Stem Cell Therapy for Perianal Crohn’s Disease

Full Text

Болезнь Крона (БК) - хроническое воспалительное прогрессирующее заболевание желудочно-кишечного тракта с преимущественным поражением терминального отдела подвздошной кишки. В зависимости от течения различают три фенотипа (формы) БК: воспалительную, стенозирующую и пенетрирующую [1]. В большинстве случаев начальный этап БК характеризуется гранулематозным воспалением слизистой оболочки кишки, однако со временем у многих больных формируются стриктуры или свищи/фистулы как результат неконтролируемого прогрессирования воспалительного процесса. В течение 20 лет у 88% пациентов развиваются стриктуры (18%) и свищи/фистулы (70%) [2]. Клиническое течение БК и темпы ее прогрессирования значительно варьируют. У 43% больных заболевание начинается с тяжелой атаки, сменяющейся появлением относительно редких симптомов на протяжении последующих 10 лет [3]. Однако у 51% больных БК носит хроническое течение (19%) или имеет рецидивирующий характер (32%) [3, 4]. Конечной целью лечения БК является заживление пораженных сегментов кишки, увеличение продолжительности ремиссии, уменьшение частоты и тяжести осложнений и улучшение качества жизни больных [5-7]. Лечение пациентов с БК должно проводиться с учетом прогностических факторов прогрессирования заболевания. Согласно Консенсусу The European Crohn's and Colitis Organization (ЕССО), клиническое течение БК можно прогнозировать на основании клинических симптомов в момент установления диагноза, возраста пациентов, анамнеза, внекишечных проявлений, а также наличия стенозов и свищей. Перианальные свищи - наиболее распространенные и часто встречающиеся типы свищей при БК [8]. Общая распространенность перианальных свищей в структуре БК варьирует от 21 до 23%, при этом на первом году течения заболевания этот показатель составляет 12%, на 5-м году -15%, на 10-м - 21%, на 20-м году - 26% [9-11]. Особенно характерны для БК свищи прямой кишки. Прямокишечные свищи не угрожают жизни, но ухудшают ее качество и с трудом поддаются лечению. Поэтому в настоящее время перианальные поражения рассматриваются как инвалидизирующие проявления БК. Они наблюдаются у 25-80% пациентов и могут в течение нескольких лет предшествовать абдоминальным симптомам [12]. Перианальные свищи подразделяют на формы простые и сложные. К простым перианальным свищам относят неректовагинальные поверхностные, низкие интра- и транссфинктерные свищи, имеющие единственное наружное отверстие, без клинических признаков абсцедирования и острого воспалительного процесса при отсутствии стриктуры анального канала. К сложным свищам относят любые формы (по отношению к анальному сфинктеру) высоких свищей с множественными наружными отверстиями, с признаками абсцедирования, ректовагинальные свищи, а также свищи со стриктурой анального канала. Кроме того, если при эндоскопии верифицируется выраженный специфический проктит Крона, то данный свищ относят к категории сложного [13]. Свищевая форма БК является показанием для назначения биологической терапии генно-инженерными биологическими препаратами (ГИБП) в момент установления диагноза (терапия «Top-down»). Клиническое исследование по оценке эффективности инфликсимаба (ИФЛ) для лечения пациентов со свищевой формой БК (АССЕNТ II) подтвердило его положительное влияние. Однако сохраняется высокий риск развития рецидива БК. Поэтому остается актуальным поиск новых подходов и методов терапии этой формы БК [14]. Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) обладают иммуномодулирующими свойствами, большим регенеративным потенциалом и применяются в комплексной терапии воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) с 2008 г. [15]. В настоящее время они также применяются для лечения свищевой БК и перианальных свищей [16]. Итальянскими учеными проведено исследование по безопасности и эффективности местного введения аутологичных МСК костного мозга в терапии свищевой формы БК. На основании полученных результатов сделан вывод, что их местное введение является безопасным и эффективным методом терапии этой формы БК [17-20]. Ряд исследователей показали, что существуют различия в эффективности между системным и местным введением МСК для лечения свищевой формы БК. В экспериментальной модели колита Е. Gonzalez-Rey и соавт. установили, что МСК, полученные из жировой ткани, при внутрибрюшинном введении мигрируют по принципу «хоуминга», именно в зону воспаления толстой кишки [21]. М. Duijvestein и соавт. наблюдали аналогичный эффект «хоуминга» с использованием МСК костного мозга человека при системном введении. Тем не менее, лишь небольшое количество меченых МСК обнаружено в воспаленном кишечнике при системном введении культуры клеток [22]. Считается, что внутривенное (в/в) введение МСК оказывает системный иммуномодулирующий эффект, способствующий восстановлению поврежденных тканей. При местном введении большее количество МСК достигает поврежденных тканей, чем при в/в введении, что обеспечивает более интенсивную регенерацию тканей благодаря созданию высокой концентрации растворимых ростовых факторов в зоне повреждения. Частота серьезных нежелательных явлений, вызываемых трансплантацией МСК, не превышает 1,75%. К наиболее частым возможным нежелательным явлениям относят появление боли в месте введения, лихорадку и формирование перианальных абсцессов [23, 24]. Цель нашего исследования - сравнить влияние комбинированной (местное и системное введение) терапии МСК костного мозга, антицитокиновой (ИФЛ) терапии и терапии антибиотиками (АБ)/иммуносупрессорами (ИС) на заживление простых перианальных свищей при БК. Материалы и методы В исследование включены 36 пациентов в возрасте от 18 до 70 лет со средней степенью индекса активности БК (ИАБК) и средней степенью индекса активности перианальной формы БК (ИАПБК). Пациенты ознакомлены с целью исследования, возможными рисками и подписали форму информированного согласия на проведение данного метода лечения. «Протокол ограниченных клинических испытаний метода системной трансплантации аллогенных МСК костного мозга человека у больных язвенным колитом и БК» утвержден Ученым Советом и согласован с локальным этическим комитетом МКНЦ им. А.С. Логинова. Данное исследование проведено до вступления в силу Федерального закона от 23 июня 2016 г. № 180-ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах». Пациенты с БК имели следующие перианальные поражения: у 6 (16,6%) больных выявлены язвы-трещины анального канала, у 23 (63,9%) - простые свищи прямой кишки, у 7 (19,5%) - сочетание двух видов перианальных поражений. Пациентов разделили на 3 группы в зависимости от метода терапии. Первая группа больных в возрасте от 19 до 58 лет (Ме - 29; n=12) получала культуру МСК системно (по схеме) и местно, как показано на рис. 1 (cм. на цветной вклейке). Вторая группа больных БК (n=10) в возрасте от 20 до 68 лет (Ме - 36) получала антицитокиновую терапию ИФЛ по стандартной схеме в дозе 5 мг/кг массы тела. Третья группа больных БК (n=14) в возрасте от 20 до 62 лет (Ме - 28) получала АБ и ИС. Основные исходные демографические и клинико-лабораторные показатели активности БК представлены в табл. 1. Ано- и ректороманоскопию проводили всем пациентам со свищами прямой кишки. Для получения более четкого представления о сложности хода, наличии карманов и гнойных затеков выполняли фистулографию с введением рентгеноконтрастного вещества непосредственно в свищевой ход с последующим выполнением рентгенографии. При необходимости больным выполняли трансанальное ультразвуковое исследование (ТУИС) или магнитно-резонансную томографию (МРТ). Вид свища прямой кишки определяли на рентгеновских снимках по приблизительной высоте внутреннего отверстия в соответствии с рекомендациями, разработанными в ГНЦК им. А.