Diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura

Full Text

ГУС – гемолитико-уремический синдром

ИФА – иммуноферментный анализ

КТ – компьютерная томография

МРТ – магнитно-резонансная томография

СКВ – системная красная волчанка

ТМА – тромботическая микроангиопатия

ТТП – тромботическая тромбоцитопеническая пурпура

ЭДТА – этилендиаминтетраацетат

ЭЭГ – электроэнцефалография

ADAMTS13 (A Disintegrin and Metalloprotease with ThromboSpondin type 1 repeats, member 13) – металлопротеиназа, принадлежащая к семейству пептидазных белков ADAM

Dnp – 2,4-динитрофенильная группа

FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) – флуоресцентный (ферстеровский) резонансный перенос энергии

GST (Glutathione S-transferase) – глутатион S-трансфераза

Ig – иммуноглобулин

Nma – 2-(N-метил-амино) бензольная группа

SDS – додецилсульфат натрия

TLR-9 (toll-like receptor 9) – толл-подобный рецептор

vWF (von Willebrand factor) – фактор фон Виллебранда

 

В основе патогенеза тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТП) лежит отсутствие или недостаточная активность металлопротеиназы ADAMTS13 (A Disintegrin and Metalloprotease with ThromboSpondin type 1 repeats, member 13) – плазменного белка, регулирующего взаимодействие тромбоцитов с фактором фон Виллебранда (von Willebrand factor – vWF). ADAMTS13 – это металлопротеиназа, принадлежащая к семейству пептидазных белков ADAM (A Disintegrin And Metalloproteinase). Металлопротеиназа ADAMTS13 выделена в 1996 г., а клонирована и идентифицирована как ADAMTS13 в 2001 г. Ген ADAMTS13 локализуется на длинном плече хромосомы 9 в локусе 9q34, занимает 37 kb и содержит 29 экзонов [1]. Синтез ADAMTS13 происходит в звездчатых клетках печени, надпочечниках, подоцитах и почечных тубулярных эпителиальных клетках, а также в тромбоцитах и эндотелиальных клетках.

N-концевая область ADAMTS13 содержит металлопротеиназный и дезинтегрин-подобный домены, фрагмент тромбоспондина 1 типа, Cys-богатый и спейсерный домены [2]. C-концевой фрагмент ADAMTS13 содержит 7 дополнительных повторов тромбоспондина 1-го типа (Т2–Т8) и два CUB-домена (рис. 1, см. на цветной вклейке).

Рис. 1. Структура ADAMTS13. Примечание. Met - металлопротеиназный домен, Dis - дезинтегрин-подобный домен, CysR (Cysteine Rich) - богатый цистеином домен, Spa (Spacer) - спейсерный домен, CUB-домены, Т1-Т8 - повторы тромбоспондина 1 типа.

Плазменная концентрация ADAMTS13 в норме колеблется 0,7 до 1,4 мкг/мл, период полужизни АDAMTS13 – около 2–3 дней [2]. Биологическая роль ADAMTS13 заключается в отщеплении фрагментов от мультимерной молекулы vWF для регулирования чрезмерной его активности.

С-концевой фрагмент ADAMTS13, состоящий из повторов тромбоспондина 1 типа и CUB-доменов, связывается с глобулярной формой vWF. Тромбоспондин 1 типа и CUB-домены специфично распознают vWF в циркуляции и связываются с эпитопом D4-CK фрагмента vWF. С-концевые повторы тромбоспондина 1 типа ADAMTS13 взаимодействуют с поверхностным рецептором CD36 эндотелиальных клеток. Такое взаимодействие может усиливать протеолитическое расщепление сверхкрупных мультимеров vWF в месте его высвобождения [3]. Повторы тромбоспондина 1 типа ADAMTS13 содержат свободные тиолы, которые реагируют со свободными тиолами на поверхности сверхкрупных мультимеров vWF, подвергнутых воздействию силы сдвига жидкости. Это препятствует образованию дисульфидных связей между двумя мультимерами vWF в условиях высокого напряжения сдвига жидкости, ослабляя тем самым опосредованную vWF адгезию и агрегацию тромбоцитов [3]. Таким образом, повторы 2–8 тромбоспондина 1 типа и CUB-домены влияют на протеолиз vWF [4, 5].

N-концевой фрагмент ADAMTS13 необходим для протеолиза Tyr1605-Met1606 связи в А2-домене vWF. Находящийся на N-концевом фрагменте металлопротеиназный домен ADAMTS13 сам по себе не имеет вовсе или обладает незначительной протеолитической активностью в отношении vWF. Однако в совокупности дезинтегрин-подобный домен – Dis и металлопротеиназный домен – Met (рис. 2, см. на цветной вклейке) составляют единую функциональную единицу [3], повышающую способность ADAMTS13 расщеплять vWF. Богатый цистеином домен (CysR) и спейсерный домен (Spa) участвуют в распознавании vWF. Первый повтор тромбоспондина 1 типа ADAMTS13 связывается непосредственно с регионом, состоящим из 73 аминокислотных остатков vWF, обозначаемым как VWF73 [2, 6].

Рис. 2. Переход в результате активации ADAMTS13 из закрытой конформации (спейсер связан с CUB-доменами) в открытую конформацию.

Важную роль в функционировании ADAMTS13 играют конформационные изменения. Взаимодействие CUB-доменов и спейсерного домена приводит к образованию закрытой конформации ADAMTS (см. рис. 2), препятствующей контакту спейсерного экзосайта протеиназы с комплементарным участком связывания на А2-домене vWF [4]. Закрытой конформацией можно объяснить низкую иммуногенность металлопротеиназы ADAMTS13, вводимой со свежезамороженной плазмой больным врожденной формой ТТП [3]. При конформационной активации ADAMTS13, которая происходит при повышенном содержании vWF, взаимодействие CUB-доменов и спейсерного домена нарушается под действием С-концевого домена vWF [4]. Открытая конформация ADAMTS13 выявляется при обострении ТТП, а закрытая – при ремиссии заболевания [7]. Активация АDAMTS13 с переходом в открытую конформацию выявляет скрытый (внутренний) эпитоп в спейсерном домене и обнажает аутоантигенное ядро для ингибитора ADAMTS13 при приобретенной ТТП [4]. Большинство больных приобретенной ТТП имеют антитела против спейсерного домена ADAMTS13 [8].

