Influence of visceral obesity on the secretion of adipokines with epicardial adipocytes in patients with coronary heart disease

Full Text

ВЖТ - висцеральная жировая ткань ВО - висцеральное ожирение ИБС - ишемическая болезнь сердца ИЛ - интерлейкин ИР - инсулинорезистентность КА - коронарная артерия ЛПВП - липопротеиды высокой плотности ЛПНП - липопротеиды низкой плотности ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности ОХС - общий холестерин ПЖТ - подкожная жировая ткань СЖК - свободные жирные кислоты ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания ТГ - триглицериды ФК - функциональный класс ФНО-α - фактор некроза опухоли-α ХС - холестерин ЭЖТ - эпикардиальная жировая ткань FLI - индекс свободного лептина HbА1с - гликированный гемоглобин На сегодняшний день сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) остаются основной причиной утраты трудоспособности, инвалидизации и смертности населения [1]. В 2013 г. ССЗ стали причиной смерти 17,3 млн человек, что превышает показатели 1990 г. на 40,8% [2]. Во многом это увеличение обусловлено общим старением населения, воздействием на организм человека сердечно-сосудистых факторов риска [3]. Одним из таких факторов является ожирение. Накопление общего жира в организме происходит в результате отложения жира в подкожных и висцеральных депо [4]. Висцеральная жировая ткань (ВЖТ) окружает внутренние органы и характеризуется ассоциацией с кардиометаболическими факторами риска, независимо от общей жировой массы [5]. Большинство эктопических жировых отложений продемонстрировали тесную ассоциацию с кардиометаболическими рисками и клиническими проявлениями большинства ССЗ [6]. В ряде клинических исследований обнаружено, что избыток эпикардиального жира сопровождается снижением синтеза адипонектина, гипертрофией миокарда, фиброзом и апоптозом кардиомиоциотов, развитием желудочковых аритмий [7]. В то же время эпикардиальные адипоциты в физиологических условиях выполняют ряд важных для миокарда функций: метаболическую (абсорбируют избыток свободных жирных кислот и выступают в качестве источника энергии в условиях ишемии), термогенную, механическую, а также синтезируют адипонектин и адреномедуллин, обладающие кардиопротективными свойствами [8]. Выяснение метаболических особенностей адипоцитов эпикардиальной жировой ткани (ЭЖТ), локализованной в непосредственной близости к очагу повреждений при ишемической болезни сердца (ИБС), может иметь как теоретическое, так и практическое значение для патофизологии и кардиологии. Целью нашего исследования являлось изучение адипокиново-цитокинового профиля адипоцитов ЭЖТ, подкожной жировой ткани (ПЖТ), сыворотки крови, поиск взаимосвязи с площадью ВЖТ, биохимическими и клиническими характеристиками больных ИБС. Материалы и методы Исследование выполнено на базе ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» (Кемерово) и МБУЗ «Кемеровский кардиологический диспансер». В исследование включено 84 пациента с ИБС (70 мужчин и 14 женщин, в возрасте 61,9 [53, 7; 68, 5] года). Диагноз ИБС установлен согласно критериям Всероссийского научного общества кардиологов (ВНОК) 2007 г. В контрольную группу включены 30 мужчин без ССЗ, средний возраст которых составил 58,42 [52, 2; 71, 1] года. Все пациенты до начала процедур исследования подписали форму информированного согласия, одобренную локальным этическим комитетом. У пациентов верифицировали наличие висцерального ожирения (ВО) путем измерения площади ВЖТ и ПЖТ с помощью мультиспиральной томографии на компьютерном томографе LightspeedVCT-64 (GeneralElectric, США). При ВО площадь ВЖТ должна быть >130 см2, а коэффициент отношения площади висцеральной и подкожной жировой ткани (ВЖТ/ПЖТ) ≥0,4 [9]. Для оценки влияния ВО на адипокиново-цитокиновый профиль адипоцитов ЭЖТ и ПЖТ пациенты разделены на две группы. У пациентов с площадью ВЖТ >130 см2 проводился забор адипоцитов ЭЖТ и ПЖТ с последующим