Н. Рыжих [26]. Забор костного мозга, культивирование МСК из клеток костного мозга пациента или донора, замораживание и хранение МСК в жидком азоте выполняли в соответствии с ранее опубликованной методикой [27]. Перед введением МСК делали посев из полученных выращиванием в культуре популяций клеток для контроля возможного бактериального загрязнения (его не выявлено ни в одном случае). Системное и местное введение аллогенных МСК костного мозга. Системную трансплантацию МСК выполняли путем однократного в/в капельного введения в кубитальную вену под контролем АД, пульса и термометрии в течение 40-60 мин. Для осуществления системной трансплантации 150-200 млн аллогенных МСК, размноженных в культуре, клетки взвешивали в 200 мл стерильного физиологического раствора, содержащего гепарин в концентрации 50 ЕД/мл, и путем постановки капельницы вводили пациенту в течение 40-60 мин. Для профилактики посттрансфузионных осложнений перед введением МСК больному вводили 60-90 мг преднизолона в/в струйно или 2 мл супрастина. Повторное введение МСК осуществляли через 1-2 нед, затем через 3 и 12 мес после первого введения для закрепления полученного ранее эффекта. Местное лечение осуществляли по периметру свищевого хода: вводили 40 млн МСК через 4 точки вкола по 1 мл физиологического раствора, содержащего 10 млн МСК. Затем через 4 и 8 нед повторно вводили по 40 млн МСК в область свища (рис. 2, cм. на цветной вклейке). Оценку эффективности терапии проводили на основании оценки динамики ИАБК и ИАПБК (табл. 2) и частоты рецидивов за время наблюдения. Контрольную ано- и ректосигмоскопию, ТУИС или МРТ осуществляли через 3, 6, 12 и 24 мес от начала терапии. Оценивали динамику заживления наружного отверстия свища, количество отделяемого, боль, сексуальную активность и степень уплотнения вокруг свищевого хода. Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Microsoft® Office Excel 2003; Statistica v. 6,0; Primer of Biostatistics Version 4.03 by Stanton A. Glantz 1998. Для определения значимости различий между средними величинами при нормальном распределении совокупностей применялся t-критерий Стьюдента. При определении рисков рецидива БК по методике «заболеваемость» учитывали новые случаи исходов (рецидивов), возникших за время наблюдения в группах больных. Проведен анализ четырехпольных таблиц с использованием непараметрических статистических критериев χ2 с поправкой Йейтса. Результаты Во всех группах больных до начала лечения отмечалось минимальное или умеренное отделение слизи из заднего прохода, дискомфорт в перианальной области, наличие 2 или 3 перианальных свищей, выявленных при проведении клинического осмотра, ТУИС или МРТ, язвы-трещины анального канала с уплотнением (или отсутствием) при пальпации окружающей ткани. Наличие свищей чаще не влияло на сексуальную активность пациентов. Таким образом, исходный ИАПБК в группах составил 4,7±0,3, 4,7±0,3 и 4,8±0,25 балла соответственно (p>0,05). Через 12 нед наблюдения у 8 (66,6%) пациентов 1-й группы и у 6 (60%) пациентов 2-й группы с язвами-трещинами анального канала и свищами прямой кишки наступила эпителизация, уменьшилось количество отделяемого, исчезло ощущение дискомфорта и произошло полное закрытие свищевых ходов (рис. 3 и 4, cм. на цветной вклейке). У 2 (16,7 и 20%) пациентов 1-й и 2-й группы отмечено частичное закрытие свищевых ходов, что расценено нами как ответ на проводимую клеточную или антицитокиновую терапию [относительный риск (ОР) 1,11; 95% доверительный интервал (ДИ) 0,58-2,12, р=0,9]. У пациентов 3-й группы, получавших антибактериальную и иммуносупрессивную терапию, свищи закрылись у 1 (7,14%) пациента. Частичный ответ с уменьшением серозного отделяемого, болей и т.