Study of urinary markers of different podocytopathies by proteomic analysis

Full Text

Список сокращений

МН – мембранозная нефропатия

СКФ – скорость клубочковой фильтрации

СР – стероид-резистентный

СРНС – стероид-резистентный нефротический синдром

ФСГС – фокальный сегментарный гломерулосклероз

ЭЦМ – экстрацеллюлярный матрикс

Введение

Фокальный сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) и мембранозная нефропатия (МН) относятся к заболеваниям с первичным повреждением подоцитов, на первый план в клинической картине которых выходят протеинурия и нефротический синдром [1, 2]. В последние годы отмечается тенденция к росту заболеваемости ФСГС, которая приближается к диабетической нефропатии [3]. Доля терминальной стадии хронической болезни почек при ФСГС увеличилась в 11 раз – с 0,2 до 2,3% за 21-летний период. Частота терминальной ХБП при МН также остается высокой [4].

Поиск специфических маркеров среди белков и пептидов мочи в целом является новым перспективным направлением в связи с высокой информативностью и стабильностью мочи как объекта анализа. Кроме того, протеом мочи может отражать активность различных патологических механизмов развития заболевания почек, использоваться для поиска биомаркеров и дифференциальной диагностики заболеваний почек [5]. Опубликованы единичные исследования по протеомике мочи у больных подоцитопатиями, однако эти исследования включают небольшое число наблюдений [6, 7].

Цель исследования – оценить протеомный профиль мочи у больных с различными вариантами течения ФСГС в сравнении с МН для определения возможных биомаркеров для дифференциальной диагностики этих заболеваний.

Материалы и методы

Клиническая характеристика обследованных пациентов

Пациенты с диагнозом подоцитопатии (n=41) включены в исследование, 27 мужчин и 14 женщин в возрасте от 19 до 75 лет, медиана возраста 51 (35; 60) год. У 28 пациентов установлен морфологический вариант ФСГС. В группе ФСГС 14 пациентов имели стероид-резистентный (СР) нефротический синдром (СРНС) и 9 пациентов – стероид-чувствительный нефротический синдром. В группу сравнения вошли 13 пациентов с МН. Нарушение функции почек (расчетная скорость клубочковой фильтрации – СКФ CKD-EPI<60 мл/мин/1,73 м²) отмечено у 17 пациентов, сохранная функция почек – у 24 пациентов. Характеристика обследованных пациентов представлена в табл. 1. В таблице представлена медиана [25 и 75-й квартиль].

 

Таблица 1. Клиническая характеристика больных с ФСГС и МН Table 1. Clinical characteristics of patients with focal segmental glomerulosclerosis and membranous nephropathy
Показатели	ФCГС	МН
n	28	13
Возраст, лет	43 (27,0; 58,5)	54,0 (51,0; 63,0)
Пол (мужской), абс. (%)	17 (60,7)	10 (76,9)
Протеинурия, г/сут	3,65 (2,5; 5,0)	3,2 (2,0; 3,9)
Нефротический синдром, абс. (%)	19 (67,9)	8 (61,5)
Альбумин сыворотки, г/л	26,7 (20,65; 34,1)	28,0 (21,3; 32,7)
Креатинин, мкмоль/л	116,4 (78,00; 155,18)	93,7 (80,1; 117,3)
Число больных с СКФ <60 мл/мин/1,73 м2, абс. (%)	13 (46,4)	4 (30,8)
Терапия, %:
глюкокортикостероиды	78,6	46,2
циклоспорин	60,7	23,1
циклофосфамид	57,1	38,5
микофенолата мофетил	25	7,7
Стероид-резистентность, %	50	–
Резистентность к другим иммуносупрессивным препаратам, %	21,4	15,4

 

Таргетная хромато-масс-спектрометрия в режиме мониторинга множественных реакций с использованием синтетических изотопно-меченых пептидных стандартов

Анализ смеси триптических пептидов образцов мочи проводился методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии в режиме мониторинга множественных реакций (LC/MRM-MS) с использованием синтетических изотопно-меченых пептидных стандартов (SIS). Высокоэффективная жидкостная хроматография (ExionLC™ UHPLC system, ThermoFisher Scientific, Walhalm, США). Тройной квадрупольный масс-спектрометр SCIEX QTRAP 6500+ (SCIEX, Toronto, Канада), метод ионизации пептидов – электроспрей (ESI). Полученные данные проанализированы с помощью программного обеспечения PEAKS XPro, SPSS Statistics 21. Для сравнения количественных показателей из двух групп применяли непараметрический критерий Манна–Уитни.

