Characterisation of circulating microRNA-21 levels in patients with hypertrophic cardiomyopathy

Full Text

ВСС – внезапная сердечная смерть

ГКМП – гипертрофическая кардиомиопатия

ЗСЛЖд – задняя стенка левого желудочка в диастолу

ИМ – инфаркт миокарда

ИММ – индекс массы миокарда

КДР – конечно-диастолический размер

ЛЖ – левый желудочек

ЛП – левое предсердие

МЖП– межжелудочковая перегородка

МЖПд – межжелудочковая перегородка в диастолу

РНК – рибонуклеиновая кислота

ФВ – фракция выброса

ЭхоКГ – эхокардиография

PCNA (nuclear antigen prolipherative cell) – ядерный антиген

пролиферирующей клетки

Введение

Помимо матричных РНК, содержащих воспроизводимую в ходе трансляции информацию о первичной структуре белка, в клетках эукариот также синтезируется ряд молекул РНК, не кодирующих белки. Подобные РНК могут быть структурными компонентами органелл (к примеру, рибосомальные РНК), участвовать в синтезе белка (транспортные РНК), обладать ферментативной активностью или выполнять регуляторные функции [1, 2].

МикроРНК или некодирующие молекулы РНК обнаружены в 1993 г. [3], и в течение последующих лет в отечественной и зарубежной литературе представлены убедительные свидетельства их способности регулировать посттранскрипционную экспрессию генов [4, 5].

В 2008 г. впервые сообщено о наличии микроРНК в циркулирующем кровотоке [6].

МикроРНК играют важную роль как в физиологических, так и в патологических процессах, регулируя разнообразные клеточные функции путем ингибирования/активирования экспрессии их целевых генов [4, 5].

Экспериментальные и клинические исследования показывают, что экспрессия микроРНК-21 изменена при патологии сердечно-сосудистой системы, и уровень микроРНК-21 связан с модулированием активности и экспрессии компонентов, являющихся ключевыми для роста, выживания и гибели кардиомиоцитов [7–9].

В последние годы появилась гипотеза, что циркулирующие микроРНК, в том числе микроРНК-21, могут представлять новый класс маркеров заболеваний сердечно-сосудистой системы и мишеней для будущих терапевтических стратегий [10], например при гипертрофии миокарда, вызванной перегрузкой давлением [11], инфаркте миокарда [7] и хронической сердечной недостаточности [12], а также при кардиоренальном синдроме 4-го типа [13].

Показана связь микроРНК-21 и экспрессии ядерного антигена пролиферирующей клетки (PCNA) при повреждении миокарда в результате ишемии/реперфузии [14]. В ряде исследований при гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП) обнаружена повышенная экспрессия маркеров пролиферации, в том числе PCNA, Ag-ЯОР – аргентофильных белков, связанных с ядрышкообразующими районами (Ag-NORs, nucleolar organization regions) [15, 16]. ГКМП является наиболее изученным и самым распространенным наследственным заболеванием миокарда [17]. Возраст пациента на момент манифестации клинических проявлений ГКМП является важной детерминантой выраженности гипертрофии миокарда, тяжести течения и частоты летальных исходов [16, 17]. Клиническая значимость микроРНК-21 при ГКМП исследована в немногочисленных зарубежных работах [18, 19]. Высказаны предположения, что снижение или повышение экспрессии определенных микроРНК, в том числе микро РНК-21, в будущем может стать мишенью для терапевтических стратегий при ГКМП [18].

Цель исследования – изучить уровни циркулирующей микроРНК-21 у пациентов разного возраста с бессимптомным и симптомным вариантом течения ГКМП.

Материалы и методы

С 2015 по 2018 г. в исследование включены 49 пациентов с семейной формой ГКМП, из них 55,1% женщин и 44,9% мужчин в возрасте от 19 до 86 лет (50 [32; 65]), отвечающих требованиям и обследованных в соответствии с клиническими рекомендациями Европейского сообщества кардиологов (ESC) по диагностике и лечению ГКМП от 2014 г. [15]. Контрольную группу составили 44 практически здоровых лица, сопоставимых по возрасту и полу с обследуемыми пациентами с ГКМП.

При анализе выделено 3 подгруппы:

1) бессимптомные пациенты с ГКМП в возрасте до 45 лет (n=6; 31 [26, 25; 44]);

2) симптомные пациенты с ГКМП в возрасте до 45 лет (n=15; 31 [23; 41]);

3) симптомные пациенты с ГКМП в возрасте 45 лет и старше (n=28; 62 [52, 75; 68]).

