Fibrinolytics: from the thrombolysis to the processes of blood vessels growth and remodeling, neurogenesis, carcinogenesis and fibrosis

Full Text

ГМК - гладкомышечные клетки ММП - матриксные металлопротеиназы МЭП - мезенхимально-эпителиальный переход ЭПМ - эпителиально-мезенхимальный переход FGF-β - фактор роста фибробластов-бета HGF - фактор роста гепатоцитов TGF-ß -трансформирующий фактор роста-бета tPA - тканевый активатор плазминогена uPA - активатор плазминогена урокиназного типа или урокиназа uPAR - рецептор урокиназы VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста Одно из самых выдающихся достижений отечественной кардиологии - это применение фибринолитиков для лечения инфаркта миокарда. Эти исследования совсем еще молодой Евгений Иванович проводил вместе с физиологом из МГУ им. М.В. Ломоносова Галиной Васильевной Андреенко. В 70-х годах прошлого века они создали первый советский препарат, разрушающий тромбы - фибринолизин, который успешно прошел испытания в Институте кардиологии [1, 2]. Е.И. Чазов вместе со своими сотрудниками Л.С. Матвеевой, А.В. Мазаевым и М.Я. Рудой впервые в мире показали возможность растворения тромба при инфаркте миокарда путем внутрикоронарного введения фибринолизина [3]. Впоследствии тромболитическая терапия спасла тысячи жизней, снизив летальность от инфаркта миокарда на 15-20%. В Кардиоцентре под руководством Е.И. Чазова были созданы отечественные фибринолитики - пуролаза и гемаза - модифицированная рекомбинантная урокиназа [4, 5]. Классическая роль фибринолитической системы - это препятствование образованию тромбов в сосудах. Она реализуется за счет активаторов плазминогена тканевого и урокиназного типов (урокиназы), превращающих его в активную протеазу плазмин, который расщепляет фибрин и препятствует образованию тромбов [6] (рис. 1). Однако оказалось, что эта система выполняет и другую функцию - способствует ремоделированию тканей при различных физиологических и патологических процессах. Ключевым фактором тканевого ремоделирования является направленная миграция клеток и перестройка внеклеточного матрикса. Этим свойством обладает урокиназа, которое отсутствует у других протеаз, так как только у урокиназы есть рецептор, обладающий свободной подвижностью в мембране клетки [7] (рис. 2, А, см. на цветной вклейке). При движении клетки он способен перемещаться на передний край и, связывая урокиназу, локализовать протеолиз перед ползущей клеткой (рис. 2, Б, В, см. на цветной вклейке). Урокиназу, ее рецептор и ингибитор часто называют урокиназной системой, подчеркивая ее самостоятельное значение в процессах тканевого ремоделирования. Практически все компоненты системы фибринолиза экспрессируются клетками сосудистой стенки, при этом урокиназа и ее рецептор экспрессируются всеми клетками сосуда - эндотелиальными, гладкомышечными, фибробластами, а также клетками воспаления, мигрирующими в сосудистую стенку из крови [8]. В начале 90-х годов прошлого столетия была крайне актуальной проблема рестенозов после ангиопластики. И сегодня, несмотря на существенный прогресс в технике вмешательств, позволивший повысить эффективность процедур и снизить число осложнений, у части пациентов (до 11%) через несколько месяцев после эндоваскулярных процедур развивается повторный стеноз артерий или рестеноз, а по некоторым данным, частота рестенозов, например, бедренной артерии достигает 38% [9, 10]. В лаборатории молекулярной эндокринологии Кардиоцентра мы исследовали экспрессию компонентов урокиназной системы в стенке сонной артерии крысы после экспериментальной баллонной ангиопластики. Оказалось, что экспрессия урокиназы и ее рецептора (как мРНК, так и белков) значительно возрастает уже в первые часы после баллонирования, причем увеличение белков регистрируется с помощью иммуногистохимии на клетках формирующейся неоинтимы, медии и адвентиции, коррелируя с увеличением процессов миграции и пролиферации этих клеток [11]. Подавление урокиназы с помощью нейтрализующих антител или введение протеолитически неактивного фермента, конкурирующего c эндогенной урокиназой за связывание с рецептором, предотвращало рост неоинтимы [12]. Это указывает на ключевое значение урокиназы и ее рецептора в сосудистой стенке в развитии стеноза артерии после повреждения. Нанесение урокиназы на поврежденную сонную артерию в плюроническом геле, приводящее к увеличению экзогенной урокиназы в стенке сосуда, вызывало ускоренный рост как неоинтимы, так и медии, и адвентиции, что приводило к сужению просвета артерии [11]. Помимо того, урокиназа стимулировала пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток (ГМК) сосуда, а также трансдифференцировку фибробластов в миофибробласты. Последнее было впервые показано учеными Кардиоцентра, что представлялось сенсационной