Features of cellular structure of the induced sputum and profile of cytokines at sintropiya of bronchial asthma and obesity at young patients

Full Text

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ожирение приблизилось к рубежам пандемии: за последние годы распространенность ожирения увеличилась в три раза [1]. Более 1,5 млрд взрослого населения планеты имеют избыточный вес - индекс массы тела (ИМТ)>25 кг/м2, и более 500 млн - страдают ожирением (ИМТ>30 кг/м2) [2]. Недавние эпидемиологические исследования подтвердили наличие ассоциации избыточного веса и ожирения с бронхиальной астмой (БА) [3]. В настоящее время неоспоримо доказано, что при ожирении повышается риск развития БА и ухудшается контроль над ней, при этом формируется трудноконтролируемый фенотип с проявлениями дозозависимости или резистентности к ингаляционным глюкокортикостероидам (иГКС) [4]. Взрослые и дети, страдающие БА на фоне ожирения, чаще госпитализируются и дольше пребывают в стационаре, имеют больше дней нетрудоспособности и нуждаются в большем объеме лекарственной терапии, чем пациенты с БА и нормальной массой тела [5, 6]. Несмотря на имеющиеся данные, точные механизмы взаимовлияния БА и ожирения остаются неясными. Жировая ткань в настоящее время рассматривается не как пассивный склад энергии, а как важный эндокринный орган с рядом эффектов, в том числе на иммунную систему и цитокиновый профиль. Эозинофильное воспаление дыхательных путей уже давно считается одним из самых характерных признаков БА [7]. Однако множество исследований, опубликованных с середины 1990-х годов, демонстрировали опровержение данной «аксиомы» [8-10]. На сегодняшний день не вызывает сомнения утверждение о том, что эозинофил является ключевой эффекторной клеткой, участвующей в патогенезе БА. Большинство исследователей считают, что эозинофильные гранулы являются источником большого количества провоспалительных и токсических веществ, главные из них - катионные белки (большой основной протеин, эозинофильный катионный белок, эозинофильный нейротоксин, эозинофильная пероксидаза), которые вызывают деструкцию и десквамацию эпителия слизистой оболочки бронхов, повышают проницаемость сосудов, а также вызывают дегрануляцию тучных клеток. Эозинофилы играют важную роль в выработке «фибриногенных» ростковых факторов, которые стимулируют функциональную активность фибробластов, вырабатывающих коллагены I, III, IV, VIII типов [11, 12]. Коллагены откладываются в базальной мембране, вызывая ее утолщение. Вместе с тем имеется ряд исследований, установивших, что не более 50% больных БА имеют эозинофильное воспаление дыхательных путей [13]; в то же время часто обострения БА происходят в отсутствие эозинофилов в дыхательных путях [14]; кроме того, специфическая антиэозинофильная терапия, например анти-ИЛ-5 и ИЛ-12, оказалась слабоэффективной в естественных условиях [15, 16]. Таким образом, на сегодняшний день вопрос о существовании нейтрофильного типа воспаления БА уже не вызывает сомнения. Нейтрофилы, являясь главными клетками воспаления, способны произвести значительное повреждение дыхательных путей и вызвать в дальнейшем их гиперреактивность, благодаря способности вырабатывать мощные липидные медиаторы, такие как простагландины, тромбоксаны, лейкотриен В4 (LTB4), фактор активации тромбоцитов, активные формы кислорода (АФК), цитокины, например интерлейкины (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8), ген фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), которые, по крайней мере, теоретически вовлекаются в развитие БА [17]. Нейтрофильный тип воспаления инициирует оксидативный стресс, который способен приводить к дисфункции, цитолизу и апоптозу эпителиальных клеток. Цель работы: оценить изменения