Serum uromodulin as an early biomarker of tubular atrophy and interstitial fibrosis in patients with glomerulopathies

Full Text

БМИ - болезнь минимальных изменений ДПСК - доля полностью склерозированных клубочков ИФ - интерстициальный фиброз МН - мембранозная нефропатия МПГН - мембрано-пролиферативный гломерулонефрит рСКФ - расчетная скорость клубочковой фильтрации СКВ - системная красная волчанка ТА - тубулярная атрофия ТХБ - белок Тамма-Хорсфалла ФСГС - фокально-сегментарный гломерулосклероз ХБП - хроническая болезнь почек ЦисС - цистатин С IgA - иммуноглобулин А Sumo - концентрация уромодулина в сыворотке крови Ucr - концентрация креатинина в моче Uumo - концентрация уромодулина в моче Уромодулин (белок Тамма-Хорсфалла; Umo; ТХБ) - специфический почечный протеин, синтезирующийся исключительно в эпителиальных клетках толстого восходящего отдела петли Генле и начального отдела дистального извитого канальца. ТХБ секретируется преимущественно в просвет канальца и далее попадает в мочу. Меньшая часть уромодулина секретируется через базолатеральную мембрану в почечный интерстиций и, в конечном итоге, поступает в системный кровоток [1-4]. ТХБ приписывают много важных физиологических свойств: противодействие камнеобразованию, развитию инфекций мочевыводящих путей, участие в регуляции тубулярного транспорта натрия, воды, двухвалентных катионов, уровня артериального давления и реализации иммунного ответа в интерстиции почек. Уромодулин, по-видимому, может оказывать как нефропротекторное, так и повреждающее действие на почки («парадоксы уромодулина» по T.M. El-Achkar и X.R. Wu [4]). Например, при изменении своих физико-химических свойств он может стать промоутером кристаллизации мочи, а при поступлении в интерстиций - провоцировать или усиливать воспалительную реакцию, усугубляя тубулоинтерстициальные повреждения и фиброз [3-6]. Результаты ряда [7, 8], хотя и не всех [9, 10], работ свидетельствуют о том, что концентрация уромодулина в моче (Uumo) и экскреция ТХБ позитивно, хотя и сравнительно слабо, связаны с уровнем СКФ. Напротив, в одном исследовании показано, что высокий уровень Uumo является предиктором развития хронической болезни почек (ХБП) [11]. В последние годы возрос интерес к концентрации уромодулина в сыворотке крови, которая, как оказалось тесно прямо коррелирует с величиной расчетной скорости клубочковой фильтрации (рСКФ). Кроме того, оказалось, что величина сывороточной концентрации ТХБ может являться более ранним и чувствительным маркером хронической почечной дисфункции, чем некоторые другие общепризнанные показатели (например, цистатин С - ЦисС) [12-15]. Тем не менее многие стороны проблемы использования сывороточного ТХБ как индекса состояния почек остаются нерешенными. Например, крайне мало изучена связь между концентрацией уромодулина в сыворотке крови и выраженностью морфологических повреждений паренхимы почек у пациентов с заболеваниями почек. В связи с этим мы и провели настоящее исследование. Материалы и методы Работа основана на обследовании 84 человек (41 мужчина, 43 женщины), возраст - 17-78 лет. По диагнозам участники исследования распределены следующим образом: группа первичных и вторичных гломерулопатий: IgA-нефропатия (IgA, n=18), мембрано-пролиферативный гломерулонефрит (МПГН, n=12), фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС, n=19), болезнь минимальных изменений (БМИ, n=14), мембранозная нефропатия (МН, n=12), системная красная волчанка (СКВ, n=6) и системные васкулиты (n=3) с поражением почек. Контрольную группу здоровые лица (контроль, n=11). Все пациенты проходили стационарное клиническое, лабораторное и инструментальное обследование согласно внутренним стандартам для пациентов с заболеваниями почек ПСПбГМУ им. И.