Результаты

Метод таргетной хромато-масс-спектрометрии мочи продемонстрировал достоверные различия в подгруппах больных с ФСГС со стероид-чувствительным нефротическим синдромом и СРНС по протеомному профилю. Выделены отдельные белки, повышение концентрации которых в моче отражает различные механизмы почечного заболевания. Достоверно более высокие концентрации в моче кислого α-1-гликопротеина (орозомукоида), аполипопротеина А-IV, кадгерина-13, гелсолина, гемопексина и витронектина отражают повреждение подоцитов и гломерулярного фильтра у больных со СР ФСГС (табл. 2).

 

Таблица 2. Белки, дифференцирующие ФСГС, МН Table 2. Proteins differentiating focal segmental glomerulosclerosis and membranous nephropathy
Белок	1. ФСГС	1a. СЧ ФСГС	1b. СР ФСГС	2. МН	p
α-1-кислый гликопротеин	2606,85 [1613, 60; 4039, 23]	2087,60 [1545, 20; 3599, 20]	3275,55 [2354, 48; 4253, 88]	1464,70 [993, 26; 2309, 10]	1 vs 2: p=0,008 1b vs 2: p=0,003
α-2-HS-гликопротеин	6,80 [2, 03; 19, 56]	2,03 [0, 93; 3, 36]	15,80 [8, 82; 31, 71]	2,45 [0, 96; 19, 91]	1a vs 1b: p=0,013
Аполипопротеин A-IV	8,75 [0, 83; 17, 56]	0,59 [0, 18; 1, 72]	12,86 [8, 29; 21, 00]	13,70 [0, 71; 17, 26]	1a vs 1b: p=0,006
β-Аланин-гистидин дипептидаза	0,16 [0, 10; 0, 31]	0,22 [0, 15; 0, 38]	0,12 [0, 10; 0, 27]	0,06 [0, 06; 0, 07]	1 vs 2: p=0,002 1b vs 2: p=0,006
Кадгерин-13	0,48 [0, 37; 0, 72]	0,62 [0, 40; 0, 79]	0,44 [0, 40; 0, 62]	0,23 [0, 14; 0, 42]	1 vs 2: p=0,011 1a vs 1b: p=0,025
Кластерин	58,59 [20, 04; 122, 80]	25,09 [19, 45; 38, 67]	109,11 [87, 17; 253, 74]	18,25 [11, 19; 114, 05]	1b vs 2: p=0,033 1а vs 1b: p=0,002
Гелсолин	5,06 [2, 05; 8, 45]	2,71 [1, 97; 4, 65]	6,56 [4, 99; 10, 79]	3,22 [1, 94; 9, 88]	1a vs 1b: p=0,023
Глутатион пероксидаза 3	0,17 [0, 04; 0, 30]	0,04 [0, 02; 0, 10]	0,28 [0, 17; 0, 42]	0,04 [0, 03; 0, 14]	1b vs 2: p=0,011 1a vs 1b: p=0,006
Гемопексин	104,14 [14, 59; 257, 62]	14,72 [8, 16; 31, 12]	237,13 [165, 81; 306, 12]	22,24 [12, 31; 265, 23]	1a vs 1b: p=0,011
Кининоген-1	327,33 [179, 07; 565, 15]	190,52 [171, 01; 283, 27]	508,50 [380, 95; 791, 45]	104,76 [83, 71; 573, 72]	1 vs 2: p=0,058 1b vs 2: p=0,025 1a vs 1b: p=0,011
Люмикан	2,36 [0, 46; 4, 72]	0,30 [0, 23; 0, 57]	3,89 [3, 26; 5, 31]	0,53 [0, 29; 6, 16]	1a vs 1b: p=0,010
Нейрофилин-2	9,33 [5, 59; 21, 44]	7,50 [5, 86; 9, 43]	16,83 [8, 72; 54, 57]	4,14 [3, 35; 13, 15]	1 vs 2: p=0,058 1b vs 2: p=0,014 1a vs 1b: p=0,039
Остеопонтин	0,70 [0, 49; 1, 18]	0,58 [0, 53; 2, 05]	0,93 [0, 60; 1, 28]	0,39 [0, 29; 0, 69]	1b vs 2: p=0,048
Ретинол-связываюший белок 4	22,36 [4, 79; 90, 33]	5,30 [2, 65; 9, 41]	86,67 [47, 22; 128, 50]	2,50 [1, 46; 76, 64]	1b vs 2: p=0,048 1a vs 1b: p=0,003
Тенасцин X	2,06 [1, 05; 2, 80]	1,27 [0, 92; 2, 82]	2,65 [1, 58; 3, 23]	0,86 [0, 68; 1, 43]	1 vs 2: p=0,014 1b vs 2: p=0,003
Витамин-D-связывающий белок	39,32 [9, 13; 141, 64]	9,46 [1, 64; 16, 19]	131,77 [60, 59; 218, 34]	16,65 [9, 89; 73, 32]	1b vs 2: p=0,048 1a vs 1b: p=0,001
Витронектин	17,40 [4, 90; 76, 37]	5,69 [1, 83; 8, 91]	68,20 [39, 31; 123, 84]	3,09 [2, 71; 64, 54]	1b vs 2: p=0,068
Примечание. Значения медиан и интерквартильный размах концентраций белков выражены в относительных единицах; СЧ ФСГС – стероид-чувствительный ФСГС.

