Gene therapy of type 2 diabetes mellitus: state of art

Full Text

ААВ - аденоассоциированные вирусы ГПП-1 - глюкагон-подобный пептид 1-го типа ИЛ-4 - интерлейкин-4 ИР - инсулинорезистентность CД2Т - сахарный диабет 2-го типа FABP4 - белок, связывающий жирные кислоты Сахарный диабет 2-го типа (СД2Т) и сопутствующие кардиометаболические нарушения представляют собой существенное звено в структуре заболеваемости и смертности в современном мире. В настоящее время разработано немало фармакологических подходов к коррекции инсулинорезистентности (ИР) и терапии СД2Т. Многие препараты способствуют снижению уровня глюкозы крови, увеличению секреции инсулина, однако обладают многочисленными побочными воздействиями. В связи с этим перспективным подходом видится использование генной терапии для коррекции ИР. Генная терапия направлена на лечение заболеваний с использованием внесения одной или нескольких терапевтических нуклеиновых кислот в клетки пациента или путем исправления дефектных генов с помощью, например, систем редактирования генома. Генная терапия имеет потенциал для лечения ранее неизлечимых болезней (β-талассемия, миодистрофия Дюшенна и т. д.), а также для совершенствования терапии социально значимых заболеваний (инфаркт миокарда, СД2Т и т. д.). Успешное лечение офтальмологических заболеваний и первичных иммунодефицитов способствовало интенсивному развитию данной области и было подчеркнуто как одно из основных научных достижений года журналом Science в 2009 г. [1, 2]. Достижения в области векторных систем для генной терапии, оптимизированных для использования in vivo и ex vivo, накопление клинического опыта использования этих технологий стали основными факторами, которые в конечном счете позволили генной терапии за рубежом стать рутинно используемым методом в клинической практике, особенно в области онкологии [3]. Эффективные стратегии клинической генной терапии основаны либо на доставке гена in vivo в постмитотические клетки-мишени, либо на ex vivo доставке генов в аутологичные клетки, за которыми следует перенос модифицированных клеток обратно пациенту. В in vivo генной терапии наибольший успех продемонстрировали плазмидные конструкции и аденоассоциированные вирусы (ААВ). Успешность применения плазмидных конструкций обусловливает простота их производства, а также эписомная доставка генетического материала. Успешность применения ААВ обусловлена также эписомной доставкой генетического материала и высоким разнообразием серотипов и вариантов капсидов, что позволяет использовать ААВ для таргетной генной терапии in vivo. Ex vivo генная терапия в первую очередь направлена на доставку генов в аутологичные гематопоэтические стволовые клетки (лечение гематологических патологий), а также в дифференцированные клетки (Т-лимфоциты). Для ex vivo генной терапии применяются преимущественно лентивирусы, которые показывают лучший доклинический профиль безопасности и более высокую эффективность доставки генов в неделящиеся клетки, по сравнению с γ-ретровирусами. Тем не менее лентивирусные конструкции также используются для экспериментальных работ в области генной терапии, так как лентивирусы обладают наивысшей эффективностью заражения неделящихся клеток, по сравнению с остальными вирусными векторами. Далее в обзоре мы рассмотрим основные преимущества и недостатки использования двух основных видов генной терапии для коррекции ИР и СД2Т. Плазмидная генная терапия сахарного диабета 2-го типа Плазмида является простейшей формой вектора для транспорта ДНК в ядро клетки. Плазмида представляет собой кольцевую двухцепочечную ДНК, длина варьирует от 1000 до 200 тыс. пар оснований (п. о.). В природе плазмиды обнаруживаются практически у всех видов бактерий, где они обычно кодируют белки устойчивости к антибиотикам. В общем виде плазмида для использования в генной терапии несет ген для устойчивости к антибиотикам, регулируемый прокариотическим промотором; прокариотический ориджин репликации, поддерживающий экспрессию плазмиды; кассету экспрессии, содержащую промотор для инициации транскрипции трансгена, кодирующего терапевтический белок, сам трансген и сигнал полиаденилирования, необходимый для ядерного экспорта мРНК [4]. Большинство плазмид содержат только один трансген, но полицистронные экспрессионные кассеты могут кодировать несколько целевых белков без существенных ограничений по размеру кассеты. По сравнению с рекомбинантными вирусными векторами, пламиды просты в производстве и легко получаются в больших количествах. Плазмиды имеют отличный профиль безопасности, низкую иммуногенность, вероятность канцерогенеза крайне мала (геномная интеграция крайне неэффективна). Плазмиды обладают очень большой емкостью для упаковки ДНК и могут использоваться для размещения больших фрагментов геномной ДНК. Плазмиды легки в клиническом использовании, оставаясь стабильными при комнатной температуре. Однако при работе с плазмидами есть несколько существенных ограничений, среди которых основные - крайне низкоэффективная доставка гена, а также отсутствие возможности использовать таргетную доставку гена, за исключением местного применения, например в офтальмологии [5]. В современной диабетологии ведутся работы по созданию плазмидных генно-терапевтических препаратов для лечения СД2Т. Среди основных генов-мишеней - глюкагон-подобный пептид 1-го типа (ГПП-1), компонент инкретиновой системы со многими антидиабетическими эффектами: снижение массы тела, снижение активности желудка, рост секреции инсулина, дифференцировка новых бета-клеток и т. д. [6-8]; адипонектин, адипокин, обладающий антидиабетическим, противовоспалительным и кардиопротективным действиями [9-11]. Плазмидная экспрессия ГПП-1 активно используется для коррекции СД2Т в животных моделях и планируется к выходу на клинические испытания в 2018-2020 гг. [12-14]. Однако использование генно-терапевтических аналогов ГПП-1 не выглядит крайне перспективным в связи с тем, что в настоящее время существуют препараты на основе лираглутида - химического аналога ГПП-1, которые действуют системно и обладают хорошим антидиабетическим действием, а также способствуют снижению массы тела [15-17]. Иными словами, генно-терапевтический ГПП-1 на настоящий момент не имеет существенных преимуществ перед препаратами на основе лираглутида. Тем не менее интересным направлением в этой области выглядит применение генной терапии с использованием регуляторов природной экспрессии ГПП-1. Существуют работы по генной терапии с использованием эксендина-4, нативного стимулятора экспрессии ГПП-1; применение плазмидной генной терапии на основе эксендина-4 значимо улучшает показания инсулиновой чувствительности животных [18]. Использование в качестве антидиабетических препаратов плазмид с геном адипонектина выглядит более перспективным направлением, так как адипонектин обладает комплексным системным антидиабетическим, противовоспалительным и кардиопротективным действием. Плазмидная генная терапия с использованием гена адипонектина обладает позитивными эффектами на инсулиновую чувствительность, секрецию инсулина, а также уровень системного воспаления [19-21]. Основная проблема плазмидной генной терапии с использованием гена адипонектина - низкая эффективность сборки эффекторного высокомолекулярного адипонектина. С гена адипонектина экспрессируется низкомолекулярная форма адипонектина, которая затем в адипоцитах претерпевает олигомеризацию с формированием высокомолекулярной формы адипонектина, которая и реализует антидиабетические и кардиопротективные эффекты адипонектина. Несмотря на это плазмидная терапия с использованием гена адипонектина является перспективной стратегией для коррекции СД2Т. Последние экспериментальные данные указывают на перспективу плазмидной экспрессии регуляторов аутофагии, в частности белка р62, для коррекции ИР и СД2Т [22]. Однако системная регуляция аутофагии, которую обеспечивает плазмидная экспрессия р62, может иметь массу побочных эффектов. Таким образом, применение плазмидной терапии для коррекции ИР и СД2Т возможно при условии, что продукт целевого гена способен оказывать системные эффекты на регуляцию углеводного обмена. Вирусная генная терапия сахарного диабета 2-го типа Как обсуждалось ранее, для вирусной генной терапии используется два основных типа вирусных векторов: лентивирусы и ААВ. Лентивирусы используются в основном для исследовательских целей, в животных моделях и для ex vivo терапии. ААВ используются в основном для in vivo переноса генов в клетки. Тем не менее использование ААВ-векторов имеет ряд проблем, среди которых низкая эффективность сборки вирусных частиц, а также существенные ограничения на размер вставки (не более 3500 п. о.). Лентивирусы обладают значительно более высокой эффективностью сборки вирусных частиц, заражения неделящихся клеток, к которым относятся и адипоциты, а также более значительным объемом вставки (до 9000 п. о.). Вирусные векторы в генной терапии позволяют использовать таргетную доставку с использованием тканеспецифичных промоторов, вирусов разной тропности, а также вставлением кассет антисмысловых олигонуклеотидов к микроРНК неспецифично трансдуцируемых тканей. Данные подходы успешно реализуются в экспериментальных статьях, применительно к жировой ткани [23-25]. Среди используемых таргетных генов в АВВ-векторах для коррекции СД2Т - ГПП-1 и лептин. Потенциал таргетной генной терапии с использованием гена ГПП-1 для стимуляции регенерации бета-клеток островков Лангерганса во время тяжелых поражений поджелудочной железы при длительном СД2Т чрезвычайно высок [26]. Помимо этого используется системное вирусное введение ГПП-1, что улучшает инсулиновую чувствительность животных [27, 28], однако, как говорилось выше, данный подход не имеет существенных преимуществ перед фармакологическими аналогами ГПП-1. Другой важной мишенью для системной генной терапии является адипокин лептин, который обладает анорексигенным и термогенным действиями, снижая массу тела и улучшая инсулиновую чувствительность. Так как лептин является гормоном жировой ткани, действующим системно, то системная вирусная генная терапия с использованием гена лептина демонстрирует позитивные эффекты на регуляцию инсулиновой чувствительности животных [29, 30]. Перспективным направлением видится применение гена интерлейкина-4 (ИЛ-4) в таргетной вирусной терапии СД2Т для коррекции ИР жировой ткани [31-33]. Доставка ИЛ-4 может реализовываться с использованием нескольких уровней таргетности доставки. В случае использования ААВ-векторов, обладающих тропностью к жировой ткани (8-й и 9-й серотипы ААВ), в сочетании с адипоспецифичными промоторами (промоторы адипонектина, FABP4 и т. д.) и антисмысловыми кассетами к микроРНК неспецифически трансдуцируемых данными серотипами ААВ тканям (антисмысловые кассеты к микроРНК, специфичным для кардиомиоцитов и гепатоцитов), можно достичь максимальной специфичности введения гена ИЛ-4 в адипоциты для коррекции латентного воспаления и ИР жировой ткани. Таким образом, вирусная генная терапия способна высокоспецифично корректировать инсулиновую чувствительность всех инсулин-зависимых тканей, однако для создания конкретных препаратов необходимо значительное усовершенствование систем доставки генетических конструкций. Заключение Безусловно, состояние генной терапии СД2Т в настоящее время не позволяет говорить о серьезном выходе в клиническую практику. Только некоторая часть плазмидных конструкций с антидиабетическим потенциалом находится сейчас на стадии клинических испытаний в Европе и Северной Америке и пока что не готова конкурировать с комплексным подходом к комбинированной медикаментозной терапии, рекомендованной American Diabetes Association и European Association for Study of Diabetes. Однако стоит заметить, что генно-терапевтический подход обладает значительным преимуществом перед медикаментозной терапией СД2Т - отсутствием необходимости постоянно с небольшими интервалами времени принимать препарат, что, в сочетании с высокой специфичностью и, как следствие, широкими возможностями регуляции гомеостаза инсулин-зависимых тканей, делает генно-терапевтический подход к коррекции СД2Т перспективнейшим направлением исследований.

About the authors

Yu S Stafeev

National Medical Research Centre for Cardiology of the Ministry of Health of the Russian Federation; M.V. Lomonosov Moscow State University

Email: yuristafeev@gmail.com
Moscow, Russia

M Yu Menshikov

National Medical Research Centre for Cardiology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Moscow, Russia

Ye V Parfyonova

National Medical Research Centre for Cardiology of the Ministry of Health of the Russian Federation; M.V. Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

References

Supplementary files