vWF в виде сверхкрупных молекул содержится в тельцах Вайбеля–Паладе эндотелиальных клеток, в тромбоцитах. vWF выделяется клетками в области сосудистого повреждения и оказывает протромботический эффект, усиливая адгезию и агрегацию тромбоцитов на поверхности эндотелиальных клеток. Наибольший протромботический эффект оказывают сверхкрупные мультимеры молекулы vWF, связывающиеся с GP1b-рецепторами тромбоцитов, в норме их в циркуляции не обнаруживают, поскольку сразу после секреции vWF связывается с ADAMTS13, который присоединяется к его А2-домену и расщепляет мультимеры vWF на малые молекулы. Дефицит ADAMTS13 возникает вследствие недостаточного его синтеза, нарушения протеолитической активности или повышенной деградации. В результате низкой активности ADAMTS13 мультимеры vWF не расщепляются. Мультимеры vWF, секретируемые эндотелиальными клетками, связываются с тромбоцитами даже при низком напряжении сдвига, формируя агрегаты, которые окклюзируют артериолы по току крови. Агрегаты, состоящие из тромбоцитов и vWF, формируются также прямо в резистентных сосудах, в которых имеется высокое напряжение сдвига. Потребление тромбоцитов в агрегаты приводит к тромбоцитопении, достаточно потребиться 10–20 мл циркулирующих тромбоцитов, чтобы появилась тромбоцитопения [9].

Тромбы при ТТП вызывают частичную окклюзию сосудов, позволяя эритроцитам проскальзывать мимо них [10]. Эритроциты, перемещаясь по ригидным окклюзированным сосудам, подвергаются разрушению, что приводит к механическому гемолизу и появлению шистоцитов. Кроме того, мультимеры vWF сами по себе способствуют образованию шистоцитов. Напряжение сдвига жидкости ведет к латеральному взаимодействию мультимеров vWF, что приводит к образованию волокон. ADAMTS13 расщепляет данные связи, при дефиците ADAMTS13 эти волокна перекрывают просвет сосудов, и, проходя через них, эритроциты фрагментируются, образуя шистоциты [11].

Образующиеся при ТТП тромбы состоят из тромбоцитов и vWF, в них содержится небольшое количество фибрина, поскольку в процессе тромбообразования при ТТП не происходит активации свертывания и отложения фибрина [9]. Тромбы при ТТП возникают во всех тканях, но редко образуются в легких и печени, поскольку циркуляция крови в этих органах происходит в условиях низкого напряжения сдвига, недостаточного для усиления связывания vWF с тромбоцитами. Повреждения наблюдаются часто в таких органах, как сердце, поджелудочная железа, почки, мозг, где больше кровоток, выше напряжение сдвига, однако в этих органах, как правило, формируются относительно небольшие зоны некрозов [12]. Это свидетельствует о том, что повреждения при ТТП персистируют недолго и этого времени недостаточно для формирования некрозов. Транзиторной окклюзией объясняется и перемежающаяся неврологическая симптоматика, часто возникающая у больных ТТП.

Клинические проявления ТТП возникают при уменьшении плазменной активности ADAMTS13<10%. Однако у некоторых больных, даже в состоянии гематологической ремиссии, может не быть клинических проявлений заболевания, несмотря на активность ADAMTS13<10%. Подобный феномен регистрируется прежде всего при врожденной форме ТТП, причиной которой является мутация гена ADAMTS13, но даже при наличии мутации нередко необходим триггер, провоцирующий возникновение заболевания. При иммуноопосредованной форме ТТП в большинстве случаев находят провоцирующие факторы.

Системная красная волчанка (СКВ) может явиться причиной возникновения приобретенной формы ТТП. У части больных СКВ течение заболевания осложняется ТТП и, наоборот, у больных с ТТП могут возникнуть нарушения, характерные для СКВ. Частота аутоиммунных нарушений, выявляемых у больных ТТП, среди которых СКВ, синдром Шегрена, аутоиммунный тиреоидит, синдром Рейно, антифосфолипидный синдром, псориаз и другие, составляет 21,5% [13].

Алкоголь стал триггером появления первых симптомов ТТП в 10% случаев у больных врожденной формой ТТП [14].

Беременность – один из наиболее частых триггеров ТТП. При беременности даже в физиологических условиях происходят повышенное высвобождение vWF и уменьшение активности ADAMTS13. Даже у здоровых беременных женщин активность ADAMTS13 к концу срока гестации уменьшается, составляя 29–87% (в среднем 68%) к 36–40-й неделе гестации, 22–89% (в среднем 52%) в раннем послеродовом периоде [15, 16]. Подобные изменения при наличии предрасположенности, в частности мутации гена ADAMTS13, способствуют появлению клинических проявлений ТТП [17]. В 10 (24%) из 42 случаев ТТП у беременных установлена врожденная форма заболевания [18].

Воспаление, инфекция, травма, хирургическое вмешательство также являются триггерами ТТП. Воспаление способствует эндотелиальному повреждению и секреции vWF [9]. Инфекция, преимущественно грамотрицательной этиологии, выявлена у 41% больных ТТП [19]. Описаны случаи развития ТТП с продукцией антител к ADAMTS13, вызванные Acinetobacter baumannii [20], вирусной инфекцией (вирусом гепатита С, цитомегаловирусом, вирусом простого герпеса) [21], грамположительной флорой [19, 21]. Инфекция приводит к активации толл-подобных рецепторов (toll-like receptor 9 – TLR-9), распознающих ДНК бактерий и вирусов и активирующих иммунный ответ, в том числе продукцию воспалительных цитокинов. Генотипы ТLR-9 +2848 G и TLR-9 +1174 A (функциональный полиморфизм TLR-9) чаще выявляются у больных ТТП, чем у здоровых лиц [19]. Воспаление также приводит к окислительному стрессу, который усиливает адгезию тромбоцитов, модифицируя vWF и ADAMTS13 [9].

