Diagnostic value of urinary biomarkers excretion in estimation of morphological lesions in patients with primary glomerulopathies

Full Text

Введение

Основным методом диагностики при первичной гломерулярной патологии, позволяющим не только установить характер и выраженность морфологических изменений, но и оценить активность заболевания, прогноз течения нефропатии, скорость прогрессирования хронической болезни почек (ХБП), в настоящее время является нефробиопсия. Однако нефробиопсия является инвазивной процедурой, имеющей, хоть и в небольшом проценте случаев, серьезные осложнения. Она отражает патоморфологические изменения лишь в ограниченном объеме почечной паренхимы, не позволяет оценивать динамику патологического процесса, за редким исключением выполнения повторных биопсий [1, 2]. Чаще всего в клинической практике ориентируются на суррогатные показатели (скорость клубочковой фильтрации – СКФ, величина протеинурии и др.). Однако традиционные маркеры могут оставаться в пределах нормы и ориентировать врача на благоприятное течение болезни, в то время как гистологически отмечается развитие склеротических и атрофических процессов почечной паренхимы [3, 4].

В настоящее время все больше исследований направлено на поиск неинвазивных диагностических методик, позволяющих оценивать не только прогноз течения нефропатии, развитие терминальной почечной недостаточности, но характер и выраженность морфологических изменений в почечной паренхиме. Так, наиболее активно изучаемым направлением является оценка белкового профиля мочи («жидкостная биопсия»), основанная на применении протеомного анализа. Согласно ряду работ показано, что белковый состав мочи пациентов с ХБП значимо отличается от здоровых лиц, а также тесно ассоциирован с величиной СКФ, прогрессией ХБП, а в ряде случаев позволяет проводить дифференциальную диагностику заболеваний [5, 6]. Протеомный анализ также является основным источником новых белковых молекул, претендующих на роль биомаркеров [7, 8]. В то же время применение протеомного анализа в рутинной клинической практике затруднительно ввиду трудоемкости и дороговизны методики. Следует отметить, что исследований, которые бы связывали валидность того или иного маркера непосредственно с конкретными морфологическими изменениями, а не со скоростью прогрессирования ХБП, в особенности у пациентов с первичной гломерулярной патологией, крайне мало, а их результаты зачастую носят противоречивый характер.

В нашей работе мы остановили свое внимание на исследовании экскреции некоторых протеинов, продемонстрировавших свое диагностическое и прогностическое значение в ряде других клинических ситуаций (например, при остром повреждении почек), а также достаточно доступных для применения в рутинной клинической практике, таких как: цистатин С, липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL), α1-микроглобулин и β2-микроглобулин.

Цель исследования – изучить диагностическую значимость данных показателей в оценке степени выраженности склеротических и атрофических процессов в почечной паренхиме при первичных гломерулопатиях.

Материалы и методы

В исследование включены пациенты, находящиеся в клинике НИИ нефрологии ФГБОУ ВО «Первый СПб ГМУ им. акад. И.П. Павлова», с подтвержденным по данным нефробиопсии диагнозом первичной гломерулярной патологии.

Оценивался клинический вариант течения нефропатии, выполнялись стандартные клинические лабораторные и инструментальные методы обследования согласно стандартам для пациентов с заболеваниями почек.

Исследование уровня биомаркеров проводилось в моче, собранной за сутки накануне выполнения нефробиопсии. Биоматериал собран согласно стандартной методике. Определялись суточные экскреции с мочой цистатина С, α1-микроглобулина, β2-микроглобулина – на автоматическом биохимическом анализаторе Furuno CA-90 (Furuno Electric Co., Ltd., Япония) методом иммунотурбидиметрии – и NGAL (методом иммуноферментного анализа).

Анализ морфологических данных проводился с использованием светооптического, иммунофлуоресцентного, а также ультраструктурного исследований [9]. Патоморфологические изменения оценивались количественно (общий гломерулосклероз) и полуколичественно (тубулоинтерстициальный склероз и атрофия эпителия канальцев). Исследования проводились на базе НИЛ клинической иммунологии и морфологии НИИ нефрологии ФГБОУ ВО «Первый СПб ГМУ им. акад. И.П. Павлова» (заведующий лабораторией – кандидат медицинских наук В.Г. Сиповский).