культивированием и оценкой адипокиновой и провосполительной активности. Для поиска взаимосвязи адипокиново-цитокинового профиля адипоцитов ЭЖТ и ПЖТ с площадью ВЖТ, биохимическими и клиническими характеристиками проводили сбор анамнеза, определение показателей углеводного и липидного обменов, адипокинового и провоспалительного статусов в сыворотке крови всех исследуемых групп. Критерии включения: подписанное информированное согласие на комплексное обследование и лечение. Критерии исключения: пациенты моложе 50 и старше 80 лет, наличие в анамнезе сахарного диабета; уровень гликированного гемоглобина (HbA1c) 6,0%; наличие тяжелой сопутствующей патологии: онкологические, инфекционные, психические заболевания, хроническая обструктивная болезнь легких, болезни соединительной ткани, почечная и гепатоцеллюлярная недостаточность. У всех пациентов измеряли массу тела (кг), рост (м), окружность талии (ОТ, см), бедер (ОБ, см), отношение ОТ/ОБ, рассчитывали индекс массы тела (ИМТ, кг/м2). Адипоциты выделяли из подкожного и эпикардиального жира (в количестве 3-5 г) больных с ВО при операции аортокоронарного шунтирования. Образцы ЭЖТ забирали из жировых депо, локализованных преимущественно вокруг правых отделов сердца, а образцы ПЖТ - из подкожной клетчатки нижнего угла средостенной раны. Жировую ткань помещали в сбалансированный солевой раствор Хэнкса (SigmaAldrich, США) с добавлением пенициллина (100 U/L), стрептомицина (100 мг/мл), гентамицина (50 мкг/мл). Выделение изолированных адипоцитов из жировой ткани осуществляли в стерильных условиях в ламинарном шкафу 2-го класса защиты (БОВ-001-АМС МЗМО, Россия) по методике, описанной К.А. Carswell и соавт. [10]. Для этого образцы ЭЖТ и ПЖТ (размером 1-2 мм3) инкубировали 30 мин при температуре 37 °C в растворе коллагеназы (0,5 мг/мл; Invitrogen, США), содержащем 200 нM аденозина (SigmaAldrich, США). Затем добавляли равный объем 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США) в полной культуральной среде М 199 (Gibco, США), содержащей 1% Hepes буфер (Gibco, США), 1% раствор L-глутамина с пенициллином и стрептомицином (Gibco, США), 0,4% амфотерицина-Б (Gibco, США) и глюкозу в конечной концентрации 5 ммоль/л. Далее флотирующие кусочки ферментированной жировой ткани переносили в стерильный фильтр с размером пор 100 мкм (Falcon, США), в условиях мягкого перемешивания промывали полной культуральной средой М 199, объем содержимого пробирки с клетками доводили до 5 мл и центрифугировали 2 мин при 200 g. Изолированные адипоциты помещали в отдельную пробирку, объем содержимого пробирки доводили культуральной средой до 1 мл и проводили подсчет адипоцитов в камере Горяева. Жизнеспособность клеток оценивали согласно методике [11]. В лунку стерильного 24-луночного планшета (Greiner, Германия) вносили адипоциты в количестве 20·105 и доводили объем содержимого лунки до 1 мл культуральной средой. Клетки культивировали в течение 2 сут с заменой среды через 1 сут. Со дна лунок аккуратно забирали среду каждые сутки культивирования для последующего определения адипокинов и цитокинов. Параллельно определяли содержание адипокинов, цитокинов, показатели липидного и углеводного обменов в сыворотке крови больных с ВО и без ВО. Содержание лептина, его растворимого рецептора (SOB-R), адипонектина в ЭЖТ и ПЖТ определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем фирм BioVendor (США) и eBioscience (Австрия). Концентрацию цитокинов - интерлейкина-1β (ИЛ-1β), ИЛ-6, ИЛ-10, фактора некроза опухоли-α (ФНО-α) - проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) диагностическими наборами фирмы Monobind (США). Концентрацию общего холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ), липопротеидов очень низкой, низкой и высокой плотности (ХС ЛПОНП, ХС ЛПНП, ХС ЛПВП), Апо-А1 и Апо-В, содержание свободных жирных кислот (СЖК), уровня глюкозы и НbА1с в сыворотке измеряли ферментативным методом по конечной