клеточного состава индуцированной мокроты (ИМ) у больных БА молодого возраста во взаимосвязи с ИМТ и уровнем цитокинов в плазме крови. Материалы и методы Согласно поставленной цели обследовано 204 человека: 164 больных БА, которые разделены на 2 группы с учетом ИМТ, группу контроля составили 40 практически здоровых добровольцев. В 1-ю группу включены больные БА с ИМТ от 18 до 25 кг/м2, во 2-ю группу вошли больные БА с ИМТ от 30 до 40 кг/м2. Критерии включения: персистирующая БА легкого, среднетяжелого и тяжелого течения; возраст более 18 и менее 44 лет с ранее установленным диагнозом БА; подтвержденная данными спирографии бронхиальная обструкция, носящая обратимый характер [прирост объема форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1) ≥12% и >200 мл от исходного уровня после пробы с 400 мкг сальбутамола]; возможность правильного использования базисных препаратов; адекватная оценка своего состояния (по мнению исследователя). Критерии исключения: обострение БА, возраст старше 44 лет; наличие цереброваскулярных заболеваний (острые нарушения мозгового кровообращения, транзиторные ишемические атаки); заболевания сердца; злокачественные новообразования; тяжелая почечная и печеночная недостаточность; беременные и кормящие грудью женщины; сахарный диабет; хроническая обструктивная болезнь легких. Больные, независимо от тяжести течения заболевания, при включении в исследование получали базисную терапию и находились вне обострения заболевания в течение последних 2 мес (табл. 1). Группу контроля составили 40 человек [20(50%) женщин и 20(50%) мужчин], медиана возраста 23 [22; 25] года. Всем пациентам проводилась оценка наличия избыточного веса и определение степени ожирения в соответствии с рекомендациями ВОЗ на основании определения нескольких показателей: ИМТ, или индекс Кетле, и характер распределения жировой ткани, т.е. отношение окружности талии (ОТ) к объему бедер (ОБ) (ОТ/ОБ). У всех пациентов с ИМТ>30 кг/м2 отмечали абдоминально-висцеральное ожирение (отношение ОТ/ОБ >0,85 у женщин и >1,0 у мужчин по Stern и соавт., 1995) [18]. Абдоминальное ожирение вызывает нарушение функции респираторной системы, что связано с избыточным объемом мягких тканей, жировой инфильтрацией грудной клетки, увеличением легочного объема крови [19]. Данные, полученные S.A. Shore (2013) [20], указывают, что не само избыточное накопление жира является фактором риска БА, а именно расположение его в абдоминальной области. Так, абдоминальное ожирение при ОТ у женщин > 88 см и у мужчин > 102 см связано с большим риском развития БА, чем общее ожирение - ИМТ ≥ 30 кг/м2. Степень контроля оценивали по критериям GINA и с помощью стандартизированного опросника ACQ -5. Сбор ИМ и подсчет клеточного состава выполняли по общепринятой методике [21, 22]. Определение содержания интерлейкинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-17, ФНО-α, интерферона-γ (ИНФ-γ) в плазме периферической крови производили методом твердофазного иммуноферментного анализа eBioscience (USA). Статистическую обработку результатов проводили с помощью прикладных программ IBM SPSS Statistics 19. (9IT8Z9GMPC93CBSGEAQNXZWMSCUF4VOAZYATE6L8ZKMNAMRUMAJWY5F8DM2HBSBXIHHB6I5UBFY6MY2THMJFYUTP2UEM8792M57# «1200» version «190», expires Midnight of Feb 29, 2012, exclusive). Количественные значения представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного интервала (Q1 и Q3), где Q1 - 25-й процентиль, Q3 - 75-й процентиль. Качественные переменные описаны абсолютными и относительными частотами (процентами). При сравнительном анализе групп по количественным признакам использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни (не зафиксировано нормальное распределение выборок, определяемое по методу