Полный статистический анализ проведен с использованием статистических программ Statistica v.12 (Statsoft Inc., США) и MedCalc Statistical Software v.15.2 (MedCalc Software bvba, Ostend, Бельгия). Для оценки различий между двумя независимыми группами использовался U-критерий Манна–Уитни. Для оценки корреляций между количественными переменными вычислялся коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

Оценка диагностической значимости маркеров проводилась в два этапа. На I этапе анализа данных для проведения ROC-анализа, а также для выявления различий в уровне мочевой экскреции маркеров в зависимости от выраженности морфологических изменений все пациенты разделены на подгруппы по степени выраженности морфологических изменений (общего гломерулосклероза, склероза тубулоинтерстиция, атрофии эпителия канальцев): 0 – соответствовало наличию <25% исследуемых морфологических изменений биоптате; 1 – соответствовало ≥25% исследуемых морфологических изменений биоптата. На II этапе разделение пациентов на подгруппы проводилось по сходной методике, степень выраженности данных морфологических изменений соответствовала менее или более 50% выраженности.

Для качественной оценки значимости биомаркеров в диагностике морфологических изменений проводился ROC-анализ. ROC-кривые строились отдельно для каждого показателя биомаркеров относительно морфологических показателей (гломерулосклероза, тубулоинтерстициального склероза и атрофии эпителия канальцев). Определение оптимального порога отсечения (cut-off value) проводилось на основании критериев требования максимальной суммарной чувствительности и специфичности с учетом индекса Йодена. Окончательно на основании полученных результатов с учетом исследовательского характера данной работы значения p<0,05 принимались статистически значимыми.

Результаты

В исследуемую группу вошли 100 человек с первичной гломерулярной патологией: болезнь минимальных изменений – БМИ (n=9), идиопатический фокально-сегментарный гломерулосклероз – ФСГС (n=28), мембранозная нефропатия – МН (n=26) и иммуноглобулин А-нефропатия (IgA-нефропатия) (n=37). Среди них 48 (48%) женщин и 52 (52%) мужчины, 34% составили пациенты молодого возраста (от 20 до 30 лет), минимальный возраст – 18 лет, максимальный – 83 года, медиана – 39 лет.

Пациенты с МН – более старшего возраста (Me=56) по сравнению с группами больных с ФСГС (Me=36; p=0,030) и IgA-нефропатией (Me=33; p<0,001). Продолжительность заболевания одинакова среди групп пациентов с БМИ и МН и оказалась значимо меньше при МН (Me=12 мес) при сравнении с ФСГС (Me=29; p=0,027) и IgA-нефропатией (Me=48; p<0,001). На момент включения в исследование у 51 (51%) пациента диагностирован нефротический синдром (НС), у 49 (49%) – он отсутствовал. Группу с НС преимущественно – 44 (44%) человека – составили больные с непролиферативными гломерулопатиями (БМИ, ФСГС, МН), причем среди данных морфологических форм НС отмечался чаще у пациентов с БМИ.

У пациентов с БМИ (p<0,001), ФСГС (p<0,001), МН (p=0,001) при сравнении с IgA-нефропатией выявлены более высокие уровни холестеринемии, суточной протеинурии и более низкие значения общего белка и альбумина сыворотки, что объяснялось преобладанием в этих группах пациентов с НС (табл. 1).

