Mesenchymal stromal cells of bone marrow and azathioprine in Crohn's disease therapy

Full Text

5-АСК - 5-аминосалициловая кислота АЗА - азатиоприн БК - болезнь Крона ВЗК - воспалительные заболевания кишечника ГИБП - генно-инженерные биологические препараты ГКС - глюкокортикостероиды ИАБК - индекс активности болезни Крона ИЛ - интерлейкин ИНФ-γ - интерферон-γ МСК - мезенхимальные стромальные клетки НLA - антигены главного комплекса гистосовместимости ПК - плазматические клетки СОЭ - скорость оседания эритроцитов СРБ - С-реактивный белок ТФР-1β - трансформирующий фактор роста-1β ФНО-α - фактор некроза опухоли-α IDO - индоламин-2,3-диоксигеназа Ig - иммуноглобулин NK - естественные киллеры Несмотря на достижения в терапии болезни Крона (БК), около 30% больных нуждаются в проведении альтернативной биологической терапии, примерно 20-40% больных требуется хирургическое вмешательство, которое не гарантирует отсутствия рецидивов. Поэтому остается актуальным дальнейший поиск методов лечения и профилактики рецидивов БК [1]. Одним из новых подходов к терапии БК является использование возможностей стволовых клеток, в частности, мезенхимальных стромальных клеток (МСК) - одной из составляющих «регенеративной медицины» [2]. В последние годы МСК успешно применяют в лечении больных с ревматоидным артритом и воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) [3-6]. Терапевтическая ценность МСК основана на их способности модулировать функции иммунных клеток. При этом важными участниками данного процесса считаются паракринные эффекты, которые осуществляются посредством широкого разнообразия растворимых факторов. Oсобенно важным является метаболизм триптофана, регулируемый с помощью активности фермента индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) и усиления активности регуляторных Т-клеток [7-9]. IDO является цитоплазматическим ферментом, который участвует в катаболическом метаболизме триптофана и известен способностью модулировать иммунную систему и индуцировать иммунологическую толерантность. IDO индуцируется через провоспалительные медиаторы и цитокины, главным образом интерферон-γ (ИНФ-γ). В ответ на ИНФ-γ клетки экспрессируют IDO и концентрация триптофана соответственно быстро снижается в окружающей среде наряду с накоплением кинуренина. В результате подобной модуляции метаболизма триптофана происходит ингибирование пролиферации лимфоцитов [7-9]. Кроме иммуномодулирующей способности, МСК обладают низкой иммуногенностью. Это связано с тем, что в нестимулированных МСК экспрессия антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA) I класса очень низкая, а HLA II класса и классические костимулирующие молекулы CD40, CD80 и CD86 не обнаруживаются. Было показано, что стимуляция ИНФ-γ увеличивает число молекул обоих классов (I и II), не влияя на экспрессию CD40, CD80 и CD86 [10-14]. Установлено, что иммуномодулирующие препараты, в частности, азатиоприн (АЗА), метотрексат и инфликсимаб, независимо от концентрации, не влияют на жизнеспособность, дифференцировку, фенотип и способность МСК подавлять пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови [15]. По данным H.R. Huang и соавт. [16], инфликсимаб оказывает минимальное воздействие на пролиферацию МСК, апоптоз и их клеточный цикл, в то время как АЗА ингибирует пролиферацию клеток и индуцирует апоптоз МСК in vitro. Цель нашей работы - оценить эффективность терапии МСК костного мозга у больных БК, получающих АЗА. Материалы и методы В исследование включены 34 больных с воспалительной (люминальной) формой БК. 1-я группа больных (n=15) в возрасте от 19 до 58 лет (Ме - 29 лет) получала противовоспалительную терапию с применением культуры МСК в комбинации с АЗА; 2-я группа больных (n=19) в возрасте от 23 до 60 лет (Ме - 31 год) получала только противовоспалительную терапию и МСК. Особенности сопутствующей противовоспалительной терапии показаны в табл. 1. Культуру МСК в дозе 2 млн/кг вводили трижды в течение месяца с интервалом 1 нед, затем через 6 мес с момента первого введения МСК. АЗА назначали в дозе 2-2,5 мг/кг. Лечение продолжалось от 1 года до 5 лет. Забор, культивирование, хранение и подготовку культуры клеток для введения больным осуществляли в лаборатории отделения клеточной и экспериментальной лучевой терапии Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф. Цыба Минздрава России в соответствии с ранее опубликованной методикой [17]. Степень тяжести БК оценивали по индексу активности болезни Крона (ИАБК) Беста в баллах. Сумма <150 баллов соответствовала клинической ремиссии, 150-300 баллов - легкой степени, 301-450 баллов - средней степени, >450 баллов - тяжелой степени. У всех больных, включенных в исследование, индекс Беста соответствовал средней степени тяжести БК. У больных 1-й группы он в среднем составлял 337,6±17,1 балла, у больных 2-й группы - 332,7±11,0 балла (p=0,3). Эффективность терапии оценивали через 2, 6 и 12 мес по данным расчета ИАБК, уровня иммуноглобулинов классов A, G и M (IgA, IgG, IgM), интерлейкинов (ИЛ) - ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-10, фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), ИНФ-γ, трансформирующего фактора роста-1β (ТФР-1β), С-реактивного белка (СРБ), тромбоцитов и скорости оседания эритроцитов (СОЭ) через 2, 6 и 12 мес. Иммуноглобулины в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии. ИЛ-1β, ФНО-α, ИНФ-γ, ИЛ-4, ИЛ-10 и ТФР-1β исследовали иммуноферментным твердофазным методом с помощью тест-систем ООО «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург), Orgentec (Германия), «Евроиммун», «Ведалаб» (Франция). Статистический анализ выполняли с использованием пакета прикладных программ Microsoft® Office Excel 2003; Statistica v. 6,0; Primer of Biostatistics Version 4.03 by Stanton A. Glantz 1998. Для определения значимости различий между средними величинами при нормальном распределении совокупностей применялся t-критерий Стьюдента. При определении рисков рецидива БК по методике «заболеваемость» учитывали новые случаи исходов (рецидивов), возникших за время наблюдения в обеих группах больных. «Протокол ограниченных клинических испытаний метода системной трансплантации аллогенных МСК костного мозга человека у больных язвенным колитом и БК» утвержден ученым советом и согласован с локальным этическим комитетом МКНЦ им А.С. Логинова. Данное исследование проведено до вступления в силу Федерального закона от 23 июня 2016 г. № 180-ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах». Пациенты подписывали письменное информированное согласие на участие в настоящем исследовании. Клинические, демографические характеристики больных БК, а также исходные лабораторные показатели представлены в табл. 1. Результаты и обсуждение Через 2 мес у всех пациентов 1-й и 2-й групп достигнута клиническая ремиссия: частота стула не превышала 4 раз в сутки; стул оформленный, без патологических примесей; отсутствовали боли в животе. Отмечалась прибавка массы тела. Через 6 мес у 4 (26,7%) больных 1-й группы и у 6 (31,6%) больных 2-й группы наступила клинико-эндоскопическая ремиссия (p1,2>0,05). Через 12 мес у 1 (6,6%) больного 1-й группы и у 2 (10,5%) больных 2-й группы развился рецидив БК [относительный риск - 0,63, 95% доверительный интервал 0,06-6,34, р=0,82], который проявился увеличением частоты стула, болями в животе, ухудшением общего самочувствия, наличием лихорадки выше 38,5°С. Больным назначены ГКС в дозе 1 мг/кг. На рис. 1 показана динамика ИАБК в группах больных за 12 мес наблюдения. В обеих группах больных отмечено достоверное снижение ИАБК. Через 2 мес он составил в 1-й группе 118,9±12,4 балла, во 2-й - 120,3±14,1 балла (p=0,7). Через 6 мес этот показатель снизился до 110,3±11,1 и 114,3±11,8 балла, соответственно (p=0,8); через 12 мес - до 99,9±10,8 и 100,6±12,1 балла, соответственно (p=0,8). Вопрос о влиянии МСК на функциональное состояние иммунной системы больных ВЗК в настоящее время практически не исследован, поэтому представляют интерес полученные нами сравнительные данные об изменениях иммунного статуса больных БК под влиянием лечения МСК как в комбинации с АЗА, так и без него. Известно, что длительное применение иммунодепрессантов (ГКС, цитостатиков) при прогрессирующем течении БК сопровождается угнетением функциональной активности иммунной системы, снижением уровня цитокинов и иммуноглобулинов [18]. Действительно, как показывают наши данные, уровень IgA, IgG, IgM достоверно ниже у больных 1-й группы, отличавшихся более продолжительным анамнезом и длительным применением АЗА (см. табл. 1). После повторной трансплантации МСК содержание иммуноглобулинов становилось достоверно более высоким (рис. 2-4). Так, уровень IgG в сыворотке крови у больных 1-й группы через 2, 6 и 12 мес составлял 14,3±0,8, 13,8±0,6 и 12,7±0,7 г/л, соответственно; содержание IgM - 1,2±0,2, 1,2±0,2 и 1,8±0, 1 г/л, соответственно; IgA - 0,8±0,02, 1,72±0,1 и 1,67±0,7 г/л, соответственно, что было достоверно выше по сравнению с исходным уровнем иммуноглобулинов в обеих группах больных БК (p<0,05). Известно, что МСК осуществляют супрессию В-звена иммунной системы опосредованно через Т-звено. При совместном культивировании МСК подавляют продукцию иммуноглобулинов плазматическими клетками (ПК), не нарушая при этом их пролиферацию. В основе механизма такого действия МСК лежит блокировка сигнального пути STAT-3, отвечающего за дифференцировку В-клеток в ПК. Таким образом, ПК переводятся на более низкую стадию дифференцировки с подавлением продукции иммуноглобулинов [19]. Однако MCК могут модулировать иммунный ответ, который, как известно, играет ключевую роль в патогенезе БК. Показано, что человеческие MCК ингибируют пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови и продукцию ИНФ-γ, в то время как секреция противовоспалительных ИЛ усиливается. На мышиной модели колита, индуцированного тринитробензолсульфоновой кислотой, показано, что человеческие МСК улучшают клинические и микроскопические проявления колита, уменьшают системную и локальную продукцию провоспалительных цитокинов, связанную со слизистой оболочкой кишечника, увеличивают секрецию противовоспалительных цитокинов и индуцируют регуляторные T-клетки в брыжеечных лимфатических узлах мышей с экспериментальным колитом [20]. Поэтому МСК проявляют себя как мощные прямые модуляторы иммунной системы, нормализующие уровень иммуноглобулинов. Полученные нами результаты подтверждают иммуномодулирующий эффект МСК, направленный на стимуляцию угнетенной иммунной системы больных БК, длительно получающих иммуносупрессоры, и последующий противовоспалительный эффект. Через 2 мес уровень IgА и IgМ в 1-й группе был ниже, чем у пациентов 2-й группы, что также свидетельствует о более значимом угнетении иммунной системы пациентов с БК, длительно получающих иммуносупрессоры. Через 6 и 12 мес в обеих группах уровни IgА, IgМ и IgG были сопоставимы и находились в пределах референсных значений. Аналогично изменялся и уровень про- и противовоспалительных цитокинов сыворотки крови, которые также зависят от продолжительности БК и длительности приема иммуносупрессоров. Необходимо подчеркнуть, что у подавляющего большинства больных БК, длительно принимающих иммуносупрессоры, в исходном состоянии, предшествующем трансплантации МСК, при наличии выраженных клинических, эндоскопических и гистологических проявлений содержание цитокинов и иммуноглобулинов в сыворотке крови снижено. Это обусловлено тяжелым прогрессирующим течением аутоиммунного заболевания, длительным применением иммуносупрессивной терапии, угнетением функциональной активности иммунной системы, развитием вторичного иммунодефицита. По мере увеличения продолжительности БК и частоты рецидивов концентрация циркулирующих цитокинов уменьшалась, что можно расценить как результат истощения и угнетения продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками [21]. В нашем исследовании исходный уровень ИЛ-1β, ФНО-α, ИНФ-γ, ИЛ-12, ИЛ-4 и ТФР-1β был достоверно ниже в группе больных с более продолжительным анамнезом заболевания и длительно принимающих АЗА (см. табл. 1). В табл. 2 показана динамика лабораторных показателей активности воспалительного процесса, про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови после трансплантации МСК. Через 2 мес после введения МСК отмечен достоверный рост уровней ИНФ-γ, ФНО-α, ИЛ-1β в обеих группах, причем уровень ФНО-α был достоверно ниже в 1-й группе больных, что, вероятно, связано с дополнительным противовоспалительным эффектом АЗА. Исходя из этого, можно предположить, что МСК и АЗА потенцируют иммуносупрессивный эффект друг друга. В обеих группах больных БК отмечался значительный достоверный рост противовоспалительных цитокинов: ТФР-1β, ИЛ-4, ИЛ-10, - что обусловлено продукцией МСК противовоспалительных цитокинов и ростовых факторов (ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-14, колониестимулирующих факторов). Динамика уровней про- и противовоспалительных цитокинов после введения МСК свидетельствует об иммунорегуляторных свойствах МСК костного мозга. Через 6 мес после введения МСК в обеих группах больных БК отмечена тенденция к росту про- и противовоспалительных цитокинов, обеспечивающая баланс между ними. Через 12 мес отмечалось достоверно более низкое снижение уровня провоспалительных цитокинов: ИНФ-γ, ФНО-α, ИЛ-1β - в 1-й группе, свидетельствующее о потенцировании иммуносупрессивного эффекта МСК и АЗА, обеспечивающего более выраженный противовоспалительный эффект. Уровень противовоспалительных цитокинов: ТФР-1β, ИЛ-4, ИЛ-10 - в обеих группах сопоставимы и находились в реципрокной зависимости с провоспалительными цитокинами. Таким образом, трансплантация МСК сопровождается разнонаправленными изменениями иммунного статуса больных, а именно - повышением в сыворотке крови изначально сниженной концентрации цитокинов, иммуноглобулинов, восстановлением баланса про- и противовоспалительных цитокинов, что коррелирует с положительной клинической динамикой БК. АЗА, возможно, потенцирует иммуносупрессивное действие МСК и усиливает их терапевтические свойства, тогда как МСК в свою очередь могут изменять иммуносупрессивную способность АЗА. Клиническая активность БК и частота рецидивов не зависят от монотерапии МСК или их комбинации с АЗА. Однако у больных БК, получающих одновременно АЗА и МСК, уровень провоспалительных цитокинов достоверно ниже, чем у пациентов, получавших только МСК. При более длительном наблюдении это может стать фактором, способным уменьшить активность воспалительного процесса и частоту рецидивов БК. Заключение Дополнение терапии МСК иммуносупрессором АЗА оказывает более выраженный противовоспалительный терапевтический эффект. Основные функциональные свойства МСК, являющиеся терапевтически значимыми для контроля воспаления, не нарушаются в результате взаимодействия с АЗА. МСК могут восстанавливать баланс нарушенной иммунной системы у больных БК, связанный с прогрессированием заболевания и длительным приемом иммуносупрессоров. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

O V Knyazev

S.A. Loginov Moscow Clinical Research and Practical Center, Moscow Healthcare Department

Moscow, Russia

A V Kagramanova

S.A. Loginov Moscow Clinical Research and Practical Center, Moscow Healthcare Department

Moscow, Russia

N A Fadeeva

S.A. Loginov Moscow Clinical Research and Practical Center, Moscow Healthcare Department

Moscow, Russia

A A Lishchinskaya

S.A. Loginov Moscow Clinical Research and Practical Center, Moscow Healthcare Department

Moscow, Russia

O N Boldyreva

S.A. Loginov Moscow Clinical Research and Practical Center, Moscow Healthcare Department

Moscow, Russia

K K Noskova

S.A. Loginov Moscow Clinical Research and Practical Center, Moscow Healthcare Department

Moscow, Russia

R B Gudkova

S.A. Loginov Moscow Clinical Research and Practical Center, Moscow Healthcare Department

Moscow, Russia

A G Konoplyannikov

A.F. Tsyb Medical Radiological Research Center - branch of the "National research center of medical radiology", Ministry of Health of Russia

Obninsk, Russia

A I Parfenov

S.A. Loginov Moscow Clinical Research and Practical Center, Moscow Healthcare Department

Email: asfold@mail.ru
Moscow, Russia

References

Supplementary files