Расчетный риск внезапной сердечной смерти (ВСС) у больных ГКМП установлен согласно клиническим рекомендациям ESC по диагностике и лечению ГКМП от 2014 г. при помощи калькулятора HCM Risk-SCD [17].

Забор крови для молекулярно-генетических исследований осуществляли на фоне ухудшения в течении симптомной ГКМП. Данное обстоятельство служило основанием для госпитализации и решения вопроса о хирургической и нехирургической редукции межжелудочковой перегородки (МЖП), коррекции желудочковых нарушений сердечного ритма, в том числе постановки имплантируемого кардиовертера-дефибриллятора, фибрилляции предсердий с помощью интервенционных методов. Тотальную РНК выделяли из плазмы пациентов. Изучение уровней циркулирующей микроРНК-21 проводилось методом обратной транскрипции с использованием технологии StemLoop с последующим проведением полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с помощью микроРНК-специфических праймеров и набора реагентов фирмы «Синтол» на амплификаторе DTlite. Вычисление относительного уровня экспрессии гена микроРНК-21 выполняли в соответствии со стандартной процедурой 2-ΔCt.

Статистическая обработка осуществлялась с помощью пакетов Microsoft Excel 2010, IBM SPSS (пробная версия) и MATLAB R2013a (License Number 40502181). Данные, подчиняющиеся нормальному распределению, представлены в виде среднее значение ± стандартное отклонение. Данные, не подчиняющиеся нормальному распределению, представлены с использованием медианы (Ме) и нижнего и верхнего квартилей (Q₂₅; Q₇₅). Соответствие распределения нормальному закону проверялось с помощью тестов Колмогорова–Смирнова и Шапиро–Уилка. Дополнительными факторами, влияющими на выводы о нормальности распределения данных, являлись оценка коэффициентов асимметрии и эксцесса, а также визуальный анализ гистограмм и нормальных графиков Q-Q. Сравнение средних значений нормально распределенных непрерывных количественных переменных в независимых выборках проводилось с помощью t-критерия Стьюдента. Реализация t-критерия Стьюдента для независимых выборок осуществлена совместно с F-критерием равенства дисперсий Ливиня. Для сравнения количественных переменных, не подчиняющихся нормальному распределению, использован непараметрический критерий Манна–Уитни. При выявлении связи качественных (номинальных) переменных анализировались таблицы сопряженности и столбчатые диаграммы, иллюстрирующие распределение частот для изучаемых признаков в зависимости от значения качественной переменной. Для сравнения частот использовался критерий соответствия Пирсона χ², при этом, если в некоторых ячейках таблиц сопряженности ожидаемая частота была менее 5, применялся точный метод расчета уровня значимости критерия, предлагаемый пакетом SPSS. Различия считались статистически значимыми при значениях р<0,05. Для таблиц сопряженности 2¥2 при небольшом числе объектов (до 40–50) использовался критерий χ² с поправкой на непрерывность, а при нарушении условий его применения (малая частота в ячейках) – точный критерий Фишера.

Результаты

Характеристика эхокардиографических (ЭхоКГ)-показателей у больных ГКМП разного возраста и различным вариантом течения

Результаты анализа ЭхоКГ-показателей у пациентов с ГКМП в исследуемых группах представлены в табл. 1, 2.

 

Таблица 1. Сравнительная характеристика ЭхоКГ-показателей у пациентов с ГКМП в возрасте до 45 лет при бессимптомном и симптомном течении заболевания
ЭхоКГ-показатели	Бессимптомные пациенты в возрасте до 45 лет	Симптомные пациенты в возрасте до 45 лет	p
МЖПд, мм	17 [11, 8; 25, 5]	22 [20; 35]	0,081
ЗСЛЖд, мм	10 [9, 6; 10, 65]	10 [9; 13]	1,0
ИММ ЛЖ, г/м2	122 [110, 4; 197, 5]	169 [141; 198]	0,081
ЛП, мм	42 [39, 5; 43, 5]	43 [42; 48]	0,230
КДР, мм	49,52±1,64	44,13±1,84	0,033
ФВ ЛЖ, %	66,0±3,36	66,0±1,91	1,0
Таблица 2. Сравнительная характеристика ЭхоКГ-показателей у пациентов с симптомным течением ГКМП в зависимости от возраста
ЭхоКГ-показатели	Симптомные пациенты в возрасте до 45 лет	Симптомные пациенты в возрасте 45 лет и старше	p
МЖПд, мм	22 [20; 35]	19,5 [18, 75; 23, 25]	0,007
ЗСЛЖд, мм	10 [9; 13]	13 [12; 15]	0,005
ИММ ЛЖ, г/м2	169 [141; 198]	143,35 [128, 25; 166, 5]	0,114
ЛП, мм	43 [42; 48]	46 [42, 75; 51, 25]	0,398
КДР, мм	44,13±1,84	46,38±1,18	0,211
ФВ ЛЖ, %	66,0±1,91	63,94±1,51	0,383

 

В подгруппе пациентов бессимптомного течения в возрасте до 45 лет: толщина МЖП в диастолу (МЖПд) варьировала от 10,6 до 27 мм (17 [11, 8; 25, 5]), толщина задней стенки левого желудочка (ЛЖ) в диастолу (ЗСЛЖд) – от 9,2 до 11 мм (10 [9, 6; 10, 65]); размер левого предсердия (ЛП) в диастолу – от 39 до 44 мм (42 [39, 5; 43, 5]), конечно-диастолический размер (КДР) ЛЖ – от 44 до 54 мм (49,52±1,64). Индекс массы миокарда (ИММ) варьировал от 103 до 262 г/м² (122 [110, 4; 197, 5]), фракция выброса (ФВ) ЛЖ – от 54 до 73% (66±3,36).

В подгруппе пациентов симптомного течения в возрасте до 45 лет: толщина МЖПд варьировала от 19 до 47 мм (22 [20; 35]), толщина ЗСЛЖд – от 7 до 15,1 мм (10 [9; 13]), размер ЛП в диастолу – от 35 до 68 мм (43 [42; 48]), КДР ЛЖ – от 31 до 60 мм (44,13±1,84). ИММ варьировал от 120 до 255 г/м² (169 [141; 198]), ФВ ЛЖ – от 54 до 78% (66,0±1,91).

В подгруппе пациентов симптомного течения в возрасте 45 лет и старше: толщина МЖПд варьировала от 11 до 27 мм (19,5 [18, 75; 23, 25]), толщина ЗСЛЖд – от 8 до 21 мм (13 [12; 15]), размер ЛП в диастолу – от 35 до 58 мм (46 [42, 75; 51, 25]), КДР ЛЖ – от 34 до 56 мм (46,38±1,18), ИММ варьировал от 112 до 232 г/м² (143,35 [128, 25; 166, 5]), ФВ ЛЖ – от 56 до 81% (63,94±1,51).

При симптомном течении ГКМП в возрасте до 45 лет выявлены тенденции к увеличению толщины МЖПд и ИММ (p=0,081), а также значимое уменьшение КДР ЛЖ (p<0,05) по сравнению с бессимптомными пациентами в возрасте до 45 лет (см. табл. 1).

При сравнении показателей ЭхоКГ у симптомных пациентов с ГКМП выявлено, что в возрасте до 45 лет значимо больше толщина МЖПд (р<0,01), в возрасте 45 лет и старше значимо больше толщина ЗСЛЖд (р<0,01). Значимые отклонения других ЭхоКГ-показателей отсутствовали (см. табл. 2).

При этом в целом в группе ГКМП обнаружены отрицательная корреляционная связь между толщиной МЖПд и возрастом пациента (r=-0,56; р<0,001) и положительная корреляционная связь между толщиной ЗСЛЖд и возрастом пациента (r=0,67, р<0,001); см. рисунок.

Корреляция возраста и ЭхоКГ-показателей в группе ГКМП: а - возраст и МЖПд (r=-0,56; p<0,001); б - возраст и ЗСЛЖд (r=0,67; p<0,001)

Расчетный риск ВСС при ГКМП

В группе ГКМП расчетный риск ВСС в течение 5 лет варьировал от 1,01 до 20,17% (2,98 [2, 04; 5, 00]), 9 пациентам с расчетным риском ВСС более 6% в рамках профилактики ВСС установлен имплантируемый кардиовертер-дефибриллятор. Зарегистрирован 1 случай ВСС при расчетном риске ВСС 13,07%.

В подгруппе симптомного течения ГКМП до 45 лет расчетный риск ВСС составил от 2,44 до 20,71% (6,01 [3, 64; 9, 67]) и был значимо выше (р<0,001), чем в подгруппе бессимптомных пациентов в возрасте до 45 лет, в которой показатель риска ВСС варьировал от 1,01 до 4,77% (2,41 [1, 21; 3, 89]), а также был значимо выше (р<0,001), чем в подгруппе симптомного течения ГКМП у пациентов 45 лет и старше, в которой риск варьировал от 1,02 до 7,59% (2,56 [1, 67; 4, 41]).

Характеристика уровней циркулирующей микроРНК-21 в группе пациентов с ГКМП и здоровых лиц

В общей группе ГКМП уровень микроРНК-21 варьировал от 1,07 до 337,79 (5,28 [2, 64; 13, 96]) и был значимо выше, чем в группе контроля, в которой этот показатель варьировал соответственно от 0,01 до 9,85 (0,84 [0, 55; 1, 23]; p<0,001). Также уровень микроРНК-21 был значимо выше в исследуемых подгруппах, чем в группе контроля: в подгруппе бессимптомных пациентов до 45 лет (p<0,025), в подгруппе симптомных пациентов в возрасте до 45 лет (p<0,001), в подгруппе симптомных пациентов в возрасте 45 лет и старше (p<0,001); табл. 3.

 

Таблица 3. Характеристика уровней циркулирующей микроРНК-21 в общей группе пациентов с ГКМП и подгруппах пациентов разного возраста и варианта течения в сравнении с контролем (Me [Q25; Q75])
Параметр микроРНК-21	Группа контроля (n=44) – 0,84 [0, 55; 1, 23]	Группа ГКМП (n=49) – 5,28 [2, 64; 13, 96]	p<0,001
		Группа бессимптомного течения до 45 лет (n=6) – 2,81 [1, 45; 5, 27]	p<0,025
		Симптомные пациенты до 45 лет (n=15) – 36,76 [5, 66; 42, 22]	p<0,001
		Симптомные пациенты 45 лет и старше (n=28) – 3,88 [2, 16; 8, 63]	p<0,001

 

Характеристика уровней циркулирующей микроРНК-21 в подгруппах пациентов с симптомным течением ГКМП разного возраста

Как представлено в табл. 4, уровень микроРНК-21 в подгруппе симптомного течения ГКМП у пациентов в возрасте до 45 лет варьировал от 2,46 до 337,79 (36,76 [5, 66; 42, 22]), в подгруппе бессимптомного течения ГКМП у пациентов в возрасте до 45 лет этот показатель колебался от 1,62 до 5,28 (2,81 [1, 45; 5, 28]), в подгруппе симптомного течения ГКМП у пациентов в возрасте в возрасте 45 лет и старше составлял соответственно от 1,07 до 119,43 (3,88 [2, 16; 8, 63]). Уровень микроРНК-21 в подгруппе больных ГКМП симптомного течения в возрасте до 45 лет был значимо выше, чем в подгруппе пациентов с бессимптомным течением ГКМП того же возраста (p<0,002) и в подгруппе с симптомным течением ГКМП в возрасте 45 лет и старше (р<0,002); см. табл. 4.

 

Таблица 4. Характеристика уровней циркулирующей микроРНК-21 у больных ГКМП разного возраста с симптомным и бессимптомным течением заболевания (Me [Q25; Q75])
Параметр	Симптомные пациенты до 45 лет (n=15)	Бессимптомные пациенты до 45 лет (n=6)	p
МикроРНК-21	36,76 [5, 66; 42, 22]	2,81 [1, 45; 5, 28]	<0,002
Параметр	Симптомные пациенты до 45 лет (n=15)	Симптомные пациенты 45 лет и старше (n=28)	p
МикроРНК-21	36,76 [5, 66; 42, 22]	3,88 [2, 16; 8, 63]	<0,002

 

Таким образом, у пациентов с симптомным течением ГКМП в возрасте до 45 лет обнаружены наиболее высокие показатели расчетного риска ВСС и уровня циркулирующей микроРНК-21. При этом корреляций между уровнем циркулирующей микро РНК-21 и показателями расчетного риска ВСС не обнаружено.

Обсуждение

Факт того, что возраст является важной детерминантой дебюта, тяжести течения и исходов при ГКМП, подтвержден рядом исследований. Выраженная гипертрофия миокарда, гипертрофия МЖП чаще встречаются у детей и пациентов молодого возраста [16, 17, 21]. В нашем исследовании показано, что по мере увеличения возраста пациентов толщина МЖПд уменьшается. Схожие данные получены в ряде исследований, в которых выявлено, что естественное течение заболевания включает спонтанное истончение стенки ЛЖ [20], что влияет на низкую распространенность выраженной гипертрофии миокарда у пациентов с ГКМП в пожилом возрасте [20, 21].

В исследовании установлено, что у пациентов с ГКМП уровень циркулирующей микроРНК-21 значимо выше аналогичного показателя у практически здоровых лиц. Важно отметить значимое по сравнению с контролем повышение уровня циркулирующей микроРНК-21 у молодых пациентов с ГКМП при бессимптомном течении и значимое повышение микроРНК-21 у симптомных пациентов с ГКМП в возрасте до 45 лет по сравнению с бессимптомными того же возраста. Полученные данные согласуются с рядом исследований. Например, с результатами R. Roncarati и соавт. (2014 г.), которые обнаружили, что уровни циркулирующих микроРНК-27a, -199a-5p, -26a, -145, -133a, -143, -199a-3p, -126-3p, -29a, -155, -30a и -21 повышены в плазме пациентов с ГКМП [22].

1. Roma-Rodrigues и соавт. сообщили (2015 г.) о повышении уровней микроРНК-21 как у малосимптомных пациентов, так и при тяжелом течении ГКМП [18]. В нашей работе максимальные уровни циркулирующей микроРНК-21 обнаружены в группе пациентов с симптомным течением ГКМП в возрасте до 45 лет.

В работе T. Thum и соавт. (2008 г.) показано, что микроРНК-21 регулирует работу фибробластов и способствует фиброзу [8]. В работе L. Fang и соавт. (2015 г.) продемонстрировано, что микроРНК могут индуцировать или подавлять гипертрофию и фиброз миокарда, и высказано предположение, что циркулирующие микроРНК-21 могут являться потенциальными биомаркерами диффузного фиброза миокарда у пациентов с ГКМП [23]. Заслуживают внимания также данные C. Bang и соавт. (2014 г.), согласно которым в экзосомах, полученных из фибробластов сердца, обнаружена микроРНК-21 в качестве мощного паракринного фактора, который ассоциирован с механизмами фибробласт-кардиомиоцитарных взаимодействий и гипертрофией миокарда [24].

В 2006 г. нами установлено, что в основе гипертрофии кардиомиоцитов и гиперплазии стромы миокада у детей и взрослых пациентов с симптомной ГКМП в возрасте до 45 лет лежат повышенная активация ядрышек, увеличение количества PCNA-позитивных ядер кардиомиоцитов и фибробластоподобных клеток. Исследование выполнено в миокарде пациентов с ГКМП, которые были сопоставимы по возрасту, полу, клиническим и морфологическим характеристикам заболевания с аналогичными показателями пациентов с ГКМП в настоящем исследовании [16].

Свидетельства повышенного уровня циркулирующей микроРНК-21 в плазме и повышенной экспрессии аргентофильных ядрышковых белков в кардиомиоцитах и фибробластоподобных клетках миокарда у молодых симптомных пациентов с семейной формой ГКМП, по-видимому, генетически детерминированы и ассоциированы с механизмами собственно гипертрофии и фиброза миокарда у молодых симптомных пациентов с ГКМП. Таким образом, изучение молекул с «тераностическим» потенциалом позволит оптимизировать процесс интеграции результатов диагностики и терапии.

Заключение

У пациентов с ГКМП уровень циркулирующей микроРНК-21 значимо выше по сравнению с контролем. Максимальный уровень циркулирующей микроРНК-21 выявлен у пациентов с симптомным течением семейной формы ГКМП в возрасте до 45 лет.

About the authors

A. Ya. Gudkova

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University; Almazov National Medical Research Centre

Author for correspondence.
Email: alexagood-1954@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0156-8821

д.м.н., проф. каф. факультетской терапии, зав. лаб. кардиомиопатий Института сердечно-сосудистых заболеваний; вед. науч. сотр. Института молекулярной биологии и генетики 

Russian Federation, Saint Petersburg

V. G. Davidova

Almazov National Medical Research Centre

Email: alexagood-1954@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0233-5555

аспирант

Russian Federation, Saint Petersburg

T. G. Bezhanishvili

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: alexagood-1954@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3167-6340

клинический ординатор

Russian Federation, Saint Petersburg

S. A. Pyko

Saint Petersburg Electrotechnical University «LETI»

Email: alexagood-1954@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6625-3770

к.т.н., доц.

Russian Federation, Saint Petersburg

M. I. Zarayskiy

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: alexagood-1954@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7605-4369

д.м.н., проф. каф. клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files