Том 60, № 5 (2024)

Загрязнение микоплазмой перевиваемых клеточных культур и коллекционных вирусных штаммов остается серьезной проблемой в биотехнологической промышленности и экспериментальных исследованиях. Частота заражения микоплазмой культивируемых линий клеток и вирусов составляет 15–35%, в некоторых случаях доходит до 80%. Микоплазмы вызывают различные изменения в контаминированных ими культурах, вплоть до гибели клетки, обладают иммуномодулирующими свойствами, влияют на урожай некоторых вирусов, размноженных в культуре клеток. Микоплазмы не имеют клеточной стенки, способны проходить через бактериальный фильтр, имеют самый маленький геном (≈580 тыс. н.п) среди бактерий, способны к самостоятельному размножению и существованию. Эти микроорганизмы устойчивы к большинству антибиотиков, обычно используемых при культивировании клеток. Определенную эффективность в деконтаминации от микоплазм вирусных штаммов и клеточных культур показали производные группы тетрациклинов и фторхинолонов (BM-Cyclin®, Ciprobay®, Baytril®, Plasmocin®, MRA). Большое значение имеет своевременная высокочувствительная детекция и профилактика заражения микоплазмой. Для рутинного сканирования микоплазменного заражения перевиваемых клеточных культур и вирусных штаммов рекомендованы методы индикаторной клеточной культуры (цитохимический) и полимеразной цепной реакции (ПЦР), для более точного – микробиологический анализ колоний микоплазм на специальной среде.

Изучен потенциал применения новых генно-инженерных эндолизинов в качестве противомикробных агентов в отношении грамотрицательных бактерий. Для этого был получен ряд рекомбинантных лизинов на основе мурамидазы LysSi3 за счет модификации ее последовательности противомикробными пептидами из различных групп. Показана возможность получения сконструированных ферментов в рекомбинантной системе экспрессии Escherichia coli. Модификация LysSi3 позволила получить ферменты, обладающие более высокой бактериолитической активностью и скоростью действия в отношении модельного изолята Aсinetobacter baumannii по сравнению с нативным ферментом. Изучены цитотоксические свойства новых генно-инженерных лизинов на клеточных линиях HEK293 и HaCaT, и показано, что модификация LysSi3 противомикробными пептидами не приводила к значительному повышению токсического действия in vitro.

В работе показана возможность регуляции синтеза альгинатов (АЛГ) и поли-3-оксибутирата (ПОБ) культурой Azotobacter vinelandii 12 в зависимости от увеличения концентрации сахарозы в среде при разных условиях аэрации. При высоком уровне аэрации и при высокой концентрации сахарозы в среде (50 г/л) был достигнут максимальный выход свободного (1.08 г/л) и капсулярного АЛГ (2.26 г/л) в среде. В условиях низкой аэрации синтез свободного АЛГ полностью ингибировался. Максимальное значение синтеза ПОБ отмечено при среднем уровне аэрации и высокой концентрации сахарозы (50 г/л) в среде. Максимальная молекулярная масса (ММ) АЛГ составляла 477 кДа, а максимальная ММ ПОБ была значительно выше и достигала 1479 кДа. При малых концентрациях сахарозы в среде (от 5 до 20 г/л) синтезировался преимущественно капсулярный АЛГ (до 100٪ от суммы всех полимеров) при всех уровнях аэрации. При увеличении концентрации сахарозы в условиях низкой аэрации синтезировался преимущественно ПОБ (68٪), в условиях средней аэрации наблюдалось равное соотношение синтеза ПОБ и капсулярного АЛГ, в условиях высокой аэрации активно синтезировался свободный АЛГ. Показана возможность достижения избирательного синтеза АЛГ или ПОБ культурой A. vinelandii 12 за счет изменения условий ее культивирования. Полученные результаты могут быть использованы для разработки направленного биосинтеза целевых продуктов (ПОБ и АЛГ) в биотехнологии.

Впервые получены данные по влиянию факторов космического полета на взаимодействие бактериофага с бактерией – хозяином. Исследования проведены на российском сегменте МКС с использованием модельной системы Escherichia coli – бактериофаг Т7. Установлено, что лизис клеток бактериофагом в космических экспериментах, которые были проведены в первые 2 сут воздействия микрогравитации на микроорганизмы, проходил в 1.5 раза быстрее, чем в наземных. При более длительном воздействии микрогравитации на клетки E. coli они приобретали устойчивость к бактериофагу Т7, которая сохранялась в течение 2 сут после возвращения на Землю. Чувствительность к бактериофагу полностью восстанавливалась на 4–5 сут после возвращения клеток с МКС.

