The role of podocytes dysfunction in chronic glomerulonephritis progression

Full Text

ГБМ - гломерулярная базальная мембрана ГН - гломерулонефрит ММТ - матриксные металлопротеиназы НС - нефротический синдром ПУ - протеинурия ХГН - хронический гломерулонефрит ЭМТ - эпителиально-мезенхимальная трансдифференциация VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста Хронический гломерулонефрит (ХГН) - заболевание, при котором воспаление развивается в клубочках и прогрессирует в результате ограниченных возможностей гломерулярных структур к регенерации. Центральным звеном развития протеинурии (ПУ), выраженность которой по-прежнему рассматривается как клинический эквивалент активности/прогрессирования ХГН, является повреждение подоцита - ключевого компонента фильтрационного барьера [1, 2]. Выполняя важную роль в поддержании структуры и функции почечного клубочка в норме, подоциты имеют первостепенное значение при его повреждении и прогрессировании заболевания почек. В 2002 г. M.R. Pollak объединил группу врожденных заболеваний, протекающих с первичным повреждением подоцитов и нефротическим синдромом (НС), термином «истинные подоцитопатии» [3]. К «истинным подоцитопатиям» относят болезнь минимальных изменений, фокальный сегментарный гломерулосклероз и мембранозную нефропатию. В настоящее время показано, что изменения структуры и функции подоцита выявляются при различных морфологических формах гломерулонефрита (ГН), протекающих с большой ПУ [4]. Стереотипной реакцией подоцита на разнообразные повреждающие факторы (иммунные, гемодинамические, метаболические) является снижение экспрессии структурных белков щелевой диафрагмы, что приводит к изменениям цитоскелета, формы подоцита, нарушению адгезии к гломерулярной базальной мембране (ГБМ) со слущиванием подоцитов в мочевое пространство, в результате чего нарушается барьерная функция гломерулярного фильтра и развивается ПУ [5, 6]. Основные функции подоцитов Гломерулярный фильтрационный барьер имеет первостепенное значение в ограничении гломерулярной проницаемости, в первую очередь, для альбумина и других белков плазмы крови. Он состоит из базальной мембраны капилляров, монослоя эндотелиальных клеток, выстилающих гломерулярный фильтр изнутри, и слоя подоцитов, которые выстилают гломерулярный фильтр снаружи, со стороны мочевого пространства [7]. Подоцитам и подоцит-ассоциированным молекулам придают в настоящее время наиболее важное значение в механизмах нарушения проницаемости гломерулярного фильтра и развитии ПУ [8]. Помимо формирования фильтрационного барьера, подоциты выполняют ряд других важных функций: участвуют в поддержании структуры капиллярных петель, противодействуют внутрикапиллярному гидростатическому давлению; обеспечивают эндоцитоз фильтрующихся белков и иммуноглобулинов; участвуют в процессах синтеза коллагена IV типа и репарации ГБМ; принимают участие в иммунном ответе путем экспрессии Toll-R4, B7.1 (CD80); обеспечивают нормальную функцию других клеток клубочка (мезангиальных, эндотелиальных) за счет продукции ряда факторов роста, в частности, сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) [2, 7, 9-11]. Ответ подоцитов на повреждение Повреждение подоцитов, которое в соответствии с расположением этих клеток снаружи капиллярной стенки ведет к нарушению ГБМ, лежит в основе развития ПУ и НС [12]. Структурными признаками повреждения подоцитов являются утрата ими малых отростков (распластывание ножек), микровиллезная трансформация апикальной поверхности, гипертрофия, эпителиально-мезенхимальная трансдифференциация, апоптоз клетки. Наиболее ранним признаком подоцитарного повреждения, определяемым только при электронной микроскопии, является распластывание ножек подоцита. Этот процесс осуществляется за счет перестройки актинового цитоскелета, перераспределения актиновых микрофиламентов, вследствие чего отростки подоцитов теряют свою форму. В результате распластывания ножек/отростков подоцитов щелевая диафрагма растягивается, межподоцитарное пространство увеличивается, возникает ПУ. Существует точка зрения, что распластывание ножек подоцитов является адаптивной реакцией, позволяющей ограничить гломерулярную проницаемость для белка и препятствовать более серьезному повреждению - формированию «оголенных» участков ГБМ [5, 13]. Распластывание ножек подоцитов происходит в два этапа. На первом этапе отростки подоцитов теряют форму [14]. Происходит потеря щелевой диафрагмы или ее апикальное перемещение. Этот этап является потенциально обратимым, так как в опытах на культуре клеток после прекращения