д. отмечен у 4 (28,6%) пациентов. У 9 (64,3%) пациентов ответ на проводимую терапию отсутствовал. На рис. 5 (cм. на цветной вклейке) показаны изменения ИАПБК в процессе лечения. Во всех группах пациентов наступило достоверное снижение средних значений ИАПБК: в 1-й группе - с 4,7±0,3 до 1,8±0,38 балла (р<0,05), во 2-й группе - с 4,7±0,3 до 1,9±0,45 балла (р<0,05), в 3-й группе - с 4,8±0,25 до 2,57±0,46 балла (р<0,05). Через 26 нед у 1 (10%) пациента, получавшего ИФЛ (2-я группа), и у 2 (16,7%) пациентов, получающих МСК (1-я группа), вновь появился дискомфорт в перианальной области, появилось отделяемое из свища прямой кишки и умеренная боль. Рецидив произошел у пациентов с частичным клиническим ответом на проводившуюся биологическую терапию. В целом эффективность клеточной и антицитокиновой терапии у пациентов с БК за 6 мес наблюдения сопоставима (ОР 1,11; 95% ДИ 0,58-2,12, р=0,9). У 1 (7,14%) пациента 3-й группы с частичным клиническим ответом на проводимую терапию произошел рецидив БК. Таким образом, эффективность клеточной терапии у больных 1-й группы оказалась достоверно выше, чем у больных 3-й группы, получавших АБ и ИС терапию (ОР 0,93; 95% ДИ 1,35-64,34, р=0,0056). Через 6 мес в 1-й группе средний ИАПБК составил 2,1±0,46 балла, во 2-й группе - 2,3±0,53 балла. В 3-й группе средний ИАПБК составил 4,1±0,46 балла, что достоверно выше, чем в 1-й и 2-й группах пациентов с БК (p<0,05). Через 52 нед у больных 1-й группы ремиссия заболевания сохранялась у 7 (58,3%) пациентов, 2-й группы - у 6 (60%) (ОР 0,97; 95% ДИ 0,48-1,95; р=0,72). В 3-й группе ремиссия сохранялась у 1 (7,14%) пациента из 14 (ОР 8,17; 95% ДИ 1,16-57,3; р=0,016). Через 12 мес отмечено незначительное повышение средних значений ИАПБК у больных 1-й и 2-й группы: 2,75±0,54 и 2,9±0,58 балла соответственно (p>0,05). В 3-й группе ИАПБК составил 5,0±0,26 балла и оказался достоверно выше, чем у больных 1-й и 2-й группы (p<0,05). Таким образом, через 12 мес у больных, получавших МСК (1-я группа) и ГИБП (2-я группа), отмечено достоверное снижение ИАПБК по сравнению с больными, получавшими АБ и ИС (3-я группа). Через 24 мес наблюдения у некоторой части больных вновь рецидивировали перианальные проявления БК, что проявлялось в открытии свищевых ходов, возобновлении отделения слизи, иногда гноя из заднего прохода, наличием воспалительных изменений в толстой кишке. Среди больных 1-й группы полная ремиссия сохранялась у 5 (41,6%) больных, 2-й группы - у 4 (40%) (ОР 1,04; 95% ДИ 0,38-2,87; р=0,72). Рецидив произошел у 6 и 5 пациентов, т.е. у 50% (ОР 1,00; 95% ДИ 0,43-2,31; р=0,67). В 3-й группе рецидив перианальных проявлений БК наступил у всех больных, проявляясь увеличением гнойного и серозного отделяемого и появлением плотной индурации в перианальной области (ОР 0,5; 95% ДИ 0,28-0,88; р=0,01). Сравнительная оценка эффективности терапии, которая характеризовалась клинической ремиссией, ответом на лечение больных, рецидивами заболевания, между 1-й, 2-й и 3-й группами представлена в табл. 3 и 4. Пациентов с рецидивом заболевания переводили на альтернативные методы лечения, в том числе хирургические. У 4 из 9 пациентов 1-й и 2-й группы с рецидивом потребовалось иссечение свищей (у 3 с транссфинктерными свищами и у 1 с ректовагинальным свищом), одному из 9 больных выполнена облитерация экстрасфинктерного свища. У одной пациентки 2-й группы возник рецидив и, учитывая обострение воспалительного процесса в прямой кишке, наложена илеостома с формированием илеоилеоанастомоза и выведением одноствольной сигмостомы. Четыре пациента переведены на другой вариант антицитокиновой терапии. У одного пациента 3-й группы с сочетанием язв-трещин анального канала и свищей прямой кишки и прогрессированием воспалительного процесса через 6 мес потребовалось выполнение колопроктэктомии. У одного пациента в те же сроки выполнена операция на промежности - бужирование стриктуры и иссечение язвы-трещины анального канала (без положительного результата) и в связи с прогрессированием воспаления в толстой кишке предложена колопроктэктомия, от которой он воздержался. У 4 из 12 пациентов 3-й группы, имеющих рецидив заболевания, потребовалось иссечение свищей и установление сетонов. Шесть пациентов 3-й группы переведены на биологическую антицитокиновую и/или клеточную терапию (табл. 5). Обсуждение МСК относятся к мультипотентным, способным дифференцироваться в несколько типов клеток, они присутствуют во всех тканях организма. А.