 

Подгруппа СР ФСГС характеризуется более высоким уровнем белков, которые экскретируются с мочой при тубуло-интерстициальном повреждении и активации накопления компонентов экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ). Так, в этой подгруппе СР ФСГС отмечены достоверно более высокие показатели ретинол- и витамин-D- связывающих белков, кининогена-1, а также компонентов, участвующих в накоплении фиброза, – люмикана, тенасцина и нейрофилина-2. Белками, отражающими окислительный стресс и активацию воспаления, являются кластерин, глутатион-пероксидаза и карнозиназа, концентрация которых достоверно выше в группе СР ФСГС (см. табл. 2).

При сравнении групп ФСГС с МН различия выявлены по следующим белкам мочи: β-аланин-гистидин дипептидазе (карнозиназе), кислому α-1-гликопротеину (орозомукоиду), кадгерину-13, тенасцину X, остеопонтину, цинк-α-2-гликопротеину, уровень которых оказался выше при ФСГС независимо от характера течения болезни (см. табл. 2).

Обсуждение

Основные различия по спектру белков в нашем исследовании выявлены у больных с ФСГС при разделении на подгруппы стероид-чувствительного и СРНС. У больных со СРНС отмечены наиболее высокие концентрации в моче белков, которые отражают тяжесть повреждения подоцитов или процессов, способствующих отслоению подоцитов от гломерулярной базальной мембраны и отражающих повреждение гломерулярного фильтра. В частности, кислый α-1-гликопротеин (орозомукоид) – белок, который по молекулярной массе и размеру (43 кДа) меньше, чем альбумин, является ранним маркером гломерулярного повреждения у больных сахарным диабетом и ожирением, появляется в моче до развития альбуминурии [8, 9]. S. Kalantari и соавт. также указывают на то, что выявление высокой концентрации этого белка в моче может быть использовано для дифференциальной диагностики СР ФСГС [10]. Повреждение гломерулярного фильтра сопровождается повышением концентрации в моче липопротеидов, например аполипопротеина А-IV [11]. Повышается экскреция с мочой кадгерина-13 – белка, регулирующего адгезию подоцитов к гломерулярной базальной мембране, и гелсолина, который обладает потенциальным повреждающим воздействием на актиновый цитоскелет подоцитов [12, 13]. Гликопротеин гемопексин стоит в ряду белков- кандидатов на факторы проницаемости, так как замечено, что добавление этого белка к культуре подоцитов вызывает их структурную перестройку и повышение подвижности [14–16]. Мы также установили значительное повышение уровня витронектина в моче больных со СР ФСГС. Известно, что витронектин формирует комплекс с интегринами на поверхности подоцита и повышение его экспрессии вызывает нарушение связывания подоцита с базальной мембраной [17], что может являться причиной массивного отслоения подоцитов при ФСГС.