Полиэкстремофильные красные микроводоросли рода Galdieria, обитая в необычных для эукариот условиях горячих серных источников, обладают способностью к гетеротрофии. Показано, что в темновых условиях у модельного вида Galdieria sulphuraria не наблюдали изменения роста в присутствии этанола. При этом на свету, несмотря на проявление известного для клеток стрессорного действия этанола, происходила активизация роста микроводорослей. Усиление клеточного дыхания, наблюдающееся как в темноте, так и на свету еще до активизации роста и фотосинтеза, может указывать на действие этанола как фактора окислительного стресса. Заметное ускорение роста культуры G. sulphuraria, вероятнее всего, происходило в результате стимуляции дыхания этанолом с образованием CО₂ и его использования хлоропластами в виде дополнительного углеродного субстрата при фотосинтезе. Рост культуры G. sulphuraria на свету в присутствии этанола заметно снижен по сравнению с наблюдаемым в присутствии классического органического субстрата глюкозы. Можно предположить, что при стрессе, вызванном этанолом, на свету индуцируется система двух последовательных ключевых ферментов в цепи метаболизма первичных спиртов – алкогольдегидрогеназы и ацетальдегиддегидрогеназы, что в результате полного окисления этанола приводило бы к ускорению роста G. sulphuraria, по сравнению с фотоавтотрофной культурой.

Клетки актинобактерий Rhodococcus erythropolis 4-1, Rhodococcus erythropolis 11-2 и протеобактерий Alcaligenes faecalis 2, обладающих амидазной активностью, были иммобилизованы методом включения в структуру геля альгината бария и агарозы, а также при получении биопленок на терморасширенном графите (ТРГ). Определена операционная стабильность таких иммобилизованных биокатализаторов после хранения в замороженном и обезвоженном виде и разработан прототип кондуктометрического биосенсора на акриламид на основе такого биоселектирующего агента. Наиболее предпочтительными способами хранения иммобилизованных клеток было замораживание при температурах от –20 до –80°С, также возможно долговременное хранение во влажном состоянии при 4–25°С. Показано, что наиболее предпочтительными для биодетекции акриламида были клетки A. faecalis 2, иммобилизованные в структуре геля агарозы. Гель агарозы с иммобилизованными в его структуре бактериальными клетками обладал большей механической прочностью и устойчивостью при проведении последовательных циклов конверсии акриламида в акриловую кислоту по сравнению с гелем альгината бария. Механическая прочность геля альгината бария может быть усилена добавлением углеродных наноматериалов при иммобилизации клеток. Также перспективно выращивание биопленок на углеродных материалах, используемых для изготовления электродов. Биопленки R. erythropolis 11-2 на ТРГ способны конвертировать акриламид в акриловую кислоту более чем в 20 циклах реакции с сохранением не менее чем 50% амидазной активности.

В работе реализован метод специфического in vivo биотинилирования рекомбинантных белков M1 и B7 вируса натуральной оспы при биосинтезе в клетках СНО-К1. Для этого проводили коэкспрессию биотин-лигазы BirА и целевых генов, кодирующих эктодомены белков M1 и B7 с С-концевым avi-tag в клетках СНО-К1 в присутствии биотина в культуральной среде. Оптимальная концентрация биотина для экспрессии белков M1 и B7 составила 125 мкМ. Продукция биотинилированных рекомбинантных белков была осложнена низким выходом. Для повышения продукции целевых белков в культуральную среду добавляли низкомолекулярные энхансеры: лития ацетат, натрия вальпроат и кофеин. Энхансеры увеличивали продукцию целевого белка в 1.3–4.9 раза и не оказывали негативного влияли на выход биотинилированного белка. Наиболее высокий выход биотинилированного белка достигался при одновременном добавлении лития ацетата в концентрации 10 мМ и натрия вальпроата 2.5 мМ. Полученные таким образом белки могут быть использованы для сортировки специфических В-лимфоцитов.