П. Павлова. Рутинные клинико-биохимические параметры (концентрации креатинина и мочевины в сыворотке крови и моче, концентрация белка в моче и др.) устанавливались с помощью современных лабораторных анализаторов, строго согласно существующим инструкциям. Концентрации ТХБ в сыворотке крови (Sumo) и моче, собранной за сутки (Uumo), измерялись иммуноферментным способом с использованием наборов Human Uromodulin ELISA (BioVendor, Брно, Словакия). Все операции проводились в соответствии с действующими наставлениями к наборам. В конечном итоге, на основе выполненных измерений, получены характеристики метаболизма ТХБ, представленные в табл. 1. Содержание ЦисС в сыворотке крови определяли методом иммунотурбидиметрии (наборы фирмы Alfresa Pharma Соrporation, Япония) на приборе Furuno CA-90 (Furuno Electric Co., Ltd., Япония) согласно действующим инструкциям. Величина СКФ рассчитывалась по формуле CKD-EPI с помощью официальных интернет-калькуляторов на основе концентраций сывороточного креатинина (рСКФ), ЦисС (рСКФcys) и комбинации концентраций креатинина и ЦисС (рСКФcr/cys) в сыворотке крови [16]. Кроме того, выполнялось определение величины почечного клиренса эндогенного креатинина (проба Тареева-Реберга; Ccr). Во внимание принимались значения величин СКФ, приведенные к стандартной площади поверхности тела 1,73 м2. Морфологическое исследование ткани почки включало анализ изменений на светооптическом уровне (семь стандартных окрасок). В нефробиоптатах устанавливалось общее число клубочков, рассчитывалась доля (%) полностью склерозированных клубочков (ДПСК). Тяжесть выраженности тубулярной атрофии (ТА) и очагового интерстициального фиброза (ИФ) оценивалась полуколичественно в баллах от 0 (отсутствие изменений) до 3 (значительная выраженность изменений) по системе, разработанной в НИИ нефрологии ПСПбГМУ им. И.П. Павлова. Полностью пригодными для детального морфологического анализа оказались 82 биоптата из 84. Статистический анализ полученных первичных данных выполнялся с помощью пакетов прикладных программ Statistica 10.0 и SPSS 20. Предварительная оценка первичных данных показала, что статистическое распределение подавляющего большинства изученных параметров не соответствуют нормальному. Поэтому для статистического анализа применялись непараметрические методы: критерии Манна-Уитни, непараметрический коэффициент корреляции Спирмена. Применялся также малочувствительный к характеру статистического распределения независимых переменных метод - ROC-анализ. В необходимых случаях проводилось сравнение значимости коэффициентов корреляции с помощью z-преобразования Фишера и вводились поправки на множественность сравнений с использованием False Discovery Rate (FDR) теста [17]. Как и во многих других медико-биологических исследованиях, уровень статистической значимости р составлял <0,05. Результаты У обследованных пациентов с гломерулопатиями имела место прямая высоко статистически значимая связь между оценками СКФ и Sumo (табл. 2). Наибольшие значения коэффициента ранговой корреляции Спирмена свойственны рСКФ, оцененной по формуле CKD-EPI на основе креатинина. Наименьшие значения коэффициента Спирмена отмечались между рСКФ, вычисленной на основе сывороточной концентрации ЦисС, и величиной Sumo (RS=0,424; см. табл. 2). При этом оно значимо не отличалось от величины коэффициента корреляции для рСКФ на основе креатинина (p=0,172). Очевидно, что значения других коэффициентов корреляции, представленных в табл. 2, еще более близки и различия между ними не могут иметь должной статистической значимости. Таким образом, оказалось, что теснота связи между расчетной СКФ, вычисленной по формуле CKD-EPI на основе сывороточного креатинина, и концентрацией уромодулина в сыворотке крови, по крайней мере, не меньше, чем сила связи между другими изученными оценками скорости гломерулярной фильтрации и Sumo. В силу данного обстоятельства для дальнейшего анализа нами использована именно величина рСКФ (CKD-EPI) на основе креатинина. Было установлено, что между рСКФ и показателями почечного транспорта ТХБ, в расчете которых непосредственно не участвуют значения СКФ, имеются статистически значимые связи. В частности, рСКФ прямо коррелировала с Uumo (RS=0,253; p=0,0219) и Uumo24 (RS=0,245; p=0,0268). Однако значения этих коэффициентов корреляции оказались статистически существенно более низкими (р=0,0093 и р=0,008, соответственно), чем величина коэффициента Спирмена между рСКФ и Sumo (см. табл. 2). Величина рСКФ высоко значимо обратно связана с ДПСК, ТА и ИФ (табл. 3). Характер ассоциаций Sumo c теми же морфологическими параметрами аналогичный (см. табл. 3), хотя теснота связи в данном случае оказалась несколько меньше. При этом величина коэффициента Спирмена между рСКФ и ДПСК была значимо больше, чем между Sumo и ДПСК (р=0,017). Таким же образом ситуация складывалась в отношении корреляций между рСКФ - ИФ и Sumo - ИФ (р=0,033). Доказать наличие статистической значимости различий в величинах коэффициента Спирмена в отношении связей рСКФ - ТА и Sumo - ТА не удалось (р=0,107). Ассоциации Uumo с морфологическими параметрами оказались менее тесными, чем связи Sumo с теми же показателями (см. табл. 3). При этом значимой корреляции между Uumo и ДПСК вообще не обнаружено (см. табл. 3). Однако величины коэффициентов корреляции Sumo - ТА и Sumo - ИФ существенно не превышали значения коэффициентов Uumo - ТА и Uumo - ИФ (p=0,470 и p=0,341, соответственно). Ассоциации EFumo с признаками повреждений паренхимы почек имели примерно тот же характер и ту же силу, что и корреляции в отношении Sumo, но противоположную направленность (см. табл. 3). В свою очередь, связи Uumo24 с морфологическими параметрами практически воспроизводили картину, характерную для Uumo (см. табл. 3). Оказалось, что у больных гломерулопатиями, даже при отсутствии ТА, по сравнению с контролем наблюдается тенденция к уменьшению Sumo (рис. 1, а), которая, однако, не достигает заданного уровня статистической значимости, тогда как величины рСКФ практически не изменяются. При выявлении уже незначительных признаков атрофии канальцев Sumo становится значимо ниже, чем у здоровых людей (см. рис. 1, а). СКФ у этих же пациентов по-прежнему существенно не отличается от наблюдаемой в контрольной группе (см. рис. 1, а). При дальнейших степенях атрофии и Sumo, и рСКФ совместно уменьшаются (см. рис. 1, а). Ассоциации таких показателей экскреции ТХБ, как Uumo, Umo24 или Uumo/Ucr, аналогичных взаимосвязей с выраженностью атрофии канальцев не проявляли. При этом концентрация ТХБ в моче становилась значимо ниже, чем в контроле, только у больных с 3-й степенью тубулярной атрофии (рис. 1, б-г). Величина EFumo имела тенденцию, к нарастанию по сравнению с контролем начиная с 1-й степени ТА, которая достигала статистической значимости, подтвержденной поправкой на множественность сравнений, при максимальной выраженности атрофии канальцев (см. рис. 1, д). Изменения уромодулинового индекса (Uumo/рСКФ) в зависимости от тяжести ТА были незакономерными. В ряде случаев они формально достигали статистической значимости, которая, однако, не подтверждалась при введении поправки на множественность сравнений (см. рис. 1, е). Ассоциации Sumo с выраженностью фиброза почечного интерстиция практически повторяли картину, выявленную для ТА. При применении ROC-анализа для сравнения площадей под кривыми (Area Under Curve - AUC) для Sumo и рСКФ оказалось, что у пациентов с гломерулопатиями, даже при отсутствии признаков тубулярной атрофии, величина AUC для концентрации ТХБ в сыворотке крови составляет 0,656±0,101 (средняя ± стандартная ошибка), а для рСКФ - только 0,429±0,099. Напомним, что, согласно некоторым подходам к оценке результатов ROC-анализа, величина AUC на уровне 0,6-0,7 соответствует среднему качеству модели, а сам показатель AUC наиболее приемлем для сравнения нескольких моделей [18]. Однако ни Sumo, ни, тем более, рСКФ в данном случае не позволяли надежно дифференцировать здоровых людей и пациентов с отсутствием явных признаков тубулярной атрофии (р=0,146 и p=0,508, соответственно). Еще более впечатляющими оказались сравнения результатов ROC-анализа в отношении рСКФ и Sumo в контрольной группе и у больных с незначительной степенью атрофических изменений канальцев. Здесь значение AUC для Sumo достигло 0,725±0,090 (p=0,027, хорошее качество модели), а для рСКФ - только 0,580±0,083 (p=0,428), что близко к «бесполезному классификатору» [18]. Что касается здоровых лиц и пациентов с умеренной и выраженной степенью ТА (больные с умеренной и выраженной ТА здесь