Я. Фриденштейн и его коллеги впервые описали в 1974 г. концепцию МСК, впервые выделенных ими из костного мозга [28]. Клетки также могут быть успешно получены из пуповинной крови или жировой ткани для клинического применения [29, 30]. Помимо способности к дифференциации, МСК способны подавлять иммунную реактивность слизистой оболочки и стимулировать заживление тканей, что актуально для клинической практики [31-33]. Дополнительные исследования показывают, что МСК ингибируют пролиферацию Т-клеток in vitro [34, 35] и путем активации запрограммированной клеточной гибели [36]. Конкретные механизмы иммуномодуляции МСК пока не ясны, но известно, что влияние на клетки-мишени происходит в непосредственной близости от клетки и зависит не только от межклеточных контактов [36, 37]. Обнадеживающие результаты демонстрируют потенциальную функциональную способность МСК влиять на иммунный ответ и ослаблять воспаление, подтверждая их клиническую значимость для терапевтической трансплантации при аутоиммунных заболеваниях. Сегодня МСК используют для лечения рефрактерных форм БК путем системной трансплантации (в/в введение) при активной люминальной форме заболевания [15] или путем местного введения при перианальной форме [38]. Терапия свищевой формы БК в настоящее время сместилась от исключительно хирургических методов к применению клеточной и антицитокиновой терапии. К сожалению, несмотря на все достижения, длительное закрытие свищей остается на невысоком уровне (37%) [39]. Существует комплекс различных путей и механизмов, через которые МСК воздействуют на поврежденные воспалением ткани в кишечнике. Их раскрытие позволит улучшить современные стратегии терапии БК, в том числе в достижении более глубокого уровня ремиссии. Большое значение имеет и поиск других источников стволовых клеток в доклинических исследованиях на животных. В дополнение к пониманию фундаментальных знаний должны совершенствоваться протоколы применения МСК в терапии больных рефрактерной БК и других аутоиммунных заболеваний. Заключение Перианальные свищи при БК характеризуются упорным рецидивирующим течением, часто могут быть глубокими, экстрасфинктерными и сопровождаться обширным рубцеванием. Даже в эру применения анти-ФНО-α препаратов они могут потребовать наложения постоянной выключающей стомы или резекции прямой кишки. Результаты нашего исследования показали, что применение комбинированной клеточной и антицитокиновой терапии при БК, осложненной перианальными поражениями, достоверно способствует более быстрому закрытию простых свищей с продолжительной последующей ремиссией. В заключение подчеркнем, что лучший результат лечения достигается при совместном наблюдении пациентов гастроэнтерологом и хирургом-проктологом. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

O V Knyazev

Moscow Clinical Research Center

Moscow, Russia

N A Fadeeva

Moscow Clinical Research Center

Moscow, Russia

A V Kagramanova

Moscow Clinical Research Center

Moscow, Russia

N I Belyakov

Moscow Clinical Research Center

Moscow, Russia

N V Orlova

Moscow Clinical Research Center

Moscow, Russia

A A Lishchinskaya

Moscow Clinical Research Center

Moscow, Russia

A G Konoplyannikov

Medical Radiological Research Center

Obninsk, Russia

A I Parfenov

Moscow Clinical Research Center

Email: asfold@mail.ru
Moscow, Russia

References

Supplementary files