

Для постановки реакции использовали цельную гепаринизированную кровь. В эппендорфы помещали взвесь ФИТЦ-меченных стафилококков и клетки крови в соотношении 1:10, после чего инкубировали при 37°С 30 мин, затем добавляли 70 мкл лизирующего раствора Optilyse C (Beckman Coulter) для лизиса эритроцитов и инкубировали пробы при комнатной температуре в темноте 30 мин. Затем вносили холодный ФСБ, рН 7,2–7,4, с добавлением 0,02% ЭДТА для остановки фагоцитарной реакции. После 3-кратной отмывки раствором ISOTON II (Beckman Coulter, США) образцы анализировали на проточном цитофлуориметре FC-500 Beckman Coulter. Процент флуоресцирующих (фагоцитировавших) нейтрофилов и моноцитов высчитывался автоматически и выводился в соответствующих гистограммам таблицах статистики. Рекомендуемое количество собираемых событий по нейтрофилам – 3000.

Для изучения фагоцитоза в соскобах использован следующий протокол. Пробирки с соскобами (мазками) центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадок отбирали, а к оставшемуся осадку добавляли 25 мкл взвеси убитых S. aureus, меченных ФИТЦ, ресуспендировали и инкубировали 30 мин при 37°С. Затем добавляли холодный ФСБ, рН 7,2–7,4, с добавлением 0,02% ЭДТА для остановки фагоцитарной реакции. После 3-кратной отмывки раствором ISOTON II образцы анализировали на проточном цитофлюориметре FC-500 Beckman Coulter. Процент флюоресцирующих (фагоцитирующих) гранулоцитов и макрофагов высчитывался автоматически и выводился в соответствующих гистограммах таблиц статистики. Статистическая обработка данных проводилась в программе GraphPad Prism 7.00 с использованием непараметрических методов. Различия считали статистически значимыми при допустимой вероятности ошибки р≤0,05.

Результаты

Исследование фагоцитоза на локальном (в назальном и фарингельном соскобах) и системном уровнях у пациентов, перенесших COVID-19

На I этапе проводилось исследование фагоцитарной активности моноцитарного и гранулоцитарного звеньев в крови. Показано, что фагоцитарный индекс (ФИ) гранулоцитов и моноцитов крови исследуемой группы достоверно не изменялся (рис. 1, 2). На II этапе проводилось исследование фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов в назальных и фарингеальных соскобах. Показано, что ФИ моноцитов в назальных соскобах после лечения водородом достоверно не менялся относительно 1-го дня лечения и контроля, в то время как ФИ гранулоцитов достоверно повышался относительно 1-го дня в 2,5 раза (p=0,000189), а также относительно контроля в 1,1 раза (p=0,047410); рис. 3, 4.

 

Рис. 1. Сравнительная характеристика фагоцитарной активности гранулоцитов в крови.

 

Рис. 2. Сравнительная характеристика фагоцитарной активности моноцитов в крови.

 

Рис. 3. Сравнительная характеристика фагоцитарной активности моноцитов в назальном соскобе.

 

Рис. 4. Сравнительная характеристика фагоцитарной активности гранулоцитов в назальном соскобе.

 

Изучение ФИ моноцитов в фарингеальном соскобе показало достоверное повышение относительно 1-го дня лечения в 2,8 раза (p=0,041103), однако не отличался относительно контроля. ФИ гранулоцитов фарингеального соскоба относительно 1-го дня и контроля достоверно не отличался (рис. 5, 6).

 

Рис. 5. Сравнительная характеристика фагоцитарной активности моноцитов в фарингеальном соскобе.

 

Рис. 6. Сравнительная характеристика фагоцитарной активности гранулоцитов в фарингеальном соскобе.

 

Исследование уровня IgA в назальном, фарингеальном соскобах и слюне

При исследовании sIgA в назальном и фарингеальном соскобах показано, что после терапии водородом на 10-й день в назальных соскобах уровень sIgA достоверно повышался относительно 1-го дня в 2,9 раза (рис. 7), в том время как в фарингеальном соскобе уровень sIgA достоверно снижался в 2 раза относительно 1-го дня забора (рис. 8). В контрольной группе не показано достоверно значимых отличий на 1 и 10-й дни забора в назальных и фарингеальных соскобах. Также не выявлено достоверно значимых отличий в уровне sIgA в слюне в контрольной и исследуемой группах, на 1 и 10-й день, а также при их сравнении.

 

Рис. 7. Сравнительная характеристика уровня sIgA в назальном соскобе в испытуемой группе.

 

Рис. 8. Сравнительная характеристика sIgA в фарингеальном соскобе в испытуемой группе.