Эпидемиология ТТП

В США ежегодно выявляется 3,1 случая ТТП на 1 млн населения, а с учетом больных в ремиссии инцидентность составляет 19 случаев на 1 млн населения [22]. Во Франции распространенность ТТП – 13 человек на 1 млн населения [23]. Соотношение «мужчины:женщины» – 1:2, пик заболеваемости – младше 50 лет (медиана возраста – 43 года) [23, 24]. Врожденная форма ТТП выявляется в 2,7% случаев, приобретенная форма – в 97,3% [23]. В Российской Федерации данные о заболеваемости ТТП отсутствуют.

Классификация ТТП

ТТП подразделяется на врожденную формы (синдром Апшоу–Шульмана) и иммунноопосредованную (рис. 3).

Рис. 3. Классификация ТТП [55].

Врожденная форма ТТП, или синдром Апшоу–Шульмана, – это генетически детерминированное аутосомно-рецессивное заболевание, при котором «дефектный» ген ADAMTS13 унаследован от обоих родителей, но не содержится в половых хромосомах [1]. Врожденная форма ТТП обычно манифестирует в неонатальном периоде тромбоцитопенией и анемией, желтухой. После обменных переливаний крови, трансфузий плазмы ремиссия может быть достигнута на длительный срок, а рецидивы заболевания провоцируются вакцинацией, инфекцией, хирургическими вмешательствами и т.д. Встречается хроническая рецидивирующая форма заболевания, при которой рецидивы возникают каждые 3–4 нед. У некоторых пациентов синдром Апшоу–Шульмана манифестирует впервые только во взрослом возрасте после воздействия различных триггеров, прежде всего – беременности. По данным японских авторов [25], из 43 пациентов с врожденной формой ТТП в 58% случаев заболевание манифестировало в детском возрасте, в 35% – в возрасте от 15 до 45 лет и в 7% – возрасте от 51 до 63 лет. У 9 (36%) из 25 пациентов с синдромом Апшоу–Шульмана женского пола диагноз установлен впервые только во время беременности [25]. По данным Французского референсного центра тромботической микроангиопатии (ТМА) [23] за период с 1999 по 2013 гг., из 772 пациентов с ТТП, манифестировавшей во взрослом возрасте, врожденная форма заболевания диагностирована у 21 (2,7%) пациента. На фенотип синдрома Апшоу–Шульмана влияет резидуальная плазменная активность ADAMTS13: выявление активности в плазме ADAMTS13 менее 2,74% позволяет выделить пациентов, у которых высок риск возникновения клинических симптомов ТТП в возрасте до 18 лет, а при активности менее 1,61% – пациентов с частыми, более 1 раза в год, рецидивами [26].

При синдроме Апшоу–Шульмана чаще всего выявляют миссенс-мутации, реже нонсенс-мутации, вставки или делеции нуклеотидов, мутации сплайсинга. Некоторые мутации могут приводить к нарушению секреции ADAMTS13, в этом случае будут наблюдаться как низкая плазменная активность ADAMTS13, так и низкая концентрация антигена ADAMTS13 в крови. При других мутациях секреция ADAMTS13 не нарушена, но секретируемый фермент обладает низкой протеиназной активностью, в этих случаях низкая плазменная активность ADAMTS13 будет сочетаться с нормальной или незначительно сниженной концентрацией антигена ADAMTS13 [27]. В международном регистре врожденной формы ТТП на конец 2017 г. содержалась информация о 123 больных, из Европы (55 человек), Азии (52 человека, из них 47 – из Японии), Америки (14 человек) и Африки (2 человека). Среди 98 выявленных различных мутаций гена ADAMTS13 в 245 аллелях верифицированы 67 миссенс-мутаций, 12 нонсенс-мутаций, 21 frameshift-мутация (инсерция или делеция одного или нескольких нуклеотидов, приводящая к сдвигу белковой рамки считывания) и 8 мутаций сайта сплайсинга. Наиболее частые мутации гена ADAMTS13 c.4143_4144dupA (на 60/246 аллелей).

Выявлено большее число носителей ADAMTS13 c.4143_4144dupA в компаунд-гетерозиготном, чем гомозиготном состоянии, у которых заболевание дебютировало в возрасте до 3 мес (50% против 37%), несмотря на то, что активность ADAMTS13<1% наблюдалась у 18 из 20 гомозиготных носителей мутации и только у 8 из 14 компаундов [14]. Эту мутацию наиболее часто обнаруживали у жителей северной Европы и Норвегии, распространенность в этих регионах в популяции 0,04–0,33% [28].

Мутация 3178C>T (p.Arg1060Trp) [13/245 аллелей] в TSP7-домене приводит к нарушению секреции ADAMTS13. Частота ее встречаемости в Европе, Северной Америке и Турции составляет около 1% [18, 28, 29]. Эта мутация выявляется у 80% во французской когорте и 74% в английской когорте пациентов с синдромом Апшоу–Шульмана и ассоциируется с активностью ADAMTS13 от 3 до 6% у компаундов и 5–12% – у гомозиготных носителей мутации [26]. Замена p.Arg1060Trp во всех проанализированных случаях сочеталась с полиморфными вариантами p.Arg7Trp и p.Ala1033Thr, что свидетельствует о ее монофилетическом происхождении [29, 30].

Несколько неожиданные результаты получены в работе, посвященной направленному поиску этой мутации у больных с поздним проявлением ТТП [30]. Она выявлена у 6 (11%) из 53 пациентов, в одном случае в гомозиготном состоянии и в остальных случаях – в гетерозиготном. При полном анализе гена ADAMTS13 у гетерозиготных носителей R1060W никаких других очевидных мутаций не найдено, но у 3 из них выявлены антитела, специфичные к ADAMTS13, что может объяснить проявление болезни. Предполагается, что эта мутация сама по себе не приводит к клиническим проявлениями ТТП, и заболевание клинически манифестирует при воздействии каких-либо других триггерных факторов. Эти факторы могут иметь как негенетическую природу (беременность, инфекция), так и генетическую, например сочетание мутантного аллеля гена ADAMTS13 с его «нормальным» аллелем, несущим функциональные полиморфизмы Q448E и P618A [31].

Еще одна мажорная мутация c.577C>T или Arg193Trp (11/246 aллелей) выявлена как в европейской, так и в японской и китайской популяциях и остается одной из наиболее распространенных в Азии [14, 32].