 

Таблица 1. Основные лабораторные показатели

Table 1. Baseline laboratory characteristics

Показатель	БМИ (N=9)	ФСГС (N=28)	МН (N=26)	IgA-нефропатия (N=37)	Общая группа (N=100)	Межгруп- повые различия p
	1	2	3	4
Общий белок сыворотки крови, г/л	39	54	50	65	57	p (1/4)<0,001
Me (25–75%)	(37; 51)	(38,5; 64,5)	(41; 60)	(58; 70)	(44; 66)	p (2/4)=0,001
						p (3/4)<0,001
Альбумин сыворотки крови, г/л	11,8	26	23,5	35	29,1	p (1/2)=0,018
Me (25–75%)	(9,6; 19)	(14,05; 33)	(16; 32,5)	(30; 38)	(17; 35,8)	p (1/3)=0,018
						p (1/4)<0,001
						p (2/4)<0,001
						p (3/4)<0,001
Общий холестерин сыворотки крови, ммоль/л	11,61	7,83	8,08	5,45	7,02	p (1/3)=0,030
Me (25–75%)	(7,38; 14,33)	(6,71; 10,22)	(6,16; 10,65)	(4,98; 6,84)	(5,55; 9,00)	p (1/4)<0,001
						p (2/4)<0,001
						p (3/4)=0,001
Креатинин сыворотки крови, ммоль/л	0,063	0,115	0,102	0,092	0,101	p (1/2)=0,005
Me (25–75%)	(0,055; 0,086)	(0,083; 0,160)	(0,075; 0,114)	(0,077; 0,150)	(0,076; 0,129)	p (1/3)=0,015
						p (1/4)=0,005
СПБ, г/сут	9,54	7,20	5,59	2,30	4,82	p (1/3)=0,029
Me (25–75%)	(5,76; 13,00)	(3,89; 15,23)	(3,43; 12,00)	(1,22; 3,92)	(1,82; 10,86)	p (1/4)<0,001
						p (2/4)<0,001
						p (3/4)=0,008
СКФ (CKD-EPICr-2009), мл/мин	120,00	61,28	70,99	72,07	72,99	p (1/2)=0,002
Me (25–75%)	(88,00; 128,72)	(38,27; 86,39)	(51,01; 95,97)	(50,96; 90,24)	(50,13; 95,83)	p (1/3)=0,004
						p (1/4)=0,001
Примечание. Me (25–75%) – медиана и межквартильный размах.

 

Уровень креатининемии выше в группах с ФСГС (p=0,005), МН (p=0,015), IgA-нефропатией (p=0,005), чем при БМИ, что подтверждает представление о благоприятном течении БМИ в отношении развития и прогрессирования почечной дисфункции. Различия между морфологическими формами гломерулярной патологии по величине СКФ соответствовали результатам сравнения между группами по уровню креатинина сыворотки (т.е. величина СКФ выше при БМИ, чем при других нозологиях).

В исследуемой группе преобладали пациенты с ранними стадиями ХБП (ХБП стадии 1–2) – 65 (65%) человек. Поздние же стадии ХБП (стадии 4–5) диагностированы только в 13 (13%) случаях.

Статистически значимые прямые корреляции получены между экскрецией с мочой цистатина С (p<0,001, r=0,44), α1- и β2-микроглобулинов (p<0,001, r=0,33 и p<0,001, r=0,56 соответственно), NGAL (p<0,001, r=0,46) и суточной протеинурией. В свою очередь, уровень СКФ обратно коррелировал с концентрацией в моче цистатина С (p=0,009, r=-0,26), β2-микроглобулина (p<0,001, r=-0,35) и NGAL (p<0,001, r=-0,53).

Величина суточной протеинурии ассоциирована только с выраженностью тубулоинтерстициального склероза (r=0,24, p=0,024). При проведении ROC-анализа подтверждено, что суточная экскреция белка с мочой не отражает выраженность гломерулосклероза, а может свидетельствовать о начальных проявлениях тубулоинтерстициального склероза выраженностью до 25% и продвинутых стадий (выраженностью 50% и более) атрофии канальцевого эпителия при пороговых значениях 1,82 и 6,10 г/сут соответственно (табл. 2).