находкой для специалистов по сосудистой стенке [13]. Два активатора плазминогена, урокиназа и тканевый активатор плазминогена (tPA), имеют схожую функцию в регуляции фибринолиза, но их действие на сосудистую стенку оказалось различным. Так, если урокиназа способствует не только росту неоинтимы в поврежденной артерии, но и сужению сосуда - констриктивному ремоделированию за счет формирования утолщенной ригидной адвентиции, то tPA, напротив, вызывает уменьшение роста неоинтимы и расширение сосуда, что способствует положительному ремоделированию [14]. С помощью метода транскрипционных матриц мы показали, что при воздействии урокиназы на поврежденный сосуд в нем повышается экспрессия группы провоспалительных генов, а также генов, регулирующих митохондриальное дыхание и оксидативный стресс [15]. Тканевый активатор плазминогена, напротив, повышает экспрессию генов, вовлеченных в регуляцию тонуса сосудов, а также генов, участвующих в функционировании нервной ткани [16]. Следовательно, активаторы плазминогена могут оказывать влияние на процессы транскрипции и трансляции генов. Так, урокиназа стимулирует пролиферацию сосудистых ГМК через индукцию оксидаз Nox1 и Nox4, которые увеличивают продукцию активных форм кислорода [17] (рис. 3, см. на цветной вклейке). Влияние урокиназы на экспрессию генов может осуществляться не только через активацию внутриклеточных сигнальных каскадов, но и посредством транслокации урокиназы в ядро клетки [18]. Мы показали, что транслоцированная в ядро урокиназа способна связываться с несколькими транскрипционными факторами и, таким образом, регулировать экспрессию генов, в частности экспрессию гладкомышечного альфа-актина [18, 19]. Это способствует изменению фенотипа фибробластов на сократительный фенотип миофибробластов, что ранее показано нами на модели баллонирования сонной артерии крысы при нанесении на нее урокиназы [13] (рис. 3, см. на цветной вклейке). При ишемии урокиназа активируется, вследствие чего происходит разрушение матрикса, а значит, и высвобождение ангиогенных факторов роста, приводящее к стимуляции ангиогенеза [20]. Формирование новых сосудистых отростков инициируется сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF), экспрессия которого возрастает в зоне ишемии. Взаимодействуя со своим рецептором на эндотелиальных клетках, он индуцирует увеличение сосудистой проницаемости и экспрессию урокиназы и ее рецептора, протеолитическая активность которой абсолютно необходима для начальных событий в ангиогенезе: разрушения базальной мембраны и миграции эндотелиальных клеток в интерстициальный матрикс [21]. Мигрирующие клетки должны быть морфологически поляризованы, чтобы сфокусировать протеолитическую активность на переднем крае для деградации матрикса по пути движения клетки. Более того, именно протеолитичеcкая активность, запускаемая урокиназой, способствует активации важнейших ангиогенных факторов, таких как VEGF, HGF и трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β), и высвобождению ряда факторов, связанных с матриксом, например, фактор роста фибробластов-бета (FGF-β) [22] (см. рис. 2 на цветной вклейке). Для проверки возможности стимуляции процессов ангиогенеза в ишемизированных тканях мы использовали экспрессию урокиназы с помощью плазмидного вектора. Было показано, что экспрессия гена урокиназы стимулирует васкуляризацию и восстановление кровоснабжения ишемизированных скелетных мышц мыши, не вызывая при этом развития отеков конечности, в отличие от VEGF - ангиогенного фактора, наиболее часто использующегося для стимуляции ангиогенеза, но обладающего этим побочным действием [23]. На модели инфаркта миокарда введение гена урокиназы также эффективно стимулировало ангиоартериогенез в миокарде и уменьшало размер инфаркта. Сегодня генотерапевтическому препарату на основе урокиназы (Юпикор) осталось завершить клинические испытания. Получены свидетельства того, что урокиназная система может регулировать не только скорость роста сосудов и нервов, но и определять траекторию их роста и участвовать в ветвлении сосудов и нервов, т.