Колмогорова-Смирнова и критерию Шапиро-Уилка). Для оценки связи признаков применяли корреляционный анализ с расчетом корреляции по методу Спирмена. Различия считались статистически достоверными при p<0,05. Результаты и обсуждение При синтропии БА и алиментарного ожирения даже в молодом возрасте и при меньшей длительности заболевания чаще встречаются больные со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания - 89% против 60% в 1-й группе (р<0,005; см. рисунок). В то же время в группе больных с ожирением выраженность бронхообструктивного синдрома более значима, что подтверждается более частыми дневными симптомами астмы (р=0,049) и более высокой потребностью в короткодействующих β-агонистах (КДБА; р=0,003). При сравнении показателей периферической крови мы отметили, что в обеих группах имелась тенденция к лейкоцитозу (табл. 2). Вместе с тем у больных 2-й группы регистрировалось более высокое содержание нейтрофилов в периферической крови по сравнению с пациентами, имеющими нормальный ИМТ, и контролем. Так, нейтрофилез в клиническом анализе крови выявлен у 65% больных 2-й группы (табл. 2). На сегодняшний день ряд авторов выделяют 4 основных типа воспаления при БА: эозинофильное (эозинофилы>3% в ИМ), нейтрофильное (нейтрофилы>61%), смешанное гранулоцитарное (эозинофилы>3% + нейтрофилы>61%) и малогранулоцитарное (эозинофилы и нейтрофилы в пределах нормы) [23, 24]. По результатам исследования клеточного состава ИМ в целом по группе установлено ряд особенностей. Полученные результаты свидетельствуют о преобладании эозинофильного типа воспаления в группе больных с ИМТ менее 25 кг/м2, тогда как у пациентов с ожирением определялось малогранулоцитарное воспаление (табл. 3). Однако при анализе клеточного состава ИМ в зависимости от степени тяжести заболевания отмечено, что ни одну из исследуемых групп нельзя причислить к какому-то одному известному биофенотипу БА. Мы отметили, что у больных БА с ИМТ менее 25 кг/м2 при легком течении заболевания 1/4 пациентов (23%) имели малогранулоцитарное воспаление, а большинство пациентов (77%) относились к эозинофильному биофенотипу. Среднетяжелое течение БА в этой группе характеризовалось практически равным разделением на эозинофильный (55%) и малогранулоцитарный (45%) биотип. При тяжелом течении БА подавляющее большинство пациентов имели эозинофильный тип воспаления, и всего у 1 пациента отмечен малогранулоцитарный биологический фенотип. Согласно нашему исследованию, установлено, что нарастание эозинофилии ИМ происходит параллельно степени тяжести заболевания (табл. 4). При анализе клеточного состава ИМ у пациентов с повышенным ИМТ регистрировали преимущественно малогранулоцитарное воспаление (эозинофилы<3% + нейтрофилы<61%). При этом с тяжестью течения БА встречаемость данного биотипа снижалась. Так, в группе с легким течением малогранулоцитарное воспаление регистрировали у абсолютного числа больных (99%), в группе со среднетяжелым течением - у 67% пациентов, в группе с тяжелым течением заболевания - у 40% пациентов. Наиболее разноплановыми в плане фенотипа воспаления оказались пациенты с избыточной массой тела и БА средней степени тяжести: 67% пришлось на долю малогранулоцитарного типа воспаления, 17% - на эозинофильный тип, 3% - на смешанный гранулоцитарный тип. При синтропии ожирения и БА тяжелого течения большая доля пришлась на нейтрофильный тип воспаления - 60% и 40% составило малогранулоцитарный биотип (табл. 5). По данным литературы, при фенотипе воспаления в бронхиальном дереве, характеризующимся эозинофилией мокроты, таблетированные и ингаляционные формы ГКС дают лучший клинический эффект, чем при фенотипах, характеризующихся неэозинофильным или нейтрофильным воспалением [25, 26]. Известно, что нейтрофилы, секретирующие