 

Таблица 2. Диагностическая значимость экскреции биомаркеров с мочой в оценке морфологических повреждений

Table 2. Diagnostic value of various urinary biomarkers excretions in assessment of morphological lesions

Суточная протеинурия, г/сут
	ПЗ СПБ	ЧВ, %	СП, %	ДТ, %	AUC	ППЦ	ОПЦ	ПОП	ООП	p
ТИ склероз 25%	1,82	81,8	48,4	70,3	0,684	75,4	57,7	1,58	0,38	0,002
Атрофия канальцев 50%	6,10	51,4	73,2	64,8	0,626	54,5	70,7	1,92	0,66	0,036
Суточная экскреция цистатина С с мочой, мг/сут
ТИ склероз 25%	319,9	65,0	74,9	68,1	0,662	83,0	52,3	2,52	0,47	0,005
Суточная экскреция NGAL с мочой, нг/сут
Гломерулосклероз 25%	1445,4	90,6	56,3	73,4	0,743	67,40	85,7	2,07	0,17	<0,001
Атрофия канальцев 50%	4897,8	81,8	64,3	70,3	0,739	54,5	87,1	2,29	0,28	<0,001
Суточная экскреция α1-микроглобулина с мочой, мг/сут
ТИ склероз 25%	10,94	66,7	77,4	70,3	0,763	85,1	54,5	2,95	0,43	<0,001
Суточная экскреция β2-микроглобулина с мочой, мкг/сут
ТИ склероз 25%	0,224	60,0	84,0	68,2	0,691	87,8	52,0	3,72	0,48	<0,001
Атрофия канальцев 25%	0,224	51,3	92,3	58,3	0,695	97,6	24,0	6,67	0,53	0,002
Гломерулосклероз 50%	0,224	89,5	66,7	71,5	0,760	41,5	96,0	2,68	0,16	<0,001
ТИ склероз 50%	0,240	69,2	66,2	67,0	0,668	45,0	84,3	2,05	0,47	0,011
Примечание. ТИ – тубулоинтерстициальный склероз, СПБ – суточная потеря белка, г/сут, p – уровень статистической значимости, ПЗ – пороговое значение показателя, ЧВ – чувствительность, СП – специфичность, ДТ – диагностическая точность, AUC – площадь под ROC-кривой, ПОП – положительное отношение правдоподобия, ООП – отрицательное отношение правдоподобия, ППЦ – положительная прогностическая ценность, ОПЦ – отрицательная прогностическая ценность.

 

По результатам линейного корреляционного анализа выявлены следующие ассоциации между величиной экскреции биомаркеров и морфологическими изменениями:

• экскреция цистатина С с мочой коррелировала с выраженностью тубулоинтерстициального склероза (p=0,024, r=0,24);
• экскреция α1-микроглобулина с мочой – с выраженностью тубулоинтерстициального склероза (p<0,001, r=0,37);
• экскреция β2-микроглобулина с мочой – с выраженностью гломерулосклероза (p=0,001, r=0,34), тубулоинтерстициального склероза (p=0,001, r=0,33) и атрофией эпителия канальцев (p=0,002, r=0,32);
• экскреция NGAL с мочой – с выраженностью гломерулосклероза (p<0,001, r=0,48) и атрофией эпителия канальцев (p=0,002, r=0,39).

Анализ диагностической значимости исследуемых биомаркеров в отношении предикции морфологических изменений представлен в табл. 2 и на рис. 1.

 

 

Примечание. А – тубулоинтерстициальный склероз выраженностью 25%, Б – тубулоинтерстициальный склероз выраженностью 50%, В – атрофия эпителия канальцев выраженностью 25%, Г – атрофия эпителия канальцев выраженностью 50%, Д – гломерулосклероз выраженностью 25%, Е – гломерулосклероз выраженностью 50%.

Рис. 1. ROC-кривые с 95% доверительным интервалом (пунктирные линии) для различных биомаркеров относительно морфологических изменений

Fig. 1. ROC-curves with 95% confidence interval of AUC of various biomarkers in prediction of morphological lesions.

 

При проведении ROC-анализа установлено, что цистатин С и α1-микроглобулина мочи обладают диагностической ценностью только в отношении тубулоинтерстициального склероза. При нарастании экскреции цистатина С более 319,9 мг/сут, а α1-микроглобулина – более 10,94 мг/сут можно с достаточно высокой вероятностью говорить о наличии склероза тубулоинтерстиция в нефробиоптате 25% выраженности и более. Экскреция β2-микроглобулина, равная 0,224 мкг/сут, обладала предиктивной способностью в отношении гломерулосклероза выраженностью 50%, тубулоинтерстициального склероза и атрофии канальцев выраженностью 25%, а при нарастании экскреции более 0,240 мкг/сут данный маркер свидетельствовал о наличии тубулоинтерстициального склероза выраженностью 50%.