Важным результатом является то, что у больных со СР ФСГС процессы тубуло-интерстициального повреждения и накопления ЭЦМ максимально активированы уже в дебюте заболевания. Об этом свидетельствует высокое содержание в моче ретинол- и витамин-D-связывающих белков и кининогена-1 [18–20]. Ретинол-связывающий белок и кининоген-1 являются маркерами повреждения клеток тубулярного эпителия и, по данным других авторов, факторами, ассоциированными с отсутствием ответа на стероиды [21, 22]. Об интенсивности накопления ЭЦМ свидетельствует выделение с мочой больных с ФСГС люмикана, тенасцина X и нейрофилина-2 [23–25].

Группа больных с ФСГС, в отличие от группы сравнения МН, характеризовалась более высокими показателями орозомукоида и кадгерина-13 в моче, отражающих тяжесть повреждения гломерулярного фильтра и подоцитов [8, 9, 12], тенасцина X и остеопонтина – показателей тубулярного повреждения и интерстициального фиброза [26], а также β-аланин-гистидин дипептидазы (карнозиназы) – фермента, который предотвращает апоптоз подоцитов [27].

Заключение

Таким образом, протеомный профиль мочи больных с ФСГС отражает активные процессы повреждения подоцитов, тубулярных клеток и накопления интерстициального фиброза. У больных со стероид-резистентным ФСГС особенности изменения спектра белков мочи свидетельствуют о наиболее тяжелом повреждении почки уже в дебюте заболевания.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Все авторы в равной степени участвовали в подготовке публикации: разработка концепции статьи, получение и анализ фактических данных, написание и редактирование текста статьи, проверка и утверждение текста статьи.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Информированное согласие на публикацию. Пациенты подписали форму добровольного информированного согласия на публикацию медицинской информации.

Consent for publication. Written consent was obtained from the patients for publication of relevant medical information.

Источник финансирования. Данное исследование поддержано грантом Российского научного фонда №21-74-20173.

Funding source. The research was supported by a grant from the Russian Scientific Fund 21-74-20173.

About the authors

Anatoliy A. Vinogradov

Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: anatoliy_vinogradov@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-7529-0215

аспирант каф. внутренних болезней фак-та фундаментальной медицины ФГБОУ ВО «МГУ им. М.В. Ломоносова»

Russian Federation, Moscow

Natalia V. Chebotareva

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: anatoliy_vinogradov@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-2128-8560

д-р мед. наук, проф. каф. внутренних, профессиональных болезней и ревматологии ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет)

Russian Federation, Moscow

Anna E. Bugrova

Emanuel Institute for Biochemical Physics

Email: anatoliy_vinogradov@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-4568-7507

канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. нейрохимии ФГБУН «ИБХФ им. Н.М. Эмануэля»

Russian Federation, Moscow

Alexander G. Brzhozovskiy

Skolkovo Institute of Science and Technology

Email: anatoliy_vinogradov@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-1128-1795

канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. масс-спектрометрии и омиксных технологий Центра наук о жизни АНОО ВО «Сколтех»

Russian Federation, Moscow

Tatiana N. Krasnova

Lomonosov Moscow State University; Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: anatoliy_vinogradov@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-7647-3942

канд. мед. наук, зав. каф. внутренних болезней фак-та фундаментальной медицины ФГБОУ ВО «МГУ им. М.В. Ломоносова», доц. каф. внутренних болезней ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Karina Z. Nasibullina

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: anatoliy_vinogradov@list.ru

студентка ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет)

Russian Federation, Moscow

Alexey S. Kononikhin

Skolkovo Institute of Science and Technology

Email: anatoliy_vinogradov@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-2238-3458

канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр. лаб. масс-спектрометрии и омиксных технологий Центра наук о жизни АНОО ВО «Сколтех»

Russian Federation, Moscow

Sergey V. Moiseev

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: anatoliy_vinogradov@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-7232-4640

чл.-кор. РАН, д-р мед. наук, проф., зав. каф. внутренних, профессиональных болезней и ревматологии, дир. Клиники ревматологии, нефрологии и профпатологии им. Е.М. Тареева Университетской клинической больницы №3 ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files