биологически активные вещества, в частности факторы воспаления, могут приводить к образованию АФК, гиперсекреции мокроты и повреждению дыхательных путей. Связь нейтрофильного воспаления с терапевтической резистентностью обусловливает прогрессирование бронхообструкции [27]. Мы провели анализ изменения уровней цитокинов в зависимости от ИМТ, степени тяжести БА и типа воспаления. В группе пациентов, имеющих нормальную массу тела, при легком течении заболевания, как при эозинофильном типе воспаления, так и при малогранулоцитарном, вне зависимости от степени тяжести регистрировали повышение ИЛ-15 по сравнению с контрольной группой. В группе больных с эозинофильным биотипом определялось статистически значимое повышение Th2-зависимого ИЛ-4 в сравнении с практически здоровыми. Кроме того, уровень ИЛ-4 нарастал параллельно степени тяжести заболевания (р<0,05). Среднетяжелое и тяжелое течение этого биофенотипа характеризовалось и значимым повышением Th1-зависимого ФНО-α в сравнении с контролем. При тяжелом течении БА, помимо нарастания ФНО-α, ИЛ-4, ИЛ-15, статистически значимо увеличивалась концентрация Th1-зависимого ИНФ-γ, при одновременном снижении противовоспалительного ИЛ-10 (табл. 6). Таким образом, параллельно утяжелению заболевания при эозинофильном воспалении отмечалось статистически значимое увеличение в периферической крови уровня ИЛ-4, ФНО-α, ИЛ-15, ИНФ-γ, при малогранулоцитарном воспалении - повышение концентрации ФНО-α, ИЛ-15. При исследовании баланса цитокинов в плазме крови в группе пациентов с повышенной массой тела и имеющих малогранулоцитарный тип воспаления по данным ИМ, в зависимости от степени тяжести заболевания, выявлено статистически значимое увеличение концентрации ИЛ-15, ИНФ-γ, ИЛ-17 и снижение ИЛ-10 в сравнении с контролем. Одновременно во всех группах параллельно степени тяжести БА отмечалось увеличение ИНФ-γ. Кроме того, при тяжелом течении заболевания регистрировали статистически большие уровни ФНО-α, ИЛ-15, ИЛ-8 и достоверно меньшую концентрацию ИЛ-10 в сравнении с легким и среднетяжелым течением БА. Анализ изменения концентрации цитокинов в крови при малогранулоцитарном биотипе показал более высокие значения ИЛ-2 и ИНФ-γ у пациентов с избыточной массой тела во всех исследуемых группах в зависимости от степени тяжести, а также ФНО-α при легком течении заболевания. Эозинофильный биотип у пациентов с ИМТ более 30 кг/м2 характеризовался высокими значениями ФНО-α, ИЛ-4, ИЛ-15, ИЛ-2 и ИНФ-γ по сравнению с изучаемыми показателями здоровых лиц. Интересные изменения отмечены при смешанном фенотипе воспаления: выявлено статистически значимое увеличение концентрации всех изучаемых цитокинов: провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-α; Th1-зависимых ИЛ-2, ИЛ-15, ИНФ-γ и Th2-зависимых ИЛ-4, ИЛ-10, Th17 - ИЛ-17 (табл. 7). Более того, зарегистрированы самые высокие уровни ФНО-α, ИНФ-γ, ИЛ-10 среди всех выявленных биотипов (р<0,05). Нейтрофильный тип воспаления показал аналогичную трансформацию цитокинового профиля, за исключением ИЛ-10, который статистически значимо не отличим от контроля (р>0,05). При этом биотипе получены самые высокие концентрации ИЛ-15, ИЛ-2, ИЛ-8 и ИЛ-17 в сравнении с остальными типами воспаления и контролем (р<0,05). Выявлены статистически значимые различия между группами в уровне ИЛ-17 в периферической крови: наиболее высокое содержание ИЛ-17 регистрировали у больных БА с ожирением как в сравнении с показателями больных с нормальным ИМТ, так и с практически здоровыми. Кроме того, мы установили положительную корреляционную взаимосвязь между уровнем ИЛ-17 в периферической крови и ИМТ (r=0,46, p<0,001). Известно, что основная функция Th17-клеток заключается в привлечении и активации нейтрофилов