Association between polymorphic markers in candidate genes and the risk of manifestationof endocrine ophthalmopathy in patients with Graves’ disease

Full Text

БГ - болезнь Грейвса ДИ - доверительный интервал ОШ - отношение шансов ПЦР - полимеразная цепная реакция рТТГ - рецептор тиреотропного гормона ЭОП - эндокринная офтальмопатия CTLA4 - поверхностный рецептор цитотоксических Т-лимфоцитов IFN-γ - интерферон γ IL - интерлейкин TGF-β - трансформирующий фактор роста β TNF - фактор некроза опухоли Эндокринная офтальмопатия (ЭОП) является аутоиммунным заболеванием, поражающим мягкие ткани орбиты и тесно ассоциированным с болезнью Грейвса (БГ). Как и другие аутоиммунные патологии, ЭОП считается многофакторным заболеванием с определенным вкладом генетических факторов и факторов окружающей среды. Данная патология мало изучена, и патогенез ее не до конца ясен. Тем не менее тесная взаимосвязь между аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы и ЭОП предполагает общий механизм развития заболеваний, ключевую роль в котором отводят антителам к рецептору тиреотропного гормона (рТТГ), однако разную генетическую предрасположенность. Поскольку ЭОП - это аутоиммунное заболевание, определенную роль в иммунном ответе играет соотношение про- и противовоспалительных цитокинов. Уровни синтеза цитокинов существенно зависят от уровня экспрессии соответствующих генов, а уровни экспрессии генов, в свою очередь, часто ассоциированы с полиморфными маркерами, расположенными в промоторной области соответствующих генов. Таким образом, определенные сочетания генотипов полиморфных маркеров могут предрасполагать к развитию ЭОП или, напротив, предохранять от развития этого заболевания, а также ассоциироваться с исходами лечения. Изучение генетической предрасположенности к ЭОП в основном проводилось на ряде монголоидных популяций и не может экстраполироваться на другие расы. В этих исследованиях выявлена ассоциация с полиморфными маркерами генов CTLA4, HLA-DRB1, TNF и ряда других [1-3]. По всей видимости, ЭОП относится к полигенным заболеваниям с многофакторным типом наследования. Необходимость продолжения исследований на больных русского происхождения не вызывает сомнений, так как известно, что вклад различных генов в формирование предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям существенно различается в разных популяциях. Целью настоящего исследования является изучение ассоциации полиморфных маркеров генов CTLA4, TNF, IL10 и IL16 с риском манифестации ЭОП у пациентов с болезнью Грейвса. Материалы и методы Нами разработаны методы идентификации аллелей полиморфных маркеров следующих генов-кандидатов: полиморфного маркера A60G (rs3087243) гена CTLA4, кодирующего поверхностный рецептор цитотоксических Т-лимфоцитов, полиморфного маркера G(-308)А (rs1800629) гена TNF, кодирующего фактор некроза опухоли, полиморфного маркера G(-1082)A (rs1800896) гена IL10, кодирующего интерлейкин 10 (IL10), и T3249C (rs4778641) гена IL16. Эти маркеры отобраны и использованы для изучения ассоциации генов-кандидатов с ЭОП у пациентов с БГ. Диагноз ЭОП верифицировали в соответствии с рекомендациями Европейской группы по изучению эндокринной офтальмопатии (EUGOGO), активность заболевания определялась по шкале клинической активности CAS (Clinical Activity Score), а тяжесть офтальмопатии - согласно классификации EUGOGO. Выборка этнически однородна, численность групп достаточна для получения достоверных данных. У всех пациентов получены образцы цельной крови. Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции после инкубации образцов крови с протеиназой К в 0,1% растворе додецилсульфата натрия. Термостабильная ДНК-полимераза получена от фирмы «Диалат» (Москва, Россия), протеиназа К - от фирмы «Диа-М» (Москва, Россия). Фрагменты геномной ДНК, содержащие полиморфные участки генов-кандидатов, амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклере ABI 7500 Fast (Applied Biosystems). Последовательности праймеров и зондов представлены в табл. 1. Статистический анализ полученных результатов проведен с использованием пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics 21 и программ статистического анализа Microsoft Excel 2010. Установление соответствия