воздействия повреждающего фактора происходит быстрое восстановление формы подоцитов [15]. На втором этапе исчезает субподоцитарное пространство, подоциты тесно прилегают к ГБМ [6]. Это было показано в эксперименте на животных моделях и при ГН у человека, включая болезнь минимальных изменений, мембранозную нефропатию и IgA-нефропатию [16]. На данном этапе наблюдаются полная утрата ножковых отростков подоцитов, их слияние с телом клетки, что приводит к широкому распластыванию подоцита в виде диска, который, покрывая большую площадь оголенной ГБМ, препятствует проникновению белка через гломерулярный фильтр. Однако процесс распластывания не может в полной мере предотвратить проникновение белка через гломерулярный фильтрационный барьер, меняются структура и функции щелевой диафрагмы, что в конечном итоге приводит к появлению ПУ. При распластывании подоциты формируют длинные апикальные микроворсинки - процесс, обозначаемый как «микроворсинчатая трансформация». Микроворсинки обладают способностью прикрепляться к гломерулярной или париетальной базальной мембране [17]. Их появление может свидетельствовать о попытке поврежденного подоцита найти место прикрепления к ГБМ в других, менее поврежденных зонах. Данный механизм является способом защиты подоцита от его гибели. Распластывание ножек подоцитов и «микроворсинчатая трансформация» в большинстве случаев предшествуют частичному или полному отслоению клетки от ГБМ. Одним из ответов подоцитов на действие повреждающих факторов является гипертрофия. На начальном этапе повреждения гипертрофия подоцитов носит адаптивный характер, наблюдается активация метаболических процессов, синтеза внутриклеточных белков, но без изменения функции подоцитов. За счет увеличения размера подоциты закрывают близлежащие области повреждения гломерулярного барьера (компенсация утраты клеток) [18, 19]. Но по истечении определенного времени гипертрофия становится маладаптивной, в гипертрофированных клетках наблюдается снижение синтеза подоцитарных белков, происходит реорганизация цитоскелета, что способствует их отслоению от ГБМ и развитию подоцитурии [18, 20]. Дальнейшие воздействия на гипертрофированные подоциты активируют в них процессы апоптоза. Отсоединившиеся от ГБМ подоциты вследствие нарушения клеточно-матриксных взаимосвязей, необходимых для сохранения их жизнеспособности, погибают, хотя было показано, что некоторые слущенные подоциты еще «жизнеспособны» и могут образовывать контакты с другими клетками в культуре [21]. Апоптоз в подоцитах активируют ангиотензин II, трансформирующий фактор роста β1, активные кислородные радикалы, отслоение от ГБМ, механическое растяжение, снижение ингибиторов активированных циклических киназ p27 и p21 и др. Антиапоптотическим действием обладают подоцитарные белки (в частности, нефрин), внутриклеточный ингибитор апоптоза Bcl-2, сохранные клеточно-клеточные контакты, VEGF. VEGF необходим для нормального фосфорилирования белка щелевой диафрагмы нефрина. Так, нарушение фосфорилирования нефрина при дефиците VEGF ослабляет связывание нефрина с подоцином, приводит к отщеплению экстрацеллюлярной части молекулы нефрина от мембраны подоцита и повышению его экскреции с мочой. Повреждение эндотелия и подоцитов со снижением экспрессии белков щелевой диафрагмы и возникновением ПУ при дефиците VEGF было впервые показано у женщин с преэклампсией [22]. В эксперименте было показано, что создание дефицита VEGF при анти-ГБМ-нефрите приводит к более тяжелому течению с нарушением функции белков щелевой диафрагмы, потере ножек подоцитов и ПУ [23]. Потере подоцитов способствует активация механизмов эпителиально-мезенхимальной трансдифференциации (ЭМТ). В эксперименте на животных моделях и в культуре эпителиальных клеток показано, что под воздействием главного индуктора ЭМТ - трансформирующего фактора роста β1 - подоциты утрачивают способность экспрессировать специфические подоцитарные белки (нефрин, подоцин, Р-кадгерин, ZO-1 и др.), меняют эпителиальный фенотип и начинают экспрессировать маркеры мезенхимальных клеток [24]. В результате этих процессов подоциты теряют нормальную структуру цитоскелета, клеточную полярность, межклеточные контакты, становятся подвижными, что приводит к их усиленному слущиванию с ГБМ и развитию подоцитурии. Возможны и механические причины отслоения подоцитов от ГБМ, такие как внутриклубочковая гипертензия, гиперфильтрация, которые приводят к растяжению капиллярных петель и увеличению скорости движения ультрафильтрата [25]. М. Hara и соавт. [26-28], используя антитела к подоцитарным белкам