 

Обсуждение

SARS-CoV-2, вызывающий новую коронавирусную инфекцию в 2019 г. (COVID-19), представлен Всемирной организацией здравоохранения как «пандемия» в марте 2020 г. По данным Всемирной организации здравоохранения, инфицированных людей и летальных исходов от данной инфекции в мире становится все больше и больше. Для снижения распространения вируса во всем мире предпринимаются попытки разработать соответствующую вакцину, однако чтобы нейтрализовать вирус в месте первоначального проникновения, требуется полноценный мукозальный иммунный ответ. Ранее опубликованы работы, направленные на изучение отдельных компонентов мукозального иммунитета, в частности sIgA [7, 8], а также врожденного иммунного ответа на системном уровне, в частности активации нейтрофилов [9–11], однако необходимо изучение этих показателей в совокупности. Также требуются новые методы профилактики распространения инфекции, направленные на модуляцию иммунного ответа слизистых и системного врожденного иммунитета.

В связи с этим нами проведена работа по изучению фагоцитарной активности гранулоцитарного и моноцитарно-макрофагального звеньев на местном и системном уровнях и sIgA, а также влияния нового метода реабилитации пациентов с постковидным синдромом в виде активного водорода на данные показатели у переболевших пациентов.

Нами показано, что реабилитация активным водородом достоверно усиливает фагоцитарную активность гранулоцитов на 10-й день ежедневных процедур в назальных соскобах, но не влияла на ФИ гранулоцитов в фарингельных соскобах. В то же время терапия водородом достоверно усиливала фагоцитарную активность моноцитов в фарингеальных соскобах. Исследование sIgA показало повышение Ig в назальном соскобе и снижение в фарингельном соскобе на 10-й день применения водорода.

Таким образом, нами впервые изучено влияние ингаляционной формы водорода на врожденный иммунный ответ. Показан достоверный эффект восстановления фагоцитарной функции гранулоцитов в слизистой носа и моноцитов слизистой рта. Влияния водорода на фагоцитарную активность гранулоцитов и моноцитов периферической крови не выявлено.

Заключение

Впервые исследовали влияние активной формы водорода на такие компоненты мукозального иммунитета, как фагоцитарная активность клеток и выработка sIgA. Таким образом, нами показано, что активная форма водорода значимо меняет показатели мукозального иммунитета верхних дыхательных путей, что в дальнейшем может быть использовано как для терапии, так и профилактики COVID-19 в качестве дополнительной терапии. Отсутствие изменений под воздействием терапии в фагоцитарной активности гранулоцитов слизистой рта, моноцитов слизистой носа и указанных клеток крови требует дальнейшего изучения.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Все авторы в равной степени участвовали в подготовке публикации: разработка концепции статьи, получение и анализ фактических данных, написание и редактирование текста статьи, проверка и утверждение текста статьи.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the exploration and analysis work.

×

About the authors

Oxana A. Svitich

Mechnikov Research Institute for Vaccines and Serums

Author for correspondence.
Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1757-8389
SPIN-code: 8802-5569

чл.-кор. РАН, д-р мед. наук, проф., дир., зав. лаб. молекулярной иммунологии

Russian Federation, Moscow

Irina A. Baranova

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2469-7346

д-р мед. наук, проф., проф. каф. госпитальной терапии педиатрического фак-та

Russian Federation, Moscow

Nadezhda O. Kryukova

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8167-0959

аспирант, ассистент каф. госпитальной терапии педиатрического фак-та

Russian Federation, Moscow

Alexander V. Poddubikov

Mechnikov Research Institute for Vaccines and Serums

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8962-4765

канд. мед. наук, зав. лаб. микробиологии условно-патогенных бактерий

Russian Federation, Moscow

Alexandra B. Vinnitskaya

Mechnikov Research Institute for Vaccines and Serums

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0717-8648

науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии

Russian Federation, Moscow

Natalia D. Abramova

Mechnikov Research Institute for Vaccines and Serums

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7307-0515

мл. науч. сотр. лаб. молекулярной иммунологии

Russian Federation, Moscow

Valeria V. Zakharova

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3941-1934

ординатор каф. госпитальной терапии педиатрического фак-та

Russian Federation, Moscow

Ludmila V. Shogenova

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9285-9303

канд. мед. наук, доц. каф. внутренних болезней педиатрического фак-та

 

Russian Federation, Moscow

Mikhail P. Kostinov

Mechnikov Research Institute for Vaccines and Serums

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1382-9403

д-р мед. наук, проф., зав. лаб. вакцинопрофилактики и иммунотерапии аллергических заболеваний