объединены из-за небольшого числа последних), то на основе и рСКФ, и Sumo их можно разграничивать со степенью уверенности (AUC - 0,920±0,055; p<0,0001 и AUC - 0,873±0,059; p<0,0001, соответственно), близкой к «идеальной» модели [18]. Аналогичный анализ в отношении ИФ дал почти идентичные результаты. Обсуждение Результаты наших исследований четко указывают на то, что концентрация ТХБ в сыворотке крови пациентов с ХБП значимо прямо связана с различными оценками СКФ. Эти данные полностью согласуются с результатами большинства последних исследований, выполненных на современном методическом уровне [12-15] и включавших большое число наблюдений (от 165 [15] до 426 [14]) и с результатами нашего пилотного исследования [19]. Только в одной сравнительно недавней работе не найдено отчетливой ассоциации между рСКФ и концентрацией уромодулина в сыворотке крови [7]. Также результаты наших исследований показали, что между рСКФ и Uumo или Uumo24 значения коэффициентов корреляции статистически существенно ниже, чем величина коэффициента Спирмена между рСКФ и Sumo. Данные литературы по этому вопросу ограниченны и противоречивы, но они скорее согласуются с тем, что связь между экскрецией уромодулина и СКФ если и существует, то выражена она значительно меньше, чем корреляция между рСКФ и Sumo [7-10]. Мы обнаружили, что величина СКФ у пациентов с гломерулопатиями примерно с одной силой связана как с клубочковыми (ДПСК), так и с тубулоинтерстициальными поражениями (ТА или ИФ - см. табл. 3). Стоит иметь в виду, что наличие тесных связей оценок СКФ с выраженностью тубулоинтерстициальных изменений (подчас более тесных, чем связи между СКФ и повреждениями гломерул) - факт давно и хорошо установленный [20, 21]. Результаты ряда исследований, несмотря на некоторые расхождения, свидетельствуют о том, что концентрация уромодулина в сыворотке крови может уменьшаться уже на ранних стадиях ХБП, когда рСКФ еще нормальна или незначительно снижена [12-15]. При этом полученные нами данные однозначно указывают на то, что уровень уромодулина в сыворотке крови может быть маркером наличия незначительно выраженной ТА и ИФ. Они в определенной степени согласуются с результатами морфологических ультраструктурных исследований J.E. Scherberich и соавт. [15], которые позволили предположить, что «Sumo является ранним индикатором, характеризующим функциональную целостность и жизнеспособность толстого восходящего отдела петли Генле». Поэтому клиническая значимость сывороточной концентрации ТХБ как диагностического теста для выявления начальных повреждений паренхимы почек (в том числе атрофически-фибротических) должна заслуживать самого пристального внимания. Интересно, что показатели мочевой экскреции уромодулина в таком ключе, по-видимому, рассматриваться не могут, поскольку они если и начинают снижаться, то только при выраженной атрофии и фиброзе, когда отчетливо реагирует и величина рСКФ (см. рис. 1). Исходя из результатов собственных исследований и представлений о двунаправленной (люменальной и базолатеральной) секреции уромодулина в толстом восходящем отделе петли Генле, J.E. Scherberich и соавт. [15] предложили схематическую модель, описывающую механизм снижения Sumo по мере нарастания тяжести хронического повреждения почек. Мы считаем, что она не учитывает важный факт - запаздывание снижения экскреции уромодулина с мочой по сравнению со снижением его концентрации в сыворотке крови при прогрессировании ХБП, которое четко установлено в настоящем исследовании. Наши результаты дали основание дополнить и несколько уточнить представления об изменениях почечного транспорта ТХБ при нарастании проявлений хронической структурно-функциональной дезинтеграции почек (рис. 2). В здоровой почке (рис. 2, а) в клетках толстого восходящего отдела петли Генле происходит биосинтез уромодулина (черные кружки), большая часть которого секретируется в просвет канальца (Л - «люмен» на рис. 2) и далее выделяется с мочой. Меньшее количество ТХБ попадает в интерстиций (И - на рис. 2) и затем по перитубулярным капиллярам поступает в системный кровоток (см. рис. 2, а). При