подокаликсину, подоцину, нефрину, синаптоподину, выявили подоциты и их фрагменты в моче больных с различными гломерулярными заболеваниями. Выраженность экскреции подоцитов с мочой нарастала параллельно степени ПУ и отражала активность ГН, в то время как у здоровых лиц и пациентов с ремиссией ХГН подоциты в моче определялись в небольшом количестве. Повреждение подоцитов и появление подоцитурии наблюдаются при многих гломерулопатиях (в том числе при фокальном сегментарном гломерулосклерозе, мембранозной нефропатии, мезангиокапиллярном ГН, волчаночном нефрите, IgA-нефропатии), коррелируя с активностью заболевания [29-31]. Полагают, что повреждение подоцитов при ряде форм ХГН, не являющихся истинными подоцитопатиями, может быть результатом воздействия активированной ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и реакцией на повышение внутригломерулярного давления. Обсуждается также роль механического воздействия на подоциты в условиях изменения архитектоники клубочка при первичном повреждении мезангиальных клеток. Так, при Thy-1-нефрите изменение формы капиллярных петель за счет повреждения мезангиальных клеток (мезангиолизиса) приводит к протрузии капиллярных петель в мочевое пространство. Подоциты в этом случае подвергаются shear stress (напряжению сдвига), вытягиваются, в них ослабляется связь с ГБМ, активируются процессы апоптоза, таким образом, они становятся более подверженными слущиванию. В повреждении подоцитов не исключена роль активации комплемента и мембраноатакующего комплекса С5в-9 [32]. В результате массивного повреждения подоцитов развивается ПУ, которая является клиническим эквивалентом активности ХГН. Однако исследованиями последних лет показано, что ПУ не всегда в полной мере отражает активность повреждения клубочка, в то время как подоцитурия является, вероятно, более точным маркером этого процесса. Так, в двух экспериментальных моделях гломерулярного повреждения, как первичного (PAN-нефроз), так и вторичного ГН (анти-Thy1.1-нефрит), на ранней стадии было установлено одновременное появление подоцитурии и ПУ. Однако в более поздней стадии экспериментального нефрита отмечалось исчезновение подоцитурии (активного повреждения), в то время как ПУ продолжала персистировать. Авторы полагают, что подоцитурия является более специфичным показателем активного гломерулярного повреждения, чем ПУ, и позволяет выявить различия между хроническим дефектом гломерулярного барьера и активным повреждением почечных клубочков. Следует отметить, что в модели анти-Thy1.1-нефрита первичное повреждение затрагивает мезангиальные клетки клубочка, однако вторично возникает повреждение подоцитов с развитием ПУ [33, 34]. Одной из стереотипных реакций подоцита на повреждение (воздействие гемодинамических или провоспалительных факторов) считается появление в моче разных структурно-функциональных белков подоцитов и белков щелевой диафрагмы (нефрина, подоцина и др.). Нефрин, с одной стороны, формирует связи с актиновыми волокнами цитоскелета подоцитарной клетки, а с другой - молекулы нефрина, взаимодействуя между собой, образуют межподоцитарную щелевую диафрагму. В эксперименте было убедительно показано, что повышение уровня нефрина в моче (нефринурия) при НС является следствием повреждения подоцитов и тесно связанной с ними щелевой диафрагмы [35], и впервые было продемонстрировано значение нефринурии как важного условия развития ПУ [36]. В исследовании Р. Luimula и соавт. [37] на модели PAN-нефроза у крыс показано повышение экскреции нефрина с мочой на пике ПУ. В экспериментальной модели мембранозной нефропатии (Хеймановский нефрит) внедрение в мембрану подоцитов компонентов комплемента (С5в-9) приводило к повреждению F-актина и отщеплению молекулы нефрина от подоцита с последующей экскрецией с мочой [38]. В клинических исследованиях у больных активными формами ХГН выявлена повышенная экскреция с мочой нефрина [4, 8, 39], а в ткани почки больных нефропатиями с ПУ, независимо от их морфологической формы, - уменьшение экспрессии нефрина [37, 40-42]. При электронной иммуномикроскопии ткани почки у пациентов еще до развития ПУ обнаруживались участки разрушения щелевой диафрагмы, соответствующие областям сниженной экспрессии нефрина. При далеко зашедшем процессе в случае развития высокой ПУ количество этих участков значительно увеличивается, причем они характеризуются неравномерным распределением и чередуются с абсолютно сохранными областями щелевой диафрагмы [43]. В наших более ранних работах показано, что у больных ХГН, клинически протекающим преимущественно с ПУ и нефротическим синдромом, независимо от морфологического варианта нефрита, выявляется повреждение подоцитов, сопровождающееся подоцитурией и экскрецией с мочой структурного белка щелевой диафрагмы - нефрина. Выраженность этих изменений зависела от уровня ПУ, выраженности НС, наличия дисфункции почек [44]. У больных с массивной ПУ и НС отмечалось уменьшение количества подоцитов в клубочках почек - подоцитопения, коррелирующая с величиной подоцитурии и выраженностью почечной дисфункции [45]. В исследовании Я.