Russian Federation, Moscow

Alexander G. Chuchalin

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5070-5450

акад. РАН, д-р мед. наук., проф., зав. каф. госпитальной терапии педиатрического фак-та, председатель правления Российского респираторного общества

Russian Federation, Moscow

References

  1. Steinhubl SR. Why have antioxidants failed in clinical trials? Am J Cardiol. 2008;101(10A):14D-9D. doi: 10.1016/j.amjcard.2008.02.003
  2. Xia C, Liu W, Zeng D, et al. Effect of hydrogen-rich water on oxidative stress, liver function, and viral load in patients with chronic hepatitis B. Clin Transl Sci. 2013;6(5):372-5. doi: 10.1111/cts.12076
  3. Ge L, Yang M, Yang NN, et al. Molecular hydrogen: a preventive and therapeutic medical gas for various diseases. Oncotarget. 2017;8:102653-73. doi: 10.18632/oncotarget.21130
  4. Giamarellos-Bourboulis EJ, Netea MG, Rovina N, et al. Complex immune dysregulation in COVID-19 patients with severe respiratory failure. Cell Host Microbe. 2020;27(6):992-1000.e3. doi: 10.1016/j.chom.2020.04.009
  5. Qin C, Zhou L, Hu Z, et al. Dysregulation of immune response in patients with Coronavirus 2019 (COVID-19) in Wuhan, China. Clin Infect Dis. 2020;71(15):762-8. doi: 10.1093/cid/ciaa248
  6. Rothan HA, Byrareddy SN. The epidemiology and pathogenesis of coronavirus disease (COVID-19) outbreak. J Autoimmun. 2020;109:102433. doi: 10.1016/j.jaut.2020.102433
  7. Barnes BJ, Adrover JM, Baxter-Stoltzfus A, et al. Targeting potential drivers of COVID-19: Neutrophil extracellular traps. J Exp Med. 2020;217(6):e20200652. doi: 10.1084/jem.20200652
  8. Leppkes M, Knopf J, Naschberger E, et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 2020;58:102925. doi: 10.1016/j.ebiom.2020.102925
  9. Quinti I, Mortari EP, Fernandez Salinas A, et al. IgA Antibodies and IgA Deficiency in SARS-CoV-2 Infection. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:655896. doi: 10.3389/fcimb.2021.655896
  10. Demers-Mathieu V, DaPra C, Mathijssen GB, Medo E. Previous viral symptoms and individual mothers influenced the leveled duration of human milk antibodies cross-reactive to S1 and S2 subunits from SARS-CoV-2, HCoV-229E, and HCoV-OC43. J Perinatol. 2021;41(5):952-60. doi: 10.1038/s41372-021-01001-0
  11. Varadhachary A, Chatterjee D, Garza J, et al. Salivary anti-SARS-CoV-2 IgA as an accessible biomarker of mucosal immunity against COVID-19. medRxiv. 2020;2020.08.07.20170258. doi: 10.1101/2020.08.07.20170258

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. Fig. 1. Comparative characteristics of phagocytic activity of granulocytes in the blood.

Download (66KB)
2. Fig. 2. Comparative characteristics of the phagocytic activity of monocytes in the blood.

Download (67KB)
3. Fig. 3. Comparative characteristics of phagocytic activity of monocytes in nasal scraping.

Download (67KB)
4. Fig. 4. Comparative characteristics of the phagocytic activity of granulocytes in nasal scrapings.

Download (75KB)
5. Fig. 5. Comparative characteristics of the phagocytic activity of monocytes in pharyngeal scraping.

Download (68KB)
6. Fig. 6. Comparative characteristics of phagocytic activity of granulocytes in pharyngeal scraping.

Download (66KB)
7. Fig. 7. Comparative characteristics of the sIgA level in nasal scraping in the test group.

Download (64KB)
8. Fig. 8. Comparative characteristics of sIgA in pharyngeal scraping in the test group.

Download (66KB)

Copyright (c) 2022 Svitich O.A., Baranova I.A., Kryukova N.O., Poddubikov A.V., Vinnitskaya A.B., Abramova N.D., Zakharova V.V., Shogenova L.V., Kostinov M.P., Chuchalin A.G.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.
 

Address of the Editorial Office:

  • Novij Zykovskij proezd, 3, 40, Moscow, 125167

Correspondence address:

  • Alabyan Street, 13/1, Moscow, 127055, Russian Federation

Managing Editor:

  • Tel.: +7 (926) 905-41-26
  • E-mail: e.gorbacheva@ter-arkhiv.ru

 

© 2018-2021 "Consilium Medicum" Publishing house


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies