Features of the functional activity of macrophage link of immunity with gastroesophageal reflux disease depending on the type of reluctate: in vitro model

Full Text

ГЭРБ - гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь ИЛ - интерлейкин ИНФ - интерферон ФНО - фактор некроза опухоли Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ) - одно из наиболее распространенных в повседневной практике клинициста заболеваний. Согласно данным последних эпидемиологических исследований, клинические и эндоскопические признаки ГЭРБ диагностируется у 8-25% всей популяции в зависимости от страны, расы и пола [1]. В Российской Федерации распространенность ГЭРБ достигает 11-15% [2]. Частота ГЭРБ за последние 15 лет значительно возросла и в настоящее время составляет не менее 5 случаев на 1000 населения в год [1]. Несмотря на то что ГЭРБ редко приводит к смерти, она ассоциирована с высокой заболеваемостью и серьезными осложнениями, такими как изъязвление пищевода, пептическая стриктура, пищевод Барретта, что позволяет рассматривать ее и в качестве одного из ведущих факторов риска развития аденокарциномы пищевода [2-4]. В патогенезе ГЭРБ существенное значение играет активное воспаление слизистой оболочки пищевода, включая умеренную инфильтрацию клетками иммунной системы, в том числе макрофагами. Современное понимание клеточных и молекулярных механизмов патогенеза ГЭРБ-ассоциированного воспаления слизистой оболочки пищевода предполагает сложные и многофакторные иммуноопосредованные эффекты повторного воздействия рефлюксов желудочного содержимого с различной величиной рН. Целью проведенного исследования был обобщенный анализ изменений функциональной активности макрофагов по оценке изменений фагоцитарной активности, продукции цитокинов про- и антивоспалительного профиля, а также изменению уровня экспрессии поверхностных маркеров макрофагов, характерных для провоспалительного (М1) или антивоспалительного (М2) фенотипа клеток при воздействии рефлюктатов различного типа. Материалы и методы Возможные изменения активности макрофагов различных фенотипов оценивали на экспериментальной in vitro модели путем кокультивирования перитонеальных макрофагов мышей генетической линии С57/BL6 (n=65) и полученных от пациентов с ГЭРБ рефлюктатов (n=65), имеющих различные значения рН. В зависимости от величины рН рефлюктата сформировано три группы сравнения: 1-я группа (n=31) - рН 4,6-6,6, 2-я группа (n=29) - рН 6,7-7,2, 3-я группа (n=6) - рН 7,3-8,1. Кокультивирование биологического материала проводилось в течение 36 ч в 48-луночных культуральных планшетах из расчета по 0,5 млн клеток на лунку в 0,5 мл культуральной среды RPMI 1640 с 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при стандартной концентрации 10% FBS (fetal bovine serum, сыворотка для культивирования клеток). По прошествии общего времени 36 ч кокультивирования выполнен объединенный анализ функциональной активности макрофагов с учетом стандартных критериев функциональной активности клеток и макрофагального фенотипа [5, 6]: фагоцитарной способности, секреторной активности и рецепторной характеристики макрофагов. Анализ фагоцитарной способности макрофагов проводился по поглощению микроорганизмов штамма Staphylococcus aureus 9198 методом микроскопии. Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов мышей оценивалась через 3 ч совместного культивирования макрофагов с рефлюктатами пациентов. Анализ фагоцитарной способности проводился на основании среднего количества бактерий, поглощенных одним фагоцитом, исходя из среднего числа макрофагов, равного 200 клеткам. Для анализа фагоцитарной способности макрофагов по поглощению микроорганизмов штамма Staphylococcus aureus использовано разведение 1:1000. Оценка рецепторной характеристики макрофагов включала уровень экспрессии поверхностно-клеточных CD-маркеров (М1-фенотип - CD25, CD80, М2-фенотип - CD163, CD206). Секреторная активность клеток проанализирована на основании данных о продукции провоспалительных М1-цитокинов: интерлейкинов (ИЛ-1β, ИЛ-8, ИЛ-12p70), интерферона-γ (ИНФ-γ), факторов некроза опухоли-α и -β (ФНО-α и ФНО-β), антивоспалительных М2-цитокинов ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-10, а также М1/М2-цитокинов и обладающих свойствами и М1-, и М2- цитокинов - ИЛ-2 и ИЛ-6 [7, 8]. Уровень цитокинов и экспрессию CD-маркеров определяли методом проточной цитофлуориметрии (Beckman Coulter FC500, США) с помощью набора для определения цитокинов Th1/Th2-профиля (Antigenix America, США), а также моноклональных антител к CD163(R&D), CD25, CD80, CD206 (Beckman Coulter, США) по инструкции производителя. Статистический анализ проведен с помощью программы Statistica 8.0 (Statsoft, США). Все выборки данных проверены на нормальность распределения. Значимость различий между исследуемыми признаками в выборке с нормальным распределением определена параметрическими методами статистики (t-критерий Стьюдента). Данные представлены в виде средних значений полученных показателей (М) и средней ошибки среднего (±m). Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Результаты В представленной in vitro модели изменений макрофагального звена иммунитета при ГЭРБ в зависимости от величины рН рефлюктата была проведена совокупная оценка показателей функциональной активности макрофагов, позволяющих определить их фенотипическую принадлежность: фагоцитарная активность клеток в отношении штамма Staphylococcus aureus 9198, экспрессия поверхностных CD-маркеров М1- и М2-фенотипов на поверхности культивируемых in vitro макрофагов. Также выполнена оценка содержания цитокинов Th1/Th2-профиля в среде культивирования макрофагов, что, в свете современной концепции роли макрофагов в формировании иммунного ответа, соответствует М1/М2-профилю цитокинов [9, 10]. Полученные данные анализировались в совокупности, что дает основание для объективизации выделения преобладающего функционального фенотипа макрофагов с учетом представленного ряда показателей. Оценка фагоцитарной способности перитонеальных макрофагов мышей линии С57/BL6. Установлено, что показатели фагоцитарной активности макрофагов, вычисленные на основании среднего количества бактерий, поглощенных одним фагоцитом, существенно не изменялись в зависимости от величины рН добавляемого рефлюктата и составили 9,58±0,84 для 1-й группы, 9,57±0,83 для 2-й группы и 9,30±0,91 для 3-й анализируемой группы (p>0,05). Полученные данные согласуются с ранее выявленными особенностями фагоцитарной функции макрофагов преимущественно М1-фенотипа [11]. Анализ рецепторной характеристики макрофагов мышей генетической линии С57/BL6 после кокультивирования с различными типами рефлюктатов пациентов с ГЭРБ. Анализ рецепторной характеристики перитонеальных макрофагов мышей генетической линии C57/BL6 проводился на основании изменения экспрессии поверхностных CD-маркеров макрофагов, свойственных М1/М2-фенотипам клеток. В 1-й группе (рН 4,6-6,6) экспрессия поверхностно-клеточных маркеров как М1-, так и М2-макрофагов достоверно не различалась (p>0,05), что, вероятно, обусловлено изменением конформации поверхностно-клеточных рецепторов под действием существенного изменения рН среды в кислую сторону (табл. 1, рис. 1). В группе воздействия рефлюктатов нейтрального значения (рН 6,7-7,2) на макрофагах значимо преобладала экспрессия CD-маркеров, характерных для М1-фенотипа макрофагов, как при сопоставлении с другими группами сравнения, так и внутри группы по сравнению с маркерами М2-фенотипа - CD163 и СD206 (см. табл. 1, рис. 1). В группе воздействия рефлюктата слабощелочного характера (рН 7,3-8,1) сохранялась тенденция к суммарному преобладанию экспрессии маркеров М1-фенотипа макрофагов - CD25 и CD80 - по сравнению с маркерами М2-фенотипа, однако уровень экспрессии М2-маркеров CD163 и CD206 был выше относительно групп сравнения (см. табл. 1, рис. 1). Анализ суммарного индекса экспрессии М1/М2 поверхностно-клеточных маркеров макрофагов М1- и М2-фенотипов свидетельствует о наибольшем проценте М1-рецепторов на поверхности макрофагов, подвергшихся воздействию нейтрального рефлюктата (рН 6,7-7,2), тогда как при смещении рН рефлюктата в слабощелочную сторону отмечено существенное изменение экспрессии макрофагов - снижение М1 и увеличение М2 (см. рис. 1). Анализ секреторной активности перитонеальных макрофагов мышей линии С57/BL6 после кокультивирования с различными типами рефлюктатов пациентов с ГЭРБ. Во всех группах сравнения анализ продукции цитокинов выявил суммарное преобладание продукции Th1-провоспалительных и Th1/Th2-бивалентных цитокинов (табл. 2, рис. 2). Индекс суммарной продукции Th1/Тh2 в группах прогрессивно снижался с увеличением рН рефлюктата и составил 3,6 единицы в группе рН 4,6-6,6; 2,8 единицы в группе рН 6,7-7,2 и 1,6 единицы в группе рН 7,3-8,1, что обусловлено увеличением продукции Th2-цитокинов при смещении рН рефлюктата в слабощелочную сторону. При изменении рН