Из других мутаций отмечают замену остатка триптофана (Trp³⁹⁰) на аланин Trp390Ala (W390А) в ключевом мотиве ³⁸⁷TrpXXTrp³⁹⁰ ADAMTS13, снижающую секрецию белка, его аффинность к vWF и протеиназную активность [33].

Синдром Апшоу–Шульмана следует заподозрить у пациента с клиническими проявлениями ТМА, у которого не определяется или очень низкая активность ADAMTS13, не выявляются ингибирующие ADAMTS13 антитела, диагноз установлен в детском возрасте, либо заболевание дебютировало у женщины во время первой беременности [34].

Иммуноопосредованная ТТП – это приобретенная форма ТТП, в основе патогенеза которой лежит появление антител к ADAMTS13. Различают первичную и вторичную иммуноопосредованную ТТП. Первичная иммуноопосредованная ТТП – приобретенная форма ТТП, при которой не находят заболеваний или причин, вызвавших образование аутоантител анти-ADAMTS13. Вторичная иммуноопосредованная ТТП – приобретенная форма ТТП, при которой не выявляются заболевания (СКВ, ВИЧ, инфекция и др.) или причины (беременность, препараты и др.), приведшие к образованию антител анти-ADAMTS13 (см. рис. 3).

Клинические проявления ТТП

Клиническая картина ТТП характеризуется острым началом в виде различных симптомов и синдромов, составляющих классическую пентаду, описанную в 1966 г. E. Amorosi и J. Ultman [35]: лихорадка, тромбоцитопения, микроангиопатическая гемолитическая анемия, почечная дисфункция, неврологические нарушения [36]. Однако все эти признаки в совокупности встречаются лишь у 7% пациентов.

Лихорадка регистрируется у 28% пациентов при обострении заболевания, температура тела поднимается выше 37,5ºС, не связана с инфекцией [24].

Тромбоцитопения при обострении заболевания выявляется у всех пациентов, носит неиммунный характер и обусловлена потреблением тромбоцитов. Тромбоцитопения, как правило, выражена (10¥10⁹/л – 30¥10⁹/л), менее выраженная тромбоцитопения (>30¥10⁹/л) характерна для других форм ТМА [22, 23, 37]. Клинически тромбоцитопения проявляется геморрагическим синдромом у 46% пациентов в виде носовых кровотечений, синяков, петехий, десневых кровотечений, гематурии, меноррагий, кровоизлияний в сетчатку, кровохарканья [24, 38].

Микроангиопатическая гемолитическая анемия – в острой стадии ТТП встречается у всех больных, может сопровождаться желтухой [38].

Неврологические расстройства обнаруживаются у 40–88% пациентов и проявляются от незначительных расстройств до серьезных нарушений [12, 24, 36, 39, 40]. Головная боль регистрировалась у 25–42% пациентов, когнитивные нарушения – у 28%, фокальный дефицит – 24–29,7%, обмороки – у 11–12%, судороги – у 8–36,9%, потеря зрения – у 6,3–8%, инсульт – у 6%, гемипарез – у 12,7%, кома – у 4–12% [24, 39, 41]. Неврологические симптомы чаще всего обусловлены ишемией, но могут быть вызваны и кровоизлияниями. У пациентов с ТТП нарушение сознания по шкале ком Глазго менее 14 баллов ассоциируется с 9-кратным увеличением смертности по сравнению с теми, у которых нет нарушения сознания (20% против 2,2%) [42]. Неврологические нарушения при ТТП возникают чаще, чем при гемолитико-уремическом синдроме (ГУС), при котором они встречаются у 55% пациентов [12].

Почечная дисфункция возникает у 10–75% лиц с ТТП [14, 24, 43], как правило, нетяжелая, чаще встречается у пожилых [36]. Креатинин у большинства пациентов колеблется от 0,9 до 1,4 мг/дл. У 58,7% больных развивается острое повреждение почек [43]. У 27,4% пациентов развивается нефротический синдром, гематурия выявляется у 6–41,3%, лейкоцитурия – у 36,4%, олигурия/анурия – у 3%. Поражения почек при ТТП возникают значительно реже, чем при ГУС, при котором поражение почек и острая почечная недостаточность выявляются соответственно в 100 и 90% случаев [12].

Помимо классической пентады у пациентов с ТТП выявляют поражение и других органов.

Признаки поражения сердца обнаруживают у 24% пациентов с ТТП [39], инфаркт миокарда – у 4,2–15,3% [14, 44].

Поражение желудочно-кишечного тракта. На боли в животе, как на один из первых симптомов ТТП, жалуются 23,5–25% пациентов [24, 45], на диарею – 14% [24]. Клинически панкреатит вследствие ТТП диагностируется редко [46], однако при аутопсии поражение поджелудочной железы выявляется в 96% в отличие от ГУС, при котором поражение поджелудочной железы выявляют в 23% случаев [12].

Диагноз ТТП основывается на совокупности клинических симптомов и изменений лабораторных показателей, характерных для всех форм ТМА (микроангиопатическая гемолитическая анемия, тромбоцитопения, органная дисфункция), а также выявлении менее 10% активности в плазме крови ADAMTS13 [38, 47–49]. Диагноз ТТП является экстренным, поскольку даже при подозрении на ТТП необходимо незамедлительно начать лечение. Предварительный диагноз ТТП устанавливается на основании анамнеза, клинической картины и рутинных лабораторных тестов [38, 49].

Жалобы пациента могут носить разнообразный характер. Часто первыми симптомами являются лихорадка, не связанная с инфекцией, слабость. Неврологические симптомы обнаруживаются 44% пациентов, выраженность их может быть разной: от головных болей и головокружения до судорог и очагового неврологического дефицита, гемипареза, дезориентации, когнитивных расстройств, афазии [35, 45]. На боли в животе жалуются 23,5% пациентов, боли могут сопровождаться тошнотой или рвотой. У каждого 10-го пациента на коже и слизистых оболочках появляются экхимозы и петехии, отмечается гематурия [45].

При физикальном обследовании выявляют геморрагический синдром, петехиальные кровоизлияния на коже и слизистых, бледность, иногда желтушность кожных покровов вследствие гемолиза. Несмотря на боли в животе, при пальпации нет симптомов раздражения брюшины. Могут быть зафиксированы фокальный неврологический дефицит, гемипарез, мышечная слабость с вовлечением одной или более конечностей, парез лицевого нерва [50], дезориентация, судороги, когнитивные нарушения, нарушения сознания различной степени тяжести вплоть до комы [41].

Лабораторная диагностика ТТП

Лабораторная диагностика ТТП (табл. 1) основана на выявлении неиммунной микроангиопатической гемолитической анемии, неиммунной тромбоцитопении, активности в плазме ADAMTS13<10%, обнаружении или отсутствии ингибитора в плазме ADAMTS13, обнаружении или отсутствии мутаций гена ADAMTS13.

Таблица 1. Лабораторное обследование, рекомендуемое пациентам с подозрением на ТТП
Лабораторный тест	Значения при ТТП
Концентрация гемоглобина	Анемия
Ретикулоциты	Повышенное количество
Шистоциты	Обнаруживаются
Прямая проба Кумбса	Отрицательная
Концентрация лактатдегидрогеназы	Выше нормы в 1,5 раза
Концентрация гаптоглобина	Снижена либо не определяется
Тромбоциты крови	<150¥109/л или уменьшение более чем на 25% от исходных значений
Активность ADAMTS13	<10%
Ингибитор ADAMTS13	Обнаруживается при ингибиторной форме
Клоттинговые тесты, фибриноген	В пределах нормы
Мочевина, креатинин, электролиты, протеинурия	Изменены при поражении почек
Трансаминазы	В пределах нормы
Билирубин	Может быть повышен (гемолиз)
Тропонин	Повышен при поражении сердца
Тесты на беременность у женщин детородного возраста	Исключить беременность как фактор, провоцирующий ТТП

Анемия может быть различной степени выраженности. Одним из патогномоничных признаков является обнаружение шистоцитов в крови. Их количество в норме при подсчете автоматическим способом – 0,03–0,58%, при визуальном подсчете – 0–0,27% от общего количества эритроцитов [51, 52], у лиц с почечной недостаточностью – 0,6% при преэклампсии – 0,45% и у лиц с протезированными клапанами сердца – 0,48% [52]. Критерием ТТП признается обнаружение шистоцитов более 1% [53], по другим данным – более 2–4% [54]. Некоторые эксперты считают, что для диагноза ТТП достаточно любое выявление шистоцитов. В то же время в дебюте ТТП шистоциты могут отсутствовать [38]. Неиммунный характер гемолиза подтверждается отрицательной прямой пробой Кумбса.

Тромбоцитопения выявляется у всех пациентов с обострением ТТП. Для ТТП характерна выраженная тромбоцитопения 10–30¥10⁹/л [55]. Она развивается вследствие потребления тромбоцитов при образовании тромбов. Образующиеся тромбы содержат небольшое количество фибрина, поскольку при ТТП не происходит активации свертывания и отложения фибрина [9, 12], поэтому клоттинговые тесты, концентрация фибриногена плазмы остаются в пределах нормы. Среди других биохимических показателей может быть гипербилирубинемия из-за гемолиза.

Повышение концентрации тропонина в крови выявляют у 33–68% пациентов с ТТП [39, 42, 44], но у 59% пациентов с повышенным содержанием тропонина нет клинических и инструментальных признаков поражения сердца. Повышение концентрации тропонина в крови ассоциируется с плохим прогнозом: риск летального исхода повышается в 2,8 раза [39].

Необходимо выполнение остальных скрининговых тестов для выявления поражений других органов и систем.

При диагностике ТТП необходимо провести инструментальное обследование для скрининга органной дисфункции, а также наличия конкурирующей или сопутствующей патологии:

• электрокардиографию и эхокардиографию: при ТТП дискинезию стенок миокарда на эхокардиограмме выявляют у 33%, перикардиальный выпот – у 7,7% пациентов [44], а изменения ЭКГ в виде нарушения деполяризации обнаруживают у 12,5% пациентов [39].
• компьютерную томографию (КТ)/магнитно-резонансная томографию (МРТ) головного мозга для выявления очагов ишемии, кровоизлияний, визуализации симметричного очагового поражения головного мозга (синдром задней обратимой энцефалопатии), исключения тромбоза венозных синусов; при МРТ у 48% пациентов могут быть признаки синдрома задней обратимой энцефалопатии [41], в то же время многие пациенты, несмотря на неврологические нарушения, имеют нормальную МРТ-картину.
• электроэнцефалографию (ЭЭГ) при судорогах, нарушениях сознания или поведения. ЭЭГ позволяет провести дифференциальную диагностику судорожного синдрома, установить глубину нарушения сознания; изменения на ЭЭГ в дебюте заболевания выявляют у 25% пациентов с ТТП [40];
• рентгенографию/КТ органов грудной клетки для исключения патологии легких;
• ультразвуковое исследование и КТ органов брюшной полости, забрюшинного пространства и малого таза для исключения онкологического процесса;
• эзофагогастродуоденоскопию, которая позволяет исключить опухолевые заболевания, заболевания желудочно-кишечного тракта, выявить язвенные дефекты, эрозии, а также кровотечение как одну из причин анемии.

Необходимы также:

• осмотр гинекологом всех женщин для исключения беременности, опухолевых заболеваний;
• консультация нефролога при наличии клинических или лабораторных признаков развития острой почечной недостаточности, хотя поражения почек при ТТП не столь тяжелы как при ГУС, проведение заместительной почечной терапии требуется у 4–25,9% пациентов с ТТП [14, 36, 43];
• осмотр невролога при развитии неврологической симптоматики (мышечная слабость, судорожный синдром, нарушение сознания или поведения).

Предположительный диагноз ТТП должен устанавливаться срочно на основании рутинных лабораторных тестов и подтверждается обнаружением плазменной активности ADAMTS13<10%. Поскольку исследование активности ADAMTS13 не является рутинным методом, предложены шкалы (French Score, Plasmic Score), согласно которым можно заподозрить ее низкую активность [56, 57] (табл. 2).

Таблица 2. Диагностические шкалы при ТТП
Параметры	French Score	Plasmic score	Баллы
Тромбоциты	<30¥109/л	<30¥109/л	+1
Креатинин сыворотки	<2,25 мг/дл	<2,0 мг/дл	+1
Гемолиз	*		+1
Непрямой билирубин	*	>34,2 мкмоль/л
Ретикулоцитоз	*	>2,5%
Гаптоглобин	*	Не определяется
Средний объем эритроцитов (MCV)	*	<9¥10-14л (90 fl)	+1
Международное нормализованное отношение	*	<1,5	+1
Нет лечения от рака в течение последнего года	*	Да	+1
Нет трансплантации органов или ТГСК	*	Да	+1
Вероятность ADAMTS13<10%	0 баллов – 2% 1 балл – 70% 2 балла – 94%	0–4 балла – 0–4% 6 баллов – 5–24% 6–7 баллов – 62–82%

Даже подозрение на ТТП является показанием для срочного начала лечения, но до начала плазмообмена или трансфузий плазмы необходимо исследовать плазму пациента для подтверждения диагноза ТТП. Критерием ТТП считается активность ADAMTS13 в плазме менее 10%. Если не удалось взять плазму пациента для исследования до начала плазмообмена, она может быть взята и позже. После начала лечения активность ADAMTS13 в плазме менее 10% сохраняется у 88% пациентов после 1-й процедуры плазмообмена, у 83% после 2-й процедуры и у 78% – после 3-й процедуры плазмообмена [58]. Для тестов на ADAMTS13 кровь набирают в пробирки с цитратом натрия (использовать в качестве антикоагулянта этилендиаминтетраацетат – ЭДТА нельзя!). Плазму получают путем центрифугирования в течение 15 мин при 3000 g. Отделяют полученную бедную тромбоцитами плазму. Центрифугирование и отделение плазмы проводят как можно быстрее. Если в течение 4 ч исследование не проводится, рекомендуется плазму перелить в несколько пробирок (аликвоты) и хранить при температуре -70ºС до 6 мес [59]. В то же время имеются данные, что активность ADAMTS13 не меняется при хранении плазмы при комнатной температуре до 48 ч [60]. Для исследования замороженная плазма должна быть разморожена в течение 5 мин при 37ºС, перемешена и исследована в течение 4 ч. Если за это время исследовать размороженную плазму не удается, она должна храниться в холодильнике при 2–8ºС [59].

Какой тест выбрать для подтверждения диагноза ТТП? Можно исследовать антиген, активность и ингибитор ADAMTS13. В клинической практике наибольшее значение имеют исследования активности ADAMTS13 и выявление ингибитора ADAMTS13. Определение антигена ADAMTS13 имеет больше научное значение, может быть использовано для прогноза, при его несоответствии активности можно заподозрить врожденную форму ТТП.

Исторически методы измерения активности ADAMTS13 можно разделить на I и II поколения. Исследования, относящиеся к I поколению, являлись некоммерческими, созданными на базе той или иной лаборатории и основаны на определении активности ADAMTS13 в плазме пациента по измерению оставшегося количества vWF или продуктов его расщепления после инкубации очищенного vWF или пулированной донорской плазмы, используемой в качестве источника vWF, с плазмой пациента. Эти исследования сложные, выполнялись только в специализированных лабораториях в течение нескольких дней [59].

Электрофорез в агарозном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и вестерн-блоттинг [61]. Для выполнения теста к исследуемым образцам цитратной плазмы пациента добавляют трис-буфер, ингибитор сериновых протеаз пефаблок и 0,15 ммоль NaCl и активируют ADAMTS13 посредством инкубации с хлоридом бария в течение 5 мин при 37ºС. Для оценки активности ADAMTS13 к тестируемой плазме добавляют очищенный vWF. Сам по себе vWF резистентен к действию ADAMTS13 в нейтральном буфере, но подвергается расщеплению в присутствии мочевины, которая вызывает частичную денатурацию vWF. Поэтому вместе с очищенным vWF добавляют мочевину, смесь инкубируют в течение 24 ч. Реакцию расщепления vWF металлопротеиназой ADAMTS13 останавливают добавлением ЭДТА [61], после чего выполняют электрофорез в агарозном геле и вестерн-блоттинг с антителами к vWF, конъюгированными с пероксидазой хрена. Расчет активности ADAMTS13 проводится путем сравнения с серийными разведениями нормальной плазмы.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии SDS (SDS-Page) и вестерн-блоттинг [62]. В этом исследовании не проводится активация хлоридом бария ADAMTS13. Время инкубации плазмы пациента с очищенным vWF и гуанидин гидрохлоридом укорочено до 1–3 ч вместо 24 ч. Продукты расщепления, образовавшиеся в результате действия ADAMTS13, в виде диметрических фрагментов по 176 и 140 кДа визуализируют с помощью электрофореза и вестерн-блоттинга на SDS-Page, что проще, чем в агарозном геле.

Коллагенсвязывающий метод основан на способности высокомолекулярных форм vWF связываться с коллагеном [63]. Его проводят путем добавления различных разбавлений образцов плазмы пациента к пулированной донорской плазме, в которой предварительно собственная активность ADAMTS13 нейтрализована добавлением ЭДТА и ингибитора сериновых протеаз пефаблока. Пулированная плазма используется как источник vWF. Смесь инкубируют при 37ºС в течение 2 ч, за это время расщепляет ADAMTS13 vWF, затем реакцию останавливают. Измеряют оставшееся количество vWF по его способности связываться с коллагеном III типа с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и таким образом определяют активность ADAMTS13. Выполнение теста занимает не менее 5 ч.

Определение активности ADAMTS13 методом ристоцетининдуцированной агрегации [64] основано на тех же принципах, что и описанный метод, но количество резидуального vWF измеряют с помощью ристоцетининдуцированной агрегации с помощью агрегометра.

В современных методах определения активности ADAMTS13 используется пептидный субстрат vWF, на который действует ADAMTS13, либо полипептид рекомбинантного домена А2 vWF, либо фрагмент, состоящий из 73 аминокислотных остатков от D1596 до R1668 vWF, обозначаемый как VWF73. Плазму пациента инкубируют с субстратом, на который действует ADAMTS13, и измеряют продукты расщепления. Тесты выполняет в течение нескольких часов, они обладают высокой чувствительностью и специфичностью. Использование полипептида рекомбинантного домена А2 vWF позволяет проводить исследование без таких денатурирующих препаратов, как мочевина, или бивалентных ионов металлов, усиливающих протеиназную активность ADAMTS13. Это позволило сократить время исследования до 5 ч [59].