точке на автоматическом биохимическом анализаторе Konelab 30i фирмы Thermo Fisher Sientific (Финляндия). Уровень инсулина и С-пептида в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы Monobind Insulin ELISA (США). Чувствительность тканей к инсулину оценивали с помощью индекса чувствительности к инсулину НОМА как отношение концентраций инсулина и глюкозы натощак по формуле (инсулин × глюкоза)/22,5. Инсулинорезистентность (ИР) фиксировали при значениях индекса HOMA-R >2,77 [12]. Чувствительность тканей к лептину оценивали по индексу свободного лептина (FLI) - отношению концентрации лептина (нг/мл) к концентрации растворимого рецептора к лептину (нг/мл). Лептинорезистентность фиксировали при FLI >25 по показателям сыворотки крови [13]. В первую группу вошли 54 пациента с ВО, во вторую группу - 30 человек без ВО (табл. 1). В контрольную группу включены 30 мужчин без ССЗ, по среднему возрасту - 58,42 [52, 2; 71, 1] года - сопоставимые с пациентами, вошедшими в исследование (р=0,64). По данным антропометрических обследований, среди здоровых добровольцев лица с избыточной массой тела и ожирением отсутствовали, ОТ соответствовал гендерной норме (<94 см), отношение ОТ/ОБ <1,0. По результатам антропометрии ИМТ у пациентов с ВО статистически значимо ниже, чем у пациентов без ВО (см. табл. 1). Доля больных с нормальной массой тела среди пациентов с ВО составила 39%, а среди пациентов без ВО - только 20% (р=0,02). Избыточная масса регистрировалась у 37,0 и 47% соответственно среди больных с ВО и без ВО. Диагноз ожирение верифицирован у 33% пациентов без ВО (против 24% у больных с ВО; р=0,03). Для пациентов с ВО характерно перераспределение жировой ткани по андроидному типу. Так, индекс ОТ/ОБ >1,0 регистрировался у всех пациентов с ВО, тогда как при отсутствии ВО - только у трети пациентов (р<0,05). Пациенты исследуемых групп сопоставимы по возрасту, наличию факторов риска ССЗ, таких как артериальная гипертензия, курение, стенокардия, дислипопротеинемия, застойная хроническая сердечная недостаточность и инфаркт миокарда в анамнезе (р>0,05). Пациенты, включенные в исследование, получали стандартную антиангинальную и антиагрегационную терапию. Статистическую обработку результатов осуществляли c использованием пакета прикладных программ Statistica 6.1. Для оценки вида распределения использовали тест Колмогорова-Смирнова. Для сравнения независимых групп с распределением признаков, отличных от нормального, использовали U-критерий Манна-Уитни. Для исследования зависимостей между переменными использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Результаты представлены в виде медианы (Mе) и значений 25-го и 75-го перцентилей. Статистически значимыми считали различия при p<0,05. Результаты Результаты определения концентрации адипокинов и цитокинов в культуре адипоцитов ЭЖТ и ПЖТ у больных с ВО и ИБС представлены в табл. 2. Установлено, что содержание лептина в культуре адипоцитов ЭЖТ существенно выше; на 1-е сутки инкубации оно составило 140%, а на 2-е сутки - 180% по сравнению с адипоцитами ПЖТ. Концентрация SOB-R в эпикардиальных адипоцитах возрастала еще больше, в 2,3 раза, по сравнению с ПЖТ. При этом FLI в адипоцитах ПЖТ на 1-е и 2-е сутки оказался выше соответственно в 1,7 и 1,3 раза по сравнению с эпикардиальными адипоцитами. Более высокий коэффициент свободного лептина, т. е. увеличение его концентрации при низком SOB-R, является подтверждением наличия лептинорезистентности в адипоцитах ПЖТ, по сравнению с эпикардиальными адипоцитами. В отличие от увеличения уровня лептина, содержание протективного адипонектина в адипоцитах ЭЖТ снижалась на 20-25%, по сравнению с адипоцитами ПЖТ. Для оценки дисбаланса лептин-адипонектинового метаболизма рассчитывали коэффициент отношения их концентраций. В эпикардиальных адипоцитах коэффициент отношения концентрации лептина к адипонектину составил 185 и 229% соответственно на 1-е и 2-е сутки