По результатам ROC-анализа NGAL мочи не обладал прогностической ценностью в отношении тубулоинтерстициального склероза, но являлся высокочувствительным маркером гломерулосклероза в 25% (экскреция NGAL менее 1445,4 нг/сут с достаточно высокой достоверностью может свидетельствовать об отсутствии в нефробиоптате гломерулосклероза выраженностью 25%). В случае экскреции NGAL менее 4897,9 нг/сут можно говорить об отсутствии в биоптате атрофии канальцев 50% выраженности.

Обсуждение

В настоящее время накоплена доказательная база в отношении ряда биомаркеров (NGAL, α1-, β2-микроглобулины, цистатин С, уромодулин и др.), использующихся в ранней диагностике ХБП, а также в отношении возможности применения данных показателей в качестве прогностических параметров, позволяющих оценить течение нефропатии и ее исходы [10–17]. В то же время основным суррогатным показателем, относительно которого построена основная часть таких работ, являются величина СКФ и динамика ее снижения. Однако в ряде клинических ситуаций темпы снижения СКФ «запаздывают» по отношению к тем необратимым морфологическим изменениям, которые уже имеются в почечной паренхиме. Это происходит вследствие того, что оставшиеся неповрежденными клубочки берут на себя функцию «погибших» нефронов, что приводит к развитию гиперфильтрации в каждом отдельно взятом клубочке, и тем самым общее функциональное состояние почек, оцененное по СКФ, остается в пределах нормы.

Согласно результатам исследований, установлено, что высокий уровень протеинурии ассоциирован с более выраженными морфологическими повреждениями при IgA-нефропатии, а в настоящее время данный тезис превратился в аксиому, которую практический врач использует в клинике не только для IgA-нефропатии, но и в отношении других видов гломерулярной патологии [15, 18]. В то же время существует мнение о том, что традиционные маркеры, в том числе суточная протеинурия, СКФ, могут оставаться в пределах нормы и свидетельствовать о благоприятном течении болезни, тогда как гистологически при этом формируются склеротические изменения как гломерул, так и тубулоинтерстиция [3].

Данные обстоятельства послужили основанием для использования в нашей работе несколько иного подхода, а именно оценке валидности ряда биомаркеров в отношении развития склеротических и атрофических процессов в почечной паренхиме, лежащих в основе прогрессирования ХБП.

Анализ полученных нами данных показал, что уровень суточной протеинурии обладал весьма умеренной диагностической значимостью в отношении начальных проявлений тубулоинтерстициального склероза и поздних проявлений атрофии канальцевого эпителия, что позволяет использовать ее в качестве скринингового теста на начальном этапе обследования пациента с первичной гломерулярной патологией для суждения о наличии данных морфологических изменений.

Среди большого числа исследований, посвященных исследованию предикторной роли экскреции с мочой α1-, β2-микроглобулинов, а также цистатина С, показано, что данные маркеры могут выступать надежными показателями прогрессирования почечной дисфункции лишь при МН [13, 19–21]. В отношении же предикции морфологических изменений существуют единичные работы, указывающие на возможную ассоциацию экскреции α1- и β2-микроглобулинов и тубулоинтерстициального повреждения [20, 21]. В то же время у пациентов с IgA-нефропатии данные факты не подтверждены [14, 22].

По результатам проведенного нами исследования показано, что α1-микроглобулин и цистатин С ассоциированы с начальными признаками тубулоинтерстициального склероза. Наиболее универсальным маркером оказался β2-микроглобулин, позволяющий оценить не только склероз тубулоинтерстиция различной степени выраженности, но и отражающий начальные проявления атрофии канальцевого эпителия. Тесная взаимосвязь между увеличением экскреции данных низкомолекулярных белков с состоянием тубулоинтерстициального компартмента нефрона, вероятнее всего, может быть объяснена существующим патофизиологическим представлением о непосредственном участии клеток эпителия проксимальных канальцев в реабсорбции α1-, β2-микроглобулинов и цистатина С посредством кубилин-мегалинопосредованного эндоцитоза [23].