рефлюктата от кислого до слабощелочного выявлены наиболее значимые изменения продукции таких Th1- и бивалентных Th1/Th2-цитокинов, как ИЛ-1β, ИЛ-8, ФНО-α, ФНО-β и бивалентного ИЛ-6 (36,3±6,3 vs 25,1±4,8 пг/мл; 71,0±10,5 vs 35,9±8,03 пг/мл; 22,9±3,8 vs 12,4±5,5 пг/мл; 24,9±4,7 vs 7,2±1,4 пг/мл; 71,6±10,2 vs 53,5±5,6 пг/мл, соответственно; р<0,05). Наиболее выраженные изменения продукции Th2-цитокинов отмечены по уровню ИЛ-10: 27,2±2,6 пг/мл в группе pH 7,3-8,1 по сравнению с 18,2±3,5 и 8,4±0,6 пг/мл для групп с рН 6,7-7,2 и 4,6-6,6, соответственно (р<0,05). Обсуждение В последние годы патогенетические механизмы развития ГЭРБ и ее осложнений все чаще рассматриваются на тканевом и клеточном уровне. При изучении повреждения слизистой оболочки пищевода, несомненно, учитывается развитие воспаления, реализуемое через широкий спектр биологических медиаторов, включающих в себя вазоактивные амины и пептиды, компоненты комплемента, протеолитические ферменты, цитокины, факторы роста, продуцируемые как клетками иммунной системы, прежде всего макрофагами, нейтрофилами, Т-лимфоцитами, так и неиммунными - эпителиальными и мезенхимальными - клетками. Макрофаги - одни из основных клеток системы иммунитета, которые участвуют в продукции спектра биологических медиаторов как локально, так и системно. Известно, что данные клетки, тесно интегрированные в Th1- и Th2-звенья иммунного ответа [9, 10], способны изменять свою функциональную активность (фенотип) под действием микроокружения и, как было показано в представленной работе на in vitro модели, - в том числе под влиянием рефлюктата, воздействующего на слизистую оболочку пищевода. Известно, что ГЭРБ сопровождается нарушением иммунного ответа в виде дисбаланса между клеточным (Th1) и гуморальным (Th2) звеньями иммунного ответа, с преобладанием Th1-провоспалительного компонента, что подтверждено результатами, полученными в проведенном исследовании: во всех группах сравнения при воздействии рефлюктатов на макрофаги выявлено преобладание М1-фенотипа макрофагов, интегрированного в Th1-звено иммунного ответа. Учитывая полученные данные, можно с уверенностью говорить о значимой роли макрофагов в патогенезе ГЭРБ, а также о необходимости учета особенностей их функциональной активности при воздействии на них рефлюктатов различного характера. В зависимости от преобладающей активности (про- или противовоспалительной) цитокины могут существенным образом влиять на течение заболевания. В связи с этим особую значимость приобретает изучение цитокинового профиля и особенностей функциональной активности макрофагов у больных ГЭРБ, учитывая недостаточные данные в этой области. Заключение Анализ активности макрофагов различного фенотипа в зависимости от рН рефлюктата при ГЭРБ выявил преобладание M1 (Th1) провоспалительных активированных макрофагов у пациентов с ГЭРБ. Воздействие кислого рефлюктата (рН 4,6-6,6) приводило к преимущественному увеличению продукции Th1-цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-8, ФНО-α) в группе воздействия и, вероятно, нарушению конформации поверхностно-клеточных рецепторов, что затрудняло определение рецепторных характеристик макрофагов в данной группе при сохраненной фагоцитарной активности клеток, свойственной макрофагам провоспалительного М1-фенотипа. При воздействии in vitro на макрофаги рефлюктата слабощелочного характера (рН 7,3-8,1) макрофаги также характеризовались преимущественно M1 (Th1) провоспалительной направленностью иммунного ответа, но при этом установлена четко выраженная тенденция к увеличению экспрессии М2 (Th2) CD-маркеров и продукции Th2-цитокинов по сравнению с другими группами сравнения, что, несомненно, свидетельствует о влиянии рН рефлюктата на функциональную активность макрофагов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

S V Lyamina

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, Ministry of Health of Russia

Email: svlvs@mail.ru

I V Maev

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, Ministry of Health of Russia

S V Kalish

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, Ministry of Health of Russia

D N Andreev

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, Ministry of Health of Russia

O V Kladovikova

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, Ministry of Health of Russia

I Yu Malyshev

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, Ministry of Health of Russia

References

Supplementary files