инкубации, по сравнению с коэффициентом в адипоцитах ПЖТ. Кроме того, в адипоцитах ЭЖТ выявлен дисбаланс про- и антивоспалительных цитокинов (см. табл. 2). Содержание провоспалительных цитокинов, ФНО-α и ИЛ-1 статистически значимо выше, в то время как концентрация антивоспалительного, протективного ИЛ-10 ниже в ЭЖТ и составила всего 39 и 49% соответственно на 1-е и 2-е сутки инкубации, по сравнению с адипоцитами ПЖТ. Показатель дисбаланса про- и антивоспалительных цитокинов (отношение ИЛ-1β/ИЛ-10) в культуре адипоцитов ЭЖТ более чем в 2,5 раза выше, по сравнению с показателем в ПЖТ. Таким образом, по адипокиново-цитокиновому профилю адипоциты ЭЖТ и ПЖТ различаются между собой. Адипоциты ЭЖТ при ИБС на фоне ВО характеризуются увеличением уровней ИЛ-1, ФНО-α, лептин-адипонектинового отношения и снижением содержания протективных факторов: адипонектина и антивоспалительного цитокина ИЛ-10. В адипоцитах ПЖТ выявлена лептинорезистентность, а увеличение содержания провоспалительных цитокинов компенсировано возрастанием концентрации ИЛ-10. При выполнении исследования предполагалось, что адипокины и цитокины, синтезируемые адипоцитами ЭЖТ на фоне ВО в кровь, являются факторами риска развития сердечно-сосудистой патологии. В результате оценки параметров адипокинового баланса в сыворотке крови больных с ИБС (табл. 3) выявлено, что при ВО уровень лептина в 1,67 раза выше, а концентрация SOB-R - на 32% ниже, по сравнению с группой без ВО. Факт наличия лептинорезистентности подтверждался FLI, который при ВО оказался выше в 2,7 раза, по сравнению с пациентами без ВО. Концентрация адипонектина в сыворотке крови больных с ВО, напротив, на 27,6% ниже, чем у пациентов без ВО. При оценке воспалительного статуса установлено, что концентрация ФНО-α и ИЛ-1β в сыворотке крови у лиц с ВО превышала значения лиц без ВО в 1,5 и 2,0 раза соответственно. А уровень провоспалительного ИЛ-10 в два раза ниже у пациентов с ВО, по сравнению с больными, у которых отсутствовало ВО. При проведении корреляционного анализа выявлена положительная взаимосвязь между содержанием лептина, ФНО-α, ИЛ-10 в адипоцитах и сыворотке крови, с коэффициентами корреляции, соответственно равными 0,43 (р=0,04); 0,53 (р=0,02) и 0,50 (р=0,04). В целом, динамика концентрации лептина, адипонектина, ФНО-α, ИЛ-1 и ИЛ-10 в сыворотке крови и адипоцитах ЭЖТ имеет одинаковую направленность и выражается увеличением концентрации патогенных факторов на фоне дефицита протективных адипоцитокинов. Выраженный адипокино-цитокиновый дисбаланс адипоцитов и сыворотки крови с диспропорцией в сторону усиления секреции маркеров воспаления и развития лептинорезистентности в группе пациентов с ВО тесно ассоциирован со степенью атеросклеротического поражения сосудов и развитием кардиоваскулярных осложнений. По результатам ангиографического исследования и цветного дуплексного сканирования среди пациентов с ВО достоверно чаще регистрировалось атеросклеротическое поражение нескольких бассейнов со стенозами от 30 до 50% (рис. 1). Кроме того, при ВО преобладало поражение трех и более КА В этой же группе чаще регистрировались стенокардия II, III функционального класса (ФК) - 100% больных против 63%. Отягощенная наследственность по ИБС выявлена у 85% больных с ВО и у 54% пациентов без ВО (р=0,04), по сахарному диабету - у 26 и 10% больных (р=0,04) соответственно. Следует отметить, что дисбаланс патологических и защитных факторов адипокиново-цитокинового профиля у больных с ВО сопровождался более выраженным нарушением липидного и углеводного обмена, по сравнению с пациентами, не имеющими ВО. Обнаружено, что в сыворотке крови больных с ИБС на фоне ВО статистически значимо возрастала концентрация атерогенных показателей липидного обмена (ХС ЛПНП, ХС ЛПОНП, апо-В, триацилглицериды (ТАГ), апо-В/апо-А1 - в 1,32 раза, индекс атерогенности, СЖК) и снижалось содержание антиатерогенных фракций ХС ЛПВП и апо-А1, относительно