В методе ИФА на лунки планшета, на стенки которых нанесены антитела к глутатион S-трансферазе (Glutathione transferase – GST), вносят субстрат, меченный GST, в качестве которого используют либо А2-домен vWF, либо vW73М0435. После инкубации, во время которой субстрат связывается с антителами, нанесенными на поверхность лунок, вносится плазма пациента. Вновь выполняется инкубация, во время которой ADAMTS13 плазмы расщепляет субстрат, после чего добавляются вторые антитела для определения количества субстрата, оставшегося после действия ADAMTS13. Количество резидуального субстрата обратно пропорционально активности ADAMTS13 в плазме [59].

В методе флуоресцентного (ферстеровского) резонансного переноса энергии (Fluorescence Resonance Energy Transfer – FRET) представляет собой взаимодействие двух молекул, в котором полоса излучения одной молекулы перекрывает полосу поглощения другой. Одна молекула выступает донором флуорофора, а другая – его акцептором. Принцип FRET заключается в том, что возбужденный флуорофор-донор вместо эмиссии света резонансно передает свою энергию флуорофору-акцептору. Для его выполнения создан флуорогенный пептид FRETS-VW73, который подвергается расщеплению ADAMTS13 [65]. Этот пептид модифицирован таким образом, чтобы смежные аминокислоты с обеих сторон сайта расщепления имели добавленные замещенные фрагменты: 2-(N-метил-амино) бензольная группа (Nma) и 2,4-динитрофенильная группа (Dnp). В интактном, (нерасщепленном) пептиде облучение Nma в диапазоне 340 нм не приводит флуоресцентной эмиссии, поскольку соседняя Dnp-гасящая часть подавляет эмиссию [66]. Когда пептидная связь между аминокислотными остатками Nma и Dnp расщепляется с помощью ADAMTS13, гаситель Dnp отделяется от фрагмента Nma, позволяя происходить флуоресцентной эмиссии 440 нм, которая может быть количественно оценена с помощью флуорометра [67].

В аппарате HemosIL AcuStar реализован автоматизированный количественный метод определения активности ADAMTS1. Картридж включает в себя флаконы с магнитными частицами, покрытые пептидом VW73. Эти частицы инкубируют с плазмой пациента, в результате чего происходит расщепление субстрата под действием ADAMTS13 плазмы пациента, проводятся магнитная сепарация и отмывка. Для количественного определения продуктов расщепления VW73 вносятся моноклональные антитела к этим пептидам, меченные хемилюминисцентным реагентом изолюминолом, проводятся повторные инкубация и магнитная сепарация и отмывка, добавляется реагент, который триггирует реакцию хемилюминисценции, интенсивность которой пропорциональна активности ADAMTS13 [68]. Время выполнения исследования составляет 33 мин.

Для скрининга разработан полуколичественный тест определения активности ADAMTS13 Technoscreen^® (Technoclone, Вена, Австрия). Внешне он напоминает полуколичественный тест на прокальцитонин. Образцы плазмы предварительно инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре со специфическим субстратом, обозначаемым как VWF73-GST (GST – glutathione S-transferase) и содержащим фрагменты vWF из 73 аминокислотных остатков от D1596 до R1668, которые связываются с тромбоспондином (TSP1) ADAMTS13 плазмы. Во время инкубации ADAMTS13 расщепляет субстрат. Затем по капле предварительно инкубированной смеси добавляют в контрольную и тестовую лунки. В мембрану контрольной лунки иммобилизированы поликлональные антитела (анти-GST), которые способны связывать как расщепленный и нерасщепленный субстрат VWF73. В мембране тестовой лунки иммобилизированы антитела G7, которые связываются только с расщепленным VWF73, т.е. чем больше активность ADAMTS13, тем больше VWF73 будет расщеплено. Связанный с антителами субстрат в тестовой и контрольной лунках детектируют с помощью стрептавидина-голд конъюгата, который придает им красную окраску. Интенсивность красной окраски в тестовой лунке пропорциональна активности ADAMTS13. Время выполнения теста занимает менее 30 мин [69]. При сравнении результатов определения активности ADAMTS13 скрининговым тестом Technoscreen^® с результатами ИФА с помощью набора Technozym^® (Technoclone, Австрия) установлены 88,7% чувствительность и 90,4% специфичность полуколичественного теста [70]. Несмотря на это, в случае получения положительного результата требуется подтверждение скринингового теста одним из известных количественных методов определения активности ADAMTS13.

При сравнении результатов определения активности ADAMTS13 различными методами показано, что они коррелируют между собой [67, 68, 71, 72]. Результаты определения активности ADAMTS13 методом HemosIL AcuStar коррелируют c FRET (r=0,96) и ИФА (r=0,96) [68], а коэффициент вариации между различными методами составляет менее 15% [68, 72]. Все методы в 100% выявляют выраженный дефицит ADAMTS13 (<10%), однако при пограничных значениях активности ADAMTS13 могут наблюдаться расхождения [72]. Поэтому если при типичных клинических проявлениях активность ADAMTS13 превышает 10%, необходимо повторить исследование либо выполнить его другим методом [73].

Определение концентрации антигена ADAMTS13 может быть произведено с помощью ИФА. Используют планшеты, в которых на поверхности лунок предварительно адсорбированы анти-ADAMTS13-антитела, которые связываются с антигеном ADAMTS13 плазмы. Затем в лунки планшета добавляют вторые кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Референсные значения антигена ADAMTS13 составляют 657–2368 нг/мл [74].

На результаты определения активности ADAMTS13 влияют различные факторы. Гипербилирубинемия более 100 мкмоль/мл приводит к угасанию флуоресценции в методе FRET, а при концентрации боле 300 мкмоль/л – к ошибкам в HemosIL AcuStar, но не влияет на ИФА. Наличие в крови ревматоидного фактора, гепарина более 2 ме/мл, vWF>200%, триглицеридемия более 1,250 мг/дл влияют на результаты HemosIL AcuStar. Гемолиз и триглицеридемия влияют на результаты FRET, но не ИФА [59, 72].