Традиционно принято считать, что экскреция NGAL с мочой является предиктором прогрессирования ХБП и развития терминальной почечной недостаточности [11, 24, 25]. Также в единичных работах продемонстрирована связь NGAL с морфологическими повреждениями, характеризующими хронические изменения, прежде всего тубулоинтерстициальный склероз и тубулярную атрофию [26, 27].

В одной из наших ранних работ мы подчеркивали выявленную на меньшей группе пациентов связь экскреции NGAL с мочой с выраженностью гломерулосклероза [28]. Данное обстоятельство подтверждено и в настоящем исследовании. Так, NGAL мочи оказался единственным из исследованных нами маркеров, обладающим диагностической значимостью в отношении ранних признаков гломерулосклероза при пороговом значении 1445,4 нг/сут, а нарастание его концентрации в моче более 4897,8 нг/сут свидетельствовало о продвинутой степени атрофии эпителия канальцев. Если принимать во внимание сложную кинетику NGAL, повышение его концентрации в моче может быть обусловлено как нарушением его реабсорбции, так и непосредственным увеличением продукции в дистальном отделе нефрона. Полученные нами данные об ассоциации гломерулосклероза, атрофии канальцевого эпителия и экскреции NGAL с мочой позволяют предполагать, что нарушение реабсорбции NGAL в эпителиоцитах проксимальных канальцев, обусловленное ишемией данного отдела нефрона из-за прогрессирующего гломерулосклероза, играет ключевую роль в увеличении экскреции данного пептида с мочой. В пользу данного обстоятельства говорят также и результаты экспериментальных работ, свидетельствующие о снижении продукции мРНК NGAL в почках по мере формирования фиброза тубулоинтерстиция и атрофии эпителиоцитов [29].

Заключение

Полученные результаты исследования позволяют говорить о том, что комплексная оценка наличия склеротических и атрофических изменений в почечной паренхиме, в том числе при динамическом наблюдении пациента с первичной гломерулярной патологией, может проводиться с использованием как набора традиционных (СКФ, уровень суточной протеинурии), так и экскреции специфических биомаркеров (α1-, β2-микроглобулины, цистатин С, NGAL) с целью осуществления всестороннего персонализированного подхода, а также оценки прогноза течения нефропатии. Кроме того, оценка панели различных маркеров может быть использована и в тех клинических ситуациях, когда проведение нефробиопсии затруднено.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interest.

Список сокращений

БМИ – болезнь минимальных изменений

МН – мембранозная нефропатия

НС – нефротический синдром

СКФ – скорость клубочковой фильтрации

ФСГС – фокально-сегментарный гломерулосклероз

ХБП – хроническая болезнь почек

IgA – иммуноглобулин А

NGAL – липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов

About the authors

Elena S. Saganova

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Author for correspondence.
Email: nephrolog1985@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9850-1107

канд. мед. наук, врач-нефролог

Russian Federation, Saint Petersburg

Irina M. Zubina

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: nephrolog1985@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8491-7016

канд. биол. наук, ст. науч. сотр.

Russian Federation, Saint Petersburg

Evdokiia O. Bogdanova

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: nephrolog1985@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1969-1959

канд. биол. наук, науч. сотр.

Russian Federation, Saint Petersburg

Olga V. Galkina

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: nephrolog1985@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7265-7392

канд. биол. наук, зав. лаб. биохимического гомеостаза

Russian Federation, Saint Petersburg

Vasilii G. Sipovskii

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: nephrolog1985@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1512-8037

канд. мед. наук, зав. лаб. морфологии и клинической иммунологии

Russian Federation, Saint Petersburg

Aleksei V. Smirnov

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: nephrolog1985@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7863-9080

д-р мед. наук, проф., дир.

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files