е., по сути, выступать в роли так называемой навигационной системы [24]. Мы обнаружили экспрессию рецептора урокиназы на конусе роста аксонов и на эндотелиальных клетках растущих сосудов [24, 25]. Такая экспрессия присуща многим навигационным рецепторам - эфринам, семафоринам, Notch белкам и другим классическим навигационным рецепторам [26]. Рецептор урокиназы, экспрессируемый на лидирующих эндотелиальных клетках (так называемых тип-клетках) растущих сосудов, взаимодействуя с урокиназой, может не только ремоделировать матрикс, облегчая миграцию клеток эндотелия, но и опосредовать внутриклеточную сигнализацию, регулирующую направление миграции этих клеток [27]. Введение антител к рецептору урокиназы, которые нарушают его связывание с урокиназой, изменяет миграцию сосудистых клеток и формирование капилляроподобных структур, усиливая их ветвление, а также изменяет фенотип ГМК с миграторного на покоящийся [25]. Блокирование урокиназной системы в растущих сосудах может отражать утрату способности эндотелиальных клеток распознавать навигационные сигналы микроокружения. Аналогичные процессы обнаружены и в нейронах, где нами впервые продемонстрированы навигационные свойства урокиназного рецептора. При блокировании рецептора урокиназы происходит нарушение навигации аксона - траектория роста аксона изменяется и усиливается его ветвление [25]. Навигационные свойства рецептора урокиназы подтверждены на другой модели - линейных клетках нейробластомы, которые являются широко используемой экспериментальной моделью для исследования процессов роста аксонов. Точно так же, как и на модели спинальных ганглиев, мы увидели, что при блокировании рецептора урокиназы нарушается рост нейритов, выражающийся в усилении их ветвления. Таким образом, нами обнаружено участие рецептора урокиназы в направленном росте аксонов и выявлено, что он может играть важную роль в формировании нейронных сетей при эмбриогенезе и созревании структур головного мозга [28]. Изменяя экспрессию урокиназного рецептора в эмбрионах мыши на ранних стадиях эмбрионального развития in vivo, на сроках, важных для формирования коры головного мозга (Е14), мы обнаружили, что гиперэкспрессирующие рецептор урокиназы нейроны лучше мигрируют в верхние слои коры по сравнению с контрольными нейронами [наши не опубликованные данные]. Это те области, которые у человека и млекопитающих отвечают за когнитивные функции и высшую нервную деятельность. Возможно, именно поэтому у мышей, нокаутных по гену рецептора урокиназы, развиваются тяжелые эпилепсии, связанные с дефицитом тормозных интернейронов в коре головного мозга, а также девиации в поведении, характерные для аутизма и шизофрении у людей [29]. Об участии рецептора урокиназы в развитии аутизма и когнитивных расстройств у людей свидетельствуют данные о высокой частоте встречаемости полиморфизма гена uPAR (Т-аллеля rs344781) у больных с расстройствами аутистического спектра и речевыми нарушениями [30]. Оказалось, что урокиназная система как важный участник фибринолиза нужна не только для ремоделирования внеклеточного матрикса, облегчения роста сосудов и нервов при регенерации, но и для миграции клеток, в том числе стволовых, в область травмы, а также для изменения фенотипа уже дифференцированных клеток, так называемой трансдифференцировке, более известной как эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) [31]. Эпителиальные клетки находятся в виде многоклеточного пласта за счет прочных межклеточных контактов. Оказалось, что эти же клетки могут выходить из пласта, разрывая контакты, и превращаться в одиночные мигрирующие клетки, обладающие мезенхимальным фенотипом - т.е. имеющие сократительные белки и черты стволовости. Данные процессы происходят при повреждении тканей и играют важную роль при репарации и регенерации. При завершении процессов регенерации происходит обратный процесс - мезенхимально-эпителиальный переход (МЭП), в результате которого экспрессия маркеров мезенхимального фенотипа снижается, и клетки восстанавливают свои эпителиальные свойства. Нами впервые было показано, что экспрессия рецептора урокиназы удерживает клетки в эпителиальном фенотипе, а нокаут по рецептору активирует ЭМП. Используя технологию редактирования генома CRISPR/Cas9, мы нокаутировали uPAR в клетках нейробластомы Neuro2a и обнаружили увеличение их миграции, снижение экспрессии эпителиальных маркеров и усиление экспрессии мезенхимальных маркеров. Превращение эпителиальных клеток в мезенхимальные способствует быстрому заживлению раны. Если этот процесс завершается превращением мезенхимальных клеток в эпителиальные, то заживление происходит без фиброза [31]. Если же этот процесс нарушен, то мезенхимальные клетки формируют рубец, превращаются в фибробласты и секретируют внеклеточный матрикс. В том случае, если рана не заживает, не покрывается эпителиальным слоем или же фиброзной тканью, может развиться опухоль [32]. Хроническая рана описывается как образование, в которой постоянно идет коагуляция, фиброз, воспаление, реорганизация внеклеточного матрикса и ЭМП из клеток профиброзных в прораковые. Очень часто это завершается онкологическим перерождением (рис. 4). ЭМП при раке сопряжен с активацией процессов миграции опухолевых клеток, что является причиной их инвазии и появлением дормантных метастазов - крайне неблагоприятного процесса, при котором опухолевые клетки проявляют стволовость и множественную устойчивость к проводимой химиотерапии [33]. Наши данные, а также данные