Г. Пролетова и соавт. [46] снижение уровня ПУ и нефринурии в динамике наблюдалось после успешного лечения больных циклоспорином. Влияние подоцитарной дисфункции на характер течения ХГН наглядно прослеживалось при анализе эффекта иммуносупрессивной терапии: у больных с высоким исходным уровнем нефринурии и подоцитурии ответ на терапию был значительно хуже [46]. Участие подоцитов в механизмах формирования нефросклероза Накоплены экспериментальные и клинические данные, свидетельствующие о том, что число подоцитов в клубочке является важной детерминантой развития гломерулосклероза; показано, что прогрессирующие формы ХГН сопровождаются подоцитопенией [47]. В условиях нормального развития ткани почки закладывается большое количество нефронов, которое превышает достаточное для функционирования почки количество. Это способствует адаптации почки к повышающимся потребностям в условиях растущего организма и у взрослого человека [48, 49]. После 60 лет количество нефронов сокращается на 50%, и в этом случае исходная олигонефрония является одной из ведущих причин формирования почечной недостаточности при заболеваниях почек. Но даже в условиях нормального количества нефронов при рождении важное значение в развитии почечной недостаточности имеет потеря подоцитов при первичных и вторичных гломерулопатиях. Общее количество подоцитов в клубочке определяется балансом процессов их пролиферации и потери. Зрелые подоциты - высокодифференцированные клетки, практически не делящиеся, с малым пролиферативным потенциалом. В настоящее время благодаря достижениям экспериментальной нефрологии и современным клеточным технологиям убедительно показано, что потеря подоцитов может быть отчасти возмещена благодаря стволовым клеткам - предшественникам подоцитов, которые локализуются на мочевом полюсе клубочка в области соединения гломерулярного и канальцевого эпителия и вдоль боуменовой капсулы [50]. Клетки-предшественники могут мигрировать на оголенные участки ГБМ, что было показано в некоторых экспериментальных моделях ХГН. Также было установлено, что париетальные эпителиальные клетки капсулы Боумена экспрессируют маркеры стволовой клетки CD24 и CD133. По мере приближения к сосудистому полюсу клубочка они постепенно теряют эти маркеры, приобретают подоцитарные маркеры и дифференцируются в зрелые подоциты. Предположительно, другим источником обновления подоцитов в клубочке могут являться стволовые клетки костного мозга [51]. Однако работ, подтверждающих это предположение в клинических условиях у человека, нет. Отсутствуют также данные и о том, что в клубочке человека существуют условия для запрограммированной миграции клеток-предшественников в «оголенные» области ГБМ в норме или при потере подоцитов. Наконец, постоянное движение ультрафильтрата в боуменовом пространстве также препятствует прикреплению и делению этих клеток. Таким образом, подоциты как высокодифференцированные клетки не способны к пролиферации и замещению, поэтому прогрессирующая потеря этих клеток в клубочке почки влечет за собой оголение ГБМ и запускает процессы гломерулосклероза [1, 52]. Важным механизмом потери подоцитов является активация процесса апоптоза, способствующего отслоению подоцитов от ГБМ и экскреции в мочевое пространство [53, 54]. Обсуждаются также процессы маладаптивной гипертрофии подоцитов и ЭМТ, которые уменьшают адгезивные свойства клетки и способствуют слущиванию подоцитов [55-57]. Так, в культуре клеток показано, что реакцией подоцита на механическое растяжение является гипертрофия, в частности, за счет активации ингибиторов клеточного цикла [58]. В этом случае достаточно часто наблюдается деление ядра, в то время как полного деления клетки не происходит, доказательством чему служит появление двуядерных и многоядерных подоцитов [59]. Параллельно гипертрофии подоцитов наблюдается снижение адгезивных свойств клеток, отделение их от ГБМ и слущивание в мочу [60]. Потере подоцитов способствует активация механизмов эпителиально-мезенхимальной трансдифференциации. В процессе ЭМТ происходят дедифференциация