пациентов без ВО (рис. 2). При ВО у больных с ИБС более выражены изменения углеводного обмена (рис. 3), в частности увеличение индекса НОМА в 1,5 раза и наличие ИР, по сравнению с пациентами, не имеющими висцерального ожирения. Кроме того, для пациентов с ВО характерны гиперинсулинемия, возрастание концентрации С-пептида по сравнению с больными без ВО. Концентрация глюкозы и НbА1с существенно не отличалась (р>0,05). В целом у больных с ВО наблюдались более выраженные изменения адипокино-цитокинового профиля в сыворотке крови и жировой ткани. При этом изменения метаболизма не зависели от степени развития подкожной жировой клетчатки. Среди пациентов с ВО присутствовали лица с нормальным ИМТ, и в то же время у пациентов с высоким ИМТ и ожирением 2-й и 3-й степени не выявлено ВО. В отличие от ПЖТ, площадь ВЖТ определяла более высокие значения концентрации лептина, ФНО-α в адипоцитах и сыворотке крови, показателей липидного и углеводного обмена (положительные коэффициенты корреляции) и более низкое содержание SOB-R (отрицательные коэффициенты корреляции; табл. 4). С площадью ПЖТ связаны только два показателя сыворотки крови: адипонектин (r=0,47; р=0,03) и рецептор к лептину (r=-0,36; р=0,03). Таким образом, при ИБС на фоне ВО адипоциты ЭЖТ характеризуются усилением секреции лептина, его рецептора, провоспалительных цитокинов и снижением секреции адипонектина и ИЛ-10, по сравнению с адипоцитами ПЖТ. Дисбаланс адипокиново-цитокинового статуса больных с ИБС и ВО сопровождается выраженным атеросклеротическим поражением коронарных артерий, стенокардией II и III ФК, возрастанием атерогенных фракций липидов, лептинорезистентностью и ИР. Обсуждение Ожирение является одним из основных факторов риска сердечно-сосудистой патологии, при этом висцеральная форма ожирения характеризуется наибольшим кардиоваскулярным риском. Известно, что у лиц с нормальной массой тела при наличии ВО кардиоваскулярный риск повышается в 2,75 раза, а риск смерти от всех причин увеличивается в 2,08 раза по сравнению с лицами, у которых отсутствует ВО [14]. ВЖТ является активным эндокринным органом, в котором синтезируются целый ряд адипокинов, регуляторов липидного и углеводного обмена и цитокинов, вовлекающихся в процесс атерогенеза. Кроме того, ВЖТ обладает необычными метаболическими особенностями. Известно, что в висцеральных адипоцитах повышены экспрессия и функциональная активность β3-адренорецепторов и снижено число рецепторов к инсулину, что приводит к более интенсивному метаболизму липидов, по сравнению с другими жировыми депо. Накопление недоокисленных метаболитов СЖК и церамидов может стимулировать развитие липотоксических расстройств, конечным результатом которых являются ИР, дислипидемия, кардиомиопатия и повышение артериального давления [15]. Среди ВЖТ особое значение может иметь жировая ткань эпикардиальной локализации. ЭЖТ является уникальным и многогранным жировым депо с местными и системными эффектами; ее толщина и метаболическая активность напрямую зависят от объема ВЖТ [16]. Также толщина эпикардиального жира напрямую коррелирует с тяжестью поражения КА при ИБС и толщиной миокарда левого желудочка [17]. С учетом того, что ВО является неблагоприятным фактором развития патологии сердца, основное внимание в настоящем исследовании уделено адипокиново-цитокиновому профилю адипоцитов и сыворотки крови больных с ИБС на фоне ВО. Исследованы адипоциты ЭЖТ и ПЖТ. Показано, что адипоциты ЭЖТ характеризуются более высокой концентрацией лептина на фоне снижения содержания адипонектина, по сравнению с адипоцитами ПЖТ (см. табл. 2). Увеличение концентрации лептина в адипоцитах ПЖТ и ЭЖТ находилось в прямой зависимости от его концентрации в сыворотке крови. Однако, в отличие от адипоцитов, в сыворотке крови повышение содержания лептина протекало на фоне снижения его SOB-R. Увеличение секреции лептина на фоне снижения концентрации его рецептора может служить