прогрессировании хронической патологии почек, развитии начальных проявлений тубулярной атрофии и интерстициального фиброза базолатеральная секреция ТХБ существенно снижается (рис. 2, б), что, в конечном итоге, вызывает уменьшение Sumo. Выделение этого гликопротеина в просвет канальца и, соответственно, его экскреция с мочой еще значительно не страдают (см. рис. 2, б). На поздних этапах ХБП развиваются выраженные ТА и ИФ, уменьшается число клеток толстого восходящего отдела петли Генле вследствие сокращения массы действующих нефронов (рис. 2, в). В такой ситуации базолатеральный транспорт уромодулина и его сывороточная концентрация снижаются еще больше (см. рис. 2, в). Секреция ТХБ в просвет канальца и дальнейшее поступление в мочу также начинают уменьшаться, хотя бы за счет гибели части клеток-продуцентов (см. рис. 2, в). При этом пока не известно, как ведет себя биосинтез уромодулина в отдельной клетке. Логично предположить, что в поврежденной клетке продукция этого белка должна снижаться. Однако нельзя отмести и противоположное предположение о том, что в оставшейся клеточной популяции толстого восходящего отдела петли Генле биосинтез ТХБ компенсаторно возрастает, хотя такое возрастание оказывается недостаточным для того, чтобы «перекрыть» уменьшение продукции, вызванное редукцией массы функционирующих нефронов. Для решения данного вопроса нужны дополнительные исследования. Мы полагаем, что более медленное снижение экскреции уромодулина по сравнению с уменьшением его сывороточной концентрации при прогрессировании ХБП имеет существенный биологический смысл. Хорошо известно, что, помимо прочего, ТХБ выступает в роли важного нефропротектора. Уромодулин противодействует развитию инфекций мочевых путей, вызывая слипание и деструкцию бактериальных фимбрий типов 1 и S [22-24]. Кроме того, ТХБ в моче препятствует камнеобразованию [25]. В связи с этим организм, по-видимому, должен стремиться поддерживать концентрацию уромодулина в моче на приемлемом уровне при снижении функции почек. В противном случае у пациентов с ХБП с наличием даже незначительной или умеренной почечной дисфункции можно ожидать драматического нарастания частоты инфекций мочевых путей или конкрементов, чего обычно не наблюдается в реальности. Заключение Таким образом, концентрация уромодулина в сыворотке крови начинает снижаться при минимальной выраженности ТА или интерстициального почечного фиброза, когда величины рСКФ еще остаются нормальными. Поэтому Sumo перспективна в качестве раннего биомаркера фиброзно-атрофических повреждений почек. Параметры ренальной экскреции ТХБ таким свойством, по-видимому, не обладают. Причиной запаздывания снижения мочевой экскреции уромодулина при прогрессировании ХБП по сравнению с уменьшением сывороточной концентрации этого белка, вероятно, является необходимость поддерживать достаточно высокую концентрацию ТХБ в моче для противодействия инфицированию мочевыводящих путей и камнеобразованию. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

A V Smirnov

Academician I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University, Ministry of Health of Russia

St. Petersburg, Russia

M Khasun

Academician I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University, Ministry of Health of Russia

St. Petersburg, Russia

I G Kayukov

Academician I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University, Ministry of Health of Russia

Email: kvaka55@mail.ru
St. Petersburg, Russia

O V Galkina

Academician I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University, Ministry of Health of Russia

St. Petersburg, Russia

V G Sipovski

Academician I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University, Ministry of Health of Russia

St. Petersburg, Russia

M M Parastaeva

Academician I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University, Ministry of Health of Russia

St. Petersburg, Russia

E O Bogdanova

Academician I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University, Ministry of Health of Russia

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files