подоцитов и приобретение ими маркеров мезенхимальных клеток, в том числе экспрессия матриксных металлопротеиназ (ММП) [61]. ММП-2 и ММП-9 локализуются в зонах ЭМТ, индуцируя появление миофибробластов [62, 63]. Повышение экспрессии ММП стимулирует разрушение ГБМ, а также миграцию клеток, подвергшихся трансформации в миофибробласты [64]. Подобно фибробластам, трансдифференцированные подоциты приобретают способность продуцировать матриксные белки (фибронектин, коллаген и др.), ускоряя таким образом формирование гломерулосклероза. Уменьшение числа подоцитов приводит к «оголению» отдельных участков ГБМ, потере формы капиллярных петель с образованием локальных выпячиваний базальной мембраны. При контакте этих «выбуханий» с париетальными клетками клубочка формируются синехии между капиллярными петлями и боуменовой капсулой клубочка, что является пусковым механизмом для начала склерозирования клубочков [65]. Показано, что потери подоцитов в клубочке до 20% сопровождаются мезангиальной экспансией, 20-40% - образованием синехий с капсулой, при потере 40-60% подоцитов развивается гломерулосклероз, выраженное истощение подоцитов >60% приводит к глобальному гломерулосклерозу. Критическое снижение количества подоцитов в клубочках является основным фактором прогрессирования гломерулосклероза и снижения скорости клубочковой фильтрации [47]. Перспективы неинвазивной оценки подоцитарного повреждения Учитывая важную роль повреждения подоцитов в развитии ПУ и прогрессировании гломерулосклероза, в последние годы значительно возрос интерес к «мочевым» биомаркерам, количественное определение которых позволяет неинвазивно мониторировать выраженность структурно-функциональных нарушений подоцитов. Для определения выраженности повреждения гломерулярного фильтра у больных с различными формами ГН в настоящее время применяются разные методы - создание культуры клеток для определения в моче «жизнеспособных» подоцитов и подоцитов в состоянии апоптоза, оценка иммуноферментным методом уровня структурных белков подоцитов и щелевой диафрагмы (нефрина, подоцина, синаптоподина, подокаликсина и др.), цитофлуометрия в мочевом осадке меченных антителами к подокаликсину подоцитов, а также иммуноблоттинг мочи для выявления мРНК этих белков [61, 66]. В последние годы получены данные о том, что большинство применяемых в лечении ГН иммуносупрессивных препаратов помимо системного действия оказывают влияние непосредственно на подоцит, именно этот механизм является определяющим в уменьшении ПУ и купировании НС [67, 68]. Таким образом, перспективным направлением является разработка препаратов таргетного действия, направленного на восстановление структуры и функции подоцита. Заключение Таким образом, структурно-функциональные нарушения подоцитов (подоцитопатия), ранее считавшиеся специфическим признаком болезни минимальных изменений, мембранозной нефропатии и фокального сегментарного гломерулосклероза, встречаются при различных вариантах ХГН, протекающих с ПУ и НС. Несмотря на то что протеинурические формы гломерулярного поражения почек различаются по этиологии, патогенезу и клиническому течению, их объединяет наличие общего фенотипа повреждения подоцитов: изменение структуры и апикальное перемещение межподоцитарной щелевой диафрагмы, реорганизация актинового цитоскелета подоцитов с развитием эффекта сглаживания ножковых отростков, отслойка подоцитов от ГБМ с появлением их в моче (подоцитурия) и последующим уменьшением их количества в клубочке (подоцитопения). Изменения подоцитов, ассоциированные с иммунными и гемодинамическими нарушениями при ХГН, могут предшествовать развитию большой ПУ, а их нарастание тесно связано с морфологическими и клиническими проявлениями прогрессирования ХГН. В настоящее время появились доступные методы неинвазивной оценки подоцитарного повреждения с помощью мочевых тестов. Определение подоцитурии и уровня экскреции с мочой подоцитарных белков (нефрина, подоцина и др.) представляются перспективным для определения тяжести гломерулярного повреждения, оценки риска развития гломерулосклероза и прогнозирования эффективности терапии ХГН. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

N V Chebotareva

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Ministry of Health of Russi

Email: natasha_tcheb@mail.ru
Moscow, Russia

I N Bobkova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Ministry of Health of Russi

Moscow, Russia

L V Lysenko

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Ministry of Health of Russi

Moscow, Russia

References

Supplementary files