через продукцию ИЛ-8, ИЛ-6 и подавлении нейтрофильного апоптоза, что существенно снижает эффекты стероидной терапии. При проведении корреляционного анализа, как в зависимости от ИМТ, так и по группе в целом, не установлено корреляционных взаимосвязей между уровнем эозинофилов в периферической крови и содержанием эозинофилов в ИМ, между уровнем нейтрофилов в периферической крови и содержанием нейтрофилов в ИМ. Вероятно, имеется необходимость внедрения в рутинную практику стационара методики получения ИМ при неэффективности подобранной базисной терапии для определения принадлежности к определенному биофенотипу с целью назначения адекватного противовоспалительного лечения. Результаты корреляционного анализа продемонстрировали взаимосвязь между клеточным составом ИМ и уровнем цитокинов в крови в определенных биофенотипах. Так, при эозинофильном фенотипе выявлена положительная взаимосвязь между содержанием эозинофилов ИМ и ИЛ-4 (r=0,41; p=0,045). В группах с малогранулоцитарным воспалением определяли положительные взаимосвязи между содержанием нейтрофилов в ИМ и концентрацией ИЛ-15 (r=0,81; р<0,001), ИЛ-2 (r=0,66; p<0,001), ИЛ-8 (r=0,68; р<0,001), ИЛ-17 (r=0,58; р=0,002), а также выявлена прямая взаимосвязь между уровнем нейтрофилов ИМ и ИНФ-γ (r=0,39; р=0,046). При нейтрофильном типе воспаления получены положительные корреляционные взаимосвязи между уровнем нейтрофилов ИМ и ИЛ-17 (r=0,71; р=0,031), ИЛ-6 (r=0,41; р=0,033). Роль нейтрофильного воспаления в формировании фенотипа БА с ожирением подтверждается установлением положительной корреляционной взаимосвязи между содержанием нейтрофилов в ИМ и итоговым баллом теста по оценке контроля симптомов астмы ACQ-5 (r=0,69, р<0,001), кроме того, регистрировалась отрицательная взаимосвязь между уровнем нейтрофилов в крови и результатом теста по контролю над астмой - АСТ (r=-0,47, р=0,004). При интерпретации результатов анализа ИМ имеются факторы, которые могут влиять на ее клеточный профиль. Так, известно, что прием иГКС, а также длительность базисной терапии могут способствовать повышению содержания нейтрофилов [28, 29] и снижению уровня эозинофилов в дыхательных путях [30]. В данной работе мы не получили значимых корреляционных взаимосвязей между уровнем нейтрофилов ИМ, дозой иГКС и давностью терапии. Заключение Оценка эндотипа перед началом базисной противовоспалительной терапии у больных с впервые диагностированной БА сможет помочь в подборе наиболее оптимального лечения каждому конкретному больному. Кроме того, стоит учитывать тот факт, что существует вероятность изменения воспалительных клеточных фенотипов с течением времени, а значит, имеется необходимость в повторном исследовании мокроты. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

I A Soloveva

Krasnoyarsk state medical university named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky; Regional Clinical Hospital

Email: solovieva.irina@inbox.ru
Krasnoyarsk, Russia

E A Sobko

Krasnoyarsk state medical university named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky; Regional Clinical Hospital

Krasnoyarsk, Russia

I V Demko

Krasnoyarsk state medical university named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky; Regional Clinical Hospital

Krasnoyarsk, Russia

A Yu Kraposhina

Krasnoyarsk state medical university named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky

Krasnoyarsk, Russia

M M Loktionova

Krasnoyarsk state medical university named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky

Krasnoyarsk, Russia

N V Gordeeva

Krasnoyarsk state medical university named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky; Regional Clinical Hospital

Krasnoyarsk, Russia

References

Supplementary files