других авторов свидетельствуют о том, что урокиназная система и повышенная ее экспрессия в клетках опухоли являются неблагоприятными прогностическими маркерами канцерогенеза и метастазирования. Известно, что экспрессия uPA, uPAR и PAI-1 в опухолевых клетках рака кожи повышена. Повышенная экспрессия uPAR также обнаружена в строме базалиомы, окружающей опухолевые клетки [34]. Повышенный уровень uPAR в строме опухоли позволяет предполагать наличие взаимодействия урокиназы с ее рецептором, что способствует пролиферации и инвазии раковых клеток. В ходе этих работ созданы экспериментальные подходы для подавления или блокирования урокиназной системы в опухолях; получены антитела, подавляющие протеолитическую активность урокиназы, блокирующие урокиназный рецептор, а также химические высокоаффинные ингибиторы и РНК олигонуклеотиды для РНК-интерференции. Используя технологию редактирования генома CRISPR/Cas9, созданы генетические конструкции для подавления экспрессии гена uPAR в опухолевых клетках, что приводит к гибели клеток по каспасозависимому пути апоптоза [35, 36]. Заключение Эндогенная урокиназа секретируется в виде неактивного белка всеми клетками сосудистой стенки под действием механического стресса или повреждений и переводится в каталитически активную форму (протеазу) за счет ограниченного протеолиза, который осуществляет плазмин, или в результате связывания со своим рецептором на поверхности сосудистых клеток. Основная функция uPA - осуществлять ограниченный протеолиз плазминогена с превращением его в плазмин и, тем самым, запускать процессы разрушения фибрина и других матриксных белков. Нами показано прямое действие урокиназы на активацию матриксных металлопротеиназ (ММП) 2-го и 9-го типа. Существуют свидетельства, что урокиназа может непосредственно активировать некоторые факторы роста, превращая их из проангиогенных в ангиогенные. На поверхности сосудистых клеток локализован GPI-заякоренный рецептор урокиназы uPAR, который совершает быстрые латеральные движения в липидном бислое. Связывание урокиназы с этим рецептором запускает внутриклеточную сигнализацию, по механизму схожую с той, которая характеризует цитокины (Rho, p38, p42/44, JAK/STAT). В результате этой сигнализации происходит изменение морфологии клеток и их миграция. В мигрирующей клетке uPAR локализован на лидирующем крае и находится в комплексе с интегринами. В результате этого урокиназа, связываясь с рецептором, оказывается на переднем крае клетки и активирует перед движущейся клеткой каскад реакций, запускающих разрушение матриксных белков и освобождающих пространство для перемещения клетки. Не связанная с рецептором урокиназа переносится в ядро клетки с помощью нуклеолина и взаимодействует с факторами транскрипции, что приводит к экспрессии STAT и альфа-актина и перепрограммирует фибробласты в миофибробласты. Кроме того, эндогенная урокиназа вызывает экспрессию Nox1 и Nox4 гладкомышечными клетками сосудов, которые запускают образование свободных радикалов кислорода и оказывают стимулирующее влияние на пролиферацию клеток. Таким образом, нами показано, что урокиназа обладает тремя свойствами: это протеаза, цитокин и транскрипционный фактор. Рецептор урокиназы uPAR имеет ряд самостоятельных функций, участие урокиназы в которых оказывается необязательным, но может модулировать эти свойства. uPAR опосредует траекторию роста сосудов и нервов, а его отсутствие способствует ветвлению этих структур. uPAR поддерживает клетки в эпителиальном фенотипе, а при активации ЭМП uPAR усиливает процессы фиброза. В раковой опухоли экспрессия uPAR и uPA выявляется в разных типах клеток одной и той же ткани, а их взаимодействие приводит к направленному росту опухоли, активируя при этом как инвазию, так и метастазы (рис. 5). Таким образом, помимо участия в процессах фибринолиза, урокиназная система участвует в процессах фенотипической модуляции клеток, морфогенеза органов и тканей и прогрессии раковых опухолей, что делает ее перспективной мишенью для разработки лекарственных средств, воздействующих на эти процессы.

About the authors

V A Tkachuk

National Medical Research Center of Cardiology

Moscow, Russia

Ye V Parfyonova

National Medical Research Center of Cardiology

Moscow, Russia

O S Plekhanova

National Medical Research Center of Cardiology

Moscow, Russia

V V Stepanova

National Medical Research Center of Cardiology

Moscow, Russia

M Yu Menshikov

National Medical Research Center of Cardiology

Moscow, Russia

E V Semina

National Medical Research Center of Cardiology

Email: e-semina@yandex.ru
Moscow, Russia

R Sh Bibilashvili

National Medical Research Center of Cardiology

Moscow, Russia

E I Chazov

National Medical Research Center of Cardiology

Moscow, Russia

References

Supplementary files