выборок равновесию Харди-Вайнберга проводили с использованием критерия χ2. Результаты В исследование включено 248 человек, из них 183 женщины и 65 мужчин, которые разделены на две группы: пациенты с БГ и сопутствующей ЭОП (БГ+ЭОП) и пациенты с БГ, не имеющие в анамнезе офтальмопатии (БГ-ЭОП). Общая характеристика пациентов приведена в табл. 2, группы не различались по возрасту, полу, возрасту манифестации БГ, однако среди пациентов с ЭОП преобладала доля курящих: 42,6% против 28,1% (p=0,034). Кроме того, пациенты с ЭОП чаще получали радикальное лечение тиреотоксикоза. Проведен сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфного маркера A60G (rs3087243) гена CTLA4 и G(-308)А (rs1800629) гена TNF, G(-1082)A (rs1800896) гена IL10, T3249C (rs4778641) гена IL16 в группах индивидов с БГ+ЭОП и БГ-ЭОП. Распределение частот генотипов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Полиморфный маркер гена CTLA4 Ген, кодирующий антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4), расположен на хромосоме 2q33. Изучалась роль в развитии ЭОП нескольких полиморфных маркеров гена CTLA4 - A49G, C-318T, +1822CT, A60G. В нашем исследовании мы использовали малоизученный полиморфный маркер A60G гена CTLA4, который ассоциирован с риском развития аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. Полиморфный маркер A60G (rs3087243) представляет собой однонуклеотидный полиморфизм (остатки гуанина или аденозина) в положении 11411 в 3’-нетранслируемой области. Мы проанализировали ассоциацию данного полиморфного маркера c риском манифестации ЭОП у пациентов с БГ. Частота аллеля А полиморфного маркера rs3087243 гена CTLA4 оказалась выше в группе пациентов с ЭОП, частота аллеля G - выше в группе пациентов с БГ без ЭОП (p=0,0001). Генотип АА достоверно чаще встречался в группе БГ+ЭОП, генотип GG - в группе БГ-ЭОП (p=0,0005). Таким образом, наши данные показали, что аллель А [отношение шансов (ОШ) = 2,11; 95% доверительный интервал (ДИ) 1,44-3,09] и генотип АА (OШ=3,99; 95% ДИ 1,58-10,05) ассоциированы с повышенным риском развития ЭОП в русской популяции. При этом аллель G (OШ=0,47; 95% ДИ 0,32-0,69) и генотип GG (OШ=0,43; 95% ДИ 0,25-0,72), напротив, ассоциированы с пониженным риском развития ЭОП. Таким образом, полиморфный маркер A60G (rs3087243) гена CTLA4 ассоциирован с риском развития офтальмопатии у пациентов русского происхождения с БГ. Полиморфный маркер гена TNF Фактор некроза опухоли является полифункциональным провоспалительным цитокином. В промоторной области гена TNF обнаружено несколько полиморфных участков, из них наибольший интерес представляет полиморфизм G/A в положении -238, так как он расположен в области связывания транскрипционного фактора АР-2. В нашем исследовании мы использовали полиморфный маркер G(-308)A (rs1800629) гена TNF, который находится в частичном неравновесии по сцеплению с маркером G(-238)A (rs361525) гена TNF в европеоидных популяциях. Анализ распределения частот аллелей и генотипов исследуемого полиморфного маркера гена TNF не выявил различий в частоте аллелей G и A у пациентов с ЭОП или без ЭОП. В то же время выявлены статистически достоверные различия в распределении частот генотипов. Генотип GG чаще встречается в группе пациентов с БГ+ЭОП, указывая на повышенный риск манифестации ЭОП с OШ=1,92 (95% ДИ 1,13-3,24). Генотип GA чаще встречается у пациентов с БГ без офтальмопатии (OШ=0,45; 95% ДИ 0,27-0,78). Таким образом, показана ассоциация полиморфного маркера G(-308)A гена TNF с риском развития офтальмопатии у пациентов русского происхождения с БГ. Кроме того, генотип GG чаще встречался у пациентов с ЭОП, имеющих двоение, с частотой 75,7% vs 64,8% (р=0,05). Полиморфный маркер гена IL10 IL10 описан как противовоспалительный цитокин, он подавляет синтез провоспалительных цитокинов T-клетками, снижает активность макрофагов, подавляет экспрессию антиген-презентирующих молекул и пролиферацию Т-клеток. В рамках настоящего исследования изучался полиморфный маркер G(-1082)A. Ген IL10 расположен на хромосоме 1q31-32. Полиморфный маркер G(-1082)A (rs1800896) представляет собой однонуклеотидный полиморфизм (остатки гуанина или аденозина) в положении -1082 в промоторной области гена. При сравнительном анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера G(-1082)A (rs1800896) гена IL10 получены статистически достоверные отличия. Показано, что в группе БГ+ЭОП аллель А и генотип АА были преобладающими, оказывая предрасполагающее влияние на риск развития ЭОП у пациентов с БГ (OШ=4,45; 95% ДИ 2,93-6,75 и OШ=6,34; 95% ДИ 3,63-11,08 соответственно). В то время как аллель G и генотип GG играли протективную роль и указывали на пониженный риск манифестации ЭОП (OШ=0,22; 95% ДИ 0,15-0,34 и OШ=0,09; 95% ДИ 0,03-0,33 соответственно). Таким образом, полиморфный маркер G(-1082)A (rs1800896) гена IL10 ассоциирован с развитием ЭОП у пациентов русского происхождения с БГ. Полиморфный маркер гена IL16 IL16 является провоспалительным цитокином, представляет собой хемоаттрактант, модулятор T-клеточной активации. Несомненное участие IL-16 в регуляции иммунного ответа способствовало тому, что кодирующий его ген рассматривали в качестве гена-кандидата при изучении генетической предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям. В рамках настоящего исследования мы изучали ассоциацию с ЭОП у пациентов с БГ полиморфного маркера T3249C (rs4778641) гена IL16, расположенного на 15-й хромосоме. Изучение распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера T3249C (rs4778641) гена IL16 не выявило статистически достоверных различий в группах БГ+ЭОП и БГ-ЭОП. Таким образом, не показана ассоциация полиморфного маркера T3249C (rs4778641) гена IL16 с риском развития офтальмопатии у пациентов русского происхождения с БГ. При оценке роли генетических маркеров в клинической манифестации ЭОП выявлена ассоциация полиморфного маркера A60G гена CTLA4 с тяжестью и активностью ЭОП. Пациенты с тяжелой ЭОП чаще имели генотип GG (50,0% vs 27,4%), а пациенты с легкой и среднетяжелой ЭОП - генотип АА (21,4% vs 8,3%; p=0,026). Кроме того, пациенты с исходно активной ЭОП чаще имели генотип GG (36,7% vs 27,2%), а c неактивной ЭОП - генотип AA (25,9% vs 10,0%; p=0,05). Полиморфный маркер A60G гена CTLA4 также ассоциировался с уровнем антител к рТТГ, пациенты с ЭОП и персистенцией антител к рТТГ выше 10 мЕд/л чаще имели генотип GG (45,2% vs 21,3%), в то время как пациенты с персистенцией антител менее 10 мЕд/л - генотип АА (28,8% vs 7,1%; p=0,003). Обсуждение Результаты исследований по изучению роли генетических маркеров в манифестации ЭОП немногочисленны и противоречивы. Это может быть обусловлено как различиями в дизайне и критериях включения в исследования, так и разной этнической принадлежностью. Кроме того, для многофакторных заболеваний, к которым относятся и БГ, и ЭОП, характерна реализация генетической предрасположенности к заболеванию при наличии определенных комбинаций генотипов и аллелей и пусковых средовых факторов. Ассоциация с ЭОП обнаружена для полиморфных маркеров ряда генов, кодирующих интерлейкины, трансформирующий фактор роста β (TGF-β), фактор некроза опухоли (TNF), интерферон γ (IFN-γ), CTLA4 и др. [1-10]. Поскольку инфильтрация ретробульбарных тканей Т-клетками играет ключевую роль в патогенезе ЭОП, ген CTLA4 может рассматриваться в качестве гена-кандидата, предрасполагающего к развитию ЭОП. Ген CTLA4 располагается на хромосоме 2q33 и кодирует поверхностный рецептор цитотоксических Т-лимфоцитов, являющийся негативным регулятором активации Т-клеток. CTLA4 является ко-рецептором на клеточной поверхности, связывающим лиганд B7, который активирует CD28 - важнейший компонент стимуляции Т-лимфоцитов. Наиболее часто в исследованиях используются однонуклеотидные полиморфные маркеры A49G и C(-318)T этого гена. Полиморфизму A/G в экзоне 1 соответствует аминокислотный полиморфизм Ala/Thr, который расположен в сигнальном пептиде молекулы CTLA4, а полиморфизм C(-318)T расположен в промоторной области. Полиморфизм Ala/Thr является единственным полиморфизмом, изменяющим первичную аминокислотную последовательность рецептора CTLA4. Полиморфный маркер C(-318)T ассоциирован с уровнем активности промотора и, следовательно, с разными уровнями экспрессии гена CLTA4, что в определенных случаях может приводить к снижению уровня активации Т-клеток. Таким образом, определенные генотипы этого полиморфного маркера можно рассматривать как предохраняющие по отношению к развитию аутоиммунных заболеваний. Британские ученые показали, что наличие и тяжесть ЭОП могут быть ассоциированы с геном CTLA4 [11]. Исследование в Китае показало, что аллель T полиморфного маркера C(-318)T гена CTLA4 ассоциирован с повышенным риском развития ЭОП, в то время как аллель G полиморфного маркера A49G ассоциирован с БГ [12]. Изучение ассоциации полиморфных маркеров гена CTLA4 с риском развития ЭОП стало предметом нескольких исследований в различных популяциях, в некоторых [11-13], но не во всех исследованиях обнаружена ассоциация с ЭОП [14, 15]. На сегодняшний день наиболее выраженная ассоциация с ЭОП обнаружена для полиморфного маркера G(-238)А гена TNF [2]. Ген TNF кодирует фактор некроза опухоли, ключевой воспалительный цитокин, принимающий участие в патогенезе ЭОП. Роль продукта гена TNF в развитии ЭОП остается неясной. Выявлена ассоциация полиморфного маркера G(-238)A (rs361525) гена TNF c риском развития ЭОП в польской и иранской популяции, а также полиморфных маркеров T(-1031)A и C(-863)A в японской популяции и C(-863)A - в китайской [2, 3, 16]. В различных исследованиях изучались полиморфные маркеры генов других цитокинов, вовлеченных в патогенез ЭОП: IL3, IL4, IL5, IL1A, IL1B, IL10, IL1R, IL12 и IL16, IL8, IL23R, IFN [4-9]. Ассоциации с риском манифестации ЭОП у пациентов с БГ получены для полиморфных маркеров генов IL1A, IL1B и IL10. Изучалась также ассоциация полиморфных маркеров генов, кодирующих молекулы межклеточной адгезии 1 (ICAM-1), рецептора глюкокортикоидов, молекулы В7, рецептора СD103, Toll-like рецептора и ряда других, однако достоверной ассоциации этих генов с ЭОП не обнаружено. Таким образом, до настоящего времени не удалось надежно идентифицировать основные гены, связанные с предрасположенностью к развитию ЭОП. Кроме того, не идентифицированы гены, ассоциированные с риском неблагоприятного течения и ответа на терапию ЭОП. Заключение Полученные нами результаты показали, что у пациентов с БГ в анамнезе и ЭОП достоверно повышены частоты встречаемости аллелей А и генотипов АА и снижена доля аллелей G и генотипа GG полиморфных маркеров rs3087243 гена CTLA4 и rs1800896 гена IL10, а также генотипа GG полиморфного маркера rs1800629 гена TNF, что может свидетельствовать о предрасполагающем влиянии генотипа риска AA и аллеля А полиморфного маркера rs3087243 гена CTLA4, генотипа риска АА и аллеля А rs1800896 гена IL10, а также генотипа GG полиморфного маркера rs1800629 гена TNF на риск развития ЭОП у пациентов русского происхождения с БГ. Таким образом, полиморфные маркеры rs3087243 гена CTLA4, rs1800896 гена IL10 и rs1800629 гена TNF ассоциированы с риском развития ЭОП у пациентов русского происхождения с БГ, что согласуется с результатами других исследований [1, 2, 5, 9, 10]. При этом показана ассоциация полиморфного маркера rs3087243 гена CTLA4 со степенью активности и тяжести ЭОП, уровнем антител к рТТГ, а также ассоциация rs3087243 гена CTLA4 и rs1800629 гена TNF с благоприятным течением ЭОП с неактивной формой, не требовавшей иммуносупрессивной терапии. Таким образом, риск манифестации и течение ЭОП у пациентов с БГ могут быть обусловлены не только средовыми, но и генетическими факторами риска, так же как и течение ЭОП. Информация о финансировании и конфликте интересов Исследование проведено при финансовой поддержке гранта РФФИ (проект №14-04-31758). Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов в связи с написанием данной статьи.

About the authors

N A Petunina

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia (Sechenov University)

Moscow, Russia

N S Martirosian

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia (Sechenov University)

Email: narinarine@list.ru
Moscow, Russia

L V Trukhina

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia (Sechenov University)

Moscow, Russia

S V Saakyan

Moscow Helmholtz Research Institute of Eye Diseases

Moscow, Russia

O G Panteleeva

Moscow Helmholtz Research Institute of Eye Diseases

Moscow, Russia

A M Burdennyy

N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences

Moscow, Russia

V V Nosikov

N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences

Moscow, Russia

References

Supplementary files