проявлением лептинорезистентности [18]. При этом наиболее выраженные изменения в сыворотке проявлялись при наличии ВО. Анализируя результаты изучения цитокинового профиля адипоцитов, можно заключить, что при ИБС существенное значение имеет активация воспаления в адипоцитах ЭЖТ больных с ВО, где увеличение концентраций ФНО-α, ИЛ-1 и ИЛ-6 сопровождается снижением уровня антивоспалительного цитокина ИЛ-10. С учетом способности провоспалительных цитокинов модулировать синтез и секрецию адипокинов, активация воспаления может быть фактором увеличения содержания лептина и угнетения протективного адипонектина в адипоцитах ЭЖТ. Однако патологическое влияние лептина в адипоцитах ЭЖТ может быть скомпенсировано увеличением растворимого рецептора лептина, который может связывать избыток лептина. В адипоцитах ПЖТ активация воспаления контролируется высоким содержанием ИЛ-10, а увеличение лептина сочетается с высоким содержанием адипонектина. Разная реакция адипокинов в ЭЖТ и ПЖТ проявляется в противоположной реакции растворимого рецептора лептина, концентрация которого увеличивается в ЭЖТ и снижается в ПЖТ. Снижение концентрации растворимого рецептора лептина и адипонектина связано с увеличением площади ВЖТ и может рассматриваться как фактор формирования лептинорезистентности. Локальный и системный дисбаланс адипокинового и цитокинового профиля при ВО сочетается с наличием атеросклероза, многососудистого поражения КА нескольких бассейнов со стенозами от 30 до 50%, стенокардией II и III ФК, возрастанием атерогенных фракций липидов сыворотки крови, ИР. По-видимому, вырабатываемые адипокины и цитокины попадают непосредственно в коронарный кровоток благодаря анатомической близости ЭЖТ к коронарным сосудам, что может иметь неблагоприятные последствия. Известно, что интраартериальное введение ФНО-α сопровождается развитием эндотелий-зависимой вазодилатации и инициации воспаления в сосудистой стенке [19]. Проатерогенный эффект ФНО-α также включает промоцию миграции лейкоцитов к эндотелию, увеличение синтеза молекул адгезии и хемоаттрактантов, усиление капиллярной проходимости [20]. Заключение Таким образом, при ИБС на фоне ВО состояние адипоцитов ЭЖТ характеризуется как «метаболическое воспаление» и может свидетельствовать о непосредственном вовлечении адипоцитов в патогенезе ИБС за счет формирования адипокинового дисбаланса и активации провоспалительных реакций. Определение коэффициентов ИЛ-1/ИЛ-10, лептина/адипонектина и содержания растворимого рецептора лептина можно использовать при оценке адипокиново-цитокинового дисбаланса при ИБС, протекающей на фоне ВО. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

O V Gruzdeva

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Disease; Siberian State Medical University, Ministry of Health of Russia

Email: o_gruzdeva@mail.ru

A D Borodkina

S.V. Belyaev Kemerovo Regional Clinical Hospital, Regional Diabetological Center

O E Akbasheva

Kemerovo State Medical Academy, Ministry of Health of Russia

Yu A Dileva

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Disease

L V Antonova

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Disease

V G Matveeva

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Disease

E G Uchasova

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Disease

S V Ivanov

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Disease

E V Belik

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Disease

E V Fanaskova

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Disease

V N Karetnikova

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Disease; Siberian State Medical University, Ministry of Health of Russia

A N Kokov

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Disease

O L Barbarash

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Disease; Siberian State Medical University, Ministry of Health of Russia

References

Supplementary files