Что лучше – исследовать антиген или активность ADAMTS13? В практической деятельности большее значение имеет активность ADAMTS13. У пациентов с ТТП может наблюдаться несоответствие активности ADAMTS13 концентрации антигена. При наследственной форме ТТП ряд мутаций приводит к нарушению секреции ADAMTS13, при других мутациях в большей степени, чем секреция, нарушается функциональная способность ADAMTS13, в результате концентрация антигена превышает активность ADAMTS13 [27, 30, 33]. При исследовании плазмы пациентов с ТТП на разных стадиях заболевания установлена слабая корреляция между антигеном и активностью ADAMTS13 при первых клинических проявлениях ТТП (r=0,23), обострении заболевания (r=0,35), достижении клинического ответа (r=0,31) и ремиссии (r=0,28) [74]. Поэтому предлагается использовать исследование активности ADAMTS13 как метод выбора при установке диагноза ТТП. Исследование антигена ADAMTS13 имеет большое научное значение, может быть использовано для прогноза: если после плазмообмена антиген ADAMTS13 не нормализуется, это плохой прогностический признак [74].

Принципиально и ургентно выявление ингибитора ADAMTS13, подтверждающее диагноз иммуноопосредованной формы ТТП. Анти-ADAMTS13-антитела делятся на два класса: нейтрализующие антитела или ингибиторы и антитела, не обладающие ингибиторной активностью [75].

ИФА выявляет общее количество анти-ADAMTS13-антител. Метод основан на связывании анти-ADAMTS13-антител, имеющихся в плазме пациента, с рекомбинантным ADAMTS13, нанесенным на стенки лунок планшета, при инкубации. Лунки планшета затем отмывают, и связанные антитела определяют с помощью пероксидазы хрена, конъюгированной с антителами к человеческим иммуноглобулинам (Ig)G. С помощью ИФА диагностический порог антител анти-ADAMTS13 составляет более 15 ед/л [76, 77].

Ингибитор ADAMTS13 выявляют в тесте смешивания, титр ингибитора определяют в единицах Бетезда. Одна единица Бетезда (Bethesda Unit) – это количество ингибитора в 1 мл плазмы, которое снижает на 50% активность ADAMTS13 в смеси равных объемов плазмы пациента и донора после инкубации при температуре 37ºС. С помощью любого метода, определяющего активность ADAMTS13, можно выполнить тест смешивания. Для выполнения теста смешивания плазму пациента предварительно подогревают до 56ºС в течение 60 мин, чтобы инактивировать в ней эндогенную активность ADAMTS13. Затем смешивают плазму пациента с нормальной донорской плазмой в различных соотношениях (1:1, 2:1 и 3:1, 4:1) и инкубируют в течение 2 ч, после чего определяют резидуальную активность ADAMTS13, рассчитывается титр ингибитора [75, 77, 78].

Не все антитела обладают ингибиторной активностью. С помощью ИФА антитела класса IgG выявлялись у 58% пациентов с ТТП, а в тесте смешивания ингибирующие антитела обнаружены лишь у 27,5% [77]. При обследовании 35 пациентов с впервые выявленной ТТП антитела анти-ADAMTS13, относящиеся к IgМ, IgG и IgА, выявлены у 94% пациентов, в то время как ингибирующие антитела – лишь у 89%. Не имелось корреляции между титром антител, относящихся к Ig всех трех классов, и титром ингибирующей активности в тесте смешивания [76]. Какой из методов выявления ингибитора следует выбрать? Выявление ингибирующих анти-ADAMTS13-антител в тесте смешивания имеет большее значение, чем обнаружение с помощью ИФА анти-ADAMTS13 IgG, поскольку обнаружение этих Ig еще не свидетельствует, что они будут обладать ингибирующей активностью, и пациенту следует назначить иммуносупрессивную терапию. Описано клиническое наблюдение [79] пациента, у которого выявлен синдром Апшоу–Шульмана: низкая активность ADAMT13, мутации гена ADAMTS13, однако с помощью ИФА выявлены анти-ADAMT13 IgG в концентрации 95 ед/мл. Казалось бы, пациент нуждается в проведении иммуносупрессивной терапии, однако в тесте смешивания, выполненного с помощью метода FRET, а затем с помощью ИФА, ингибитор не обнаружен. В ряде ситуаций выполнение теста смешивания экономически более выгодно. ТТП – редкое заболевание, при каждом новом случае должен выполняться тест на наличие ингибитора и/или антител, поскольку это определяет тактику терапии. ИФА для каждой отдельной пробы является дорогостоящим. Выгоднее выполнять тест смешивания тем же методом, которым определялась активность ADAMTS13.

Таким образом, можно сформулировать следующие основные принципы диагностики ТТП:

• Предположительный диагноз ТТП устанавливают на основании клинической картины – анемия, тромбоцитопения, поражения различных органов и систем.
• Характерны выраженная тромбоцитопения без тяжелого нарушения функции почек, повышение сывороточной концентрации лактатдегидрогеназы, отрицательная прямая проба Кумбса, анемия, сниженное содержание гаптоглобина.
• Диагноз ТТП подтверждается при активности ADAMTS13 в плазме менее 10%. При активности ADAMTS13 10–20% и характерной клинической картине необходимо повторить исследование. Образцы плазмы на исследование должны быть взяты до начала трансфузий плазмы либо плазмообмена.

При выявлении низкой активности ADAMTS13 необходимо обследовать на наличие ингибитора ADAMTS13, его выявление определяет тактику дальнейшего лечения. Обнаружение анти-ADAMTS13-антител, относящихся к IgG, не всегда свидетельствует о выявлении ингибитора, поскольку они могут не обладать ингибирующей активностью. Ингибирующее действие анти-ADAMTS13-антител подтверждается в тесте смешивания.

Необходимо обследовать всех впервые выявленных пациентов на наличие мутаций гена ADAMTS13. Наличие ингибитора не исключает мутации гена ADAMTS13.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

G. M. Galstyan

National Research Center for Hematology

Author for correspondence.
Email: gengalst@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8818-8949

д.м.н., зав. отд-нием

Russian Federation, Moscow

E. E. Klebanova

National Research Center for Hematology

Email: gengalst@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8141-9422

врач отд-ния реанимации и интенсивной терапии

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files