Multipotent mesenchymal stromal cells application for acute graft versus host disease treatment

L. A. Kuzmina; Кузьмина Лариса Анатольевна; N. A. Petinati; Петинати Наталия Арнольдовна; V. A. Vasilieva; Васильева Вера Алексеевна; M. V. Dovydenko; Довыденко Мария Вячеславовна; M. Yu. Drokov; Дроков Михаил Юрьевич; Yu. O. Davydova; Давыдова Юлия Олеговна; N. M. Kapranov; Капранов Николай Михайлович; N. V. Sats; Сац Наталья Владимировна; Yu. A. Chabaeva; Чабаева Юлия Александровна; S. M. Kulikov; Куликов Сергей Михайлович; T. V. Gaponova; Гапонова Татьяна Владимировна; N. I. Drize; Дризе Нина Иосифовна; E. N. Parovichnikova; Паровичникова Елена Николаевна; V. G. Savchenko; Савченко Валерий Григорьевич

doi:10.26442/00403660.2020.07.000757

Multipotent mesenchymal stromal cells application for acute graft versus host disease treatment

Authors: Kuzmina L.A.¹, Petinati N.A.¹, Vasilieva V.A.¹, Dovydenko M.V.¹, Drokov M.Y.¹, Davydova Y.O.¹, Kapranov N.M.¹, Sats N.V.¹, Chabaeva Y.A.¹, Kulikov S.M.¹, Gaponova T.V.¹, Drize N.I.¹, Parovichnikova E.N.¹, Savchenko V.G.¹
Affiliations:
1. National Research Center for Hematology
Issue: Vol 92, No 7 (2020)
Pages: 23-30
Section: Original articles
URL: https://ter-arkhiv.ru/0040-3660/article/view/43120
DOI: https://doi.org/10.26442/00403660.2020.07.000757
ID: 43120

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Aim. Analysis of the effectiveness of the MSCs aministration as the second- or third-line therapy of acute GVHD (aGVHD) resistant to glucocorticosteroid treatment.

Materials and methods. The study included 35 patients who received MSCs obtained from the bone marrow of healthy donors as a treatment of steroid-resistant aGVHD. The clinical parameters of patients, MSCs’ cultural characteristics, the MSC expression profile for various genes including those involved in immunomodulation, expression of cells’ surface markers, the source of MSCs, as well as the frequency and number of MSC administrations were analyzed.

Results. Response to therapy was achieved in 74% of cases, a complete response was reached in 13 (37%) patients, partial response/clinical improvement was demonstrated in 13 (37%). This treatment was ineffective in 9 patients. The prediction of a group of patients with good response to MSC therapy turned to be impossible. The differences between the effective and ineffective for the GVHD treatment MSCs samples were found. The effective ones were characterized with a decreased total MSCs production and an increase in the main histocompatibility complex and PDL-1 antigens expression.

Conclusion. These data allow to select optimal samples for aGVHD treatment that can improve clinical results. aGVHD treatment with MSCs has shown efficacy comparable to other treatment approaches. Given the low percentage of complications and the absence of significant adverse effects, MSC therapy seems to be one of the optimal approaches to the treatment of resistant forms of GVHD.

Keywords

allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, graft versus host disease, multipotent mesenchymal stromal cells

Full Text

Алло-ТГСК – трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток

ИЛ – интерлейкин

кДНК – кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота

КМ – костный мозг

КОЕф – колониеобразующие единицы фибробластов

КУ – клиническое улучшение

мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота

МСК – мезенхимные стромальные клетки

ОВ – общая выживаемость

оРТПХ – острая реакция «трансплантат против хозяина»

ПО – полный ответ

ПЦР – полимеразная цепная реакция

РТПХ – реакция «трансплантат против хозяина»

хрРТПХ – хроническая реакция «трансплантат против хозяина»

ЧО – частичный ответ

IDO (indoleamine-2,3-dioxygenase) – индолеамин-2,3-диоксеназа

Введение

Несмотря на появление большого числа новых эффективных препаратов для лечения гемобластозов, трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) остается единственным методом излечения для многих пациентов с онкогематологическими и другими заболеваниями. Однако алло-ТГСК связана с развитием тяжелых осложнений, одно из ведущих мест среди которых занимают острая (оРТПХ) и хроническая реакция «трансплантат против хозяина» (хрРТПХ) [1]. При развитии этого осложнения увеличивается летальность после трансплантации и может существенно снижаться качество жизни.

Реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ) – это системное заболевание, при котором лимфоциты донора распознают антигены реципиента как чужеродные. Это приводит к иммунному ответу с участием донорских активированных Т-клеток, которые атакуют клетки хозяина и могут вызвать тяжелые полиорганные повреждения [2]. В патогенезе хрРТПХ наряду с Т-клетками существенную роль играют также В-клетки [3]. Для фармакологической профилактики РТПХ у большинства пациентов в настоящее время используют ингибиторы кальциневрина (циклоспорин А, такролимус), метотрексат [2], микофенолата мофетил [4, 5]. Несмотря на комбинированную профилактику, в 30–50% случаев после алло-ТГСК развивается оРТПХ [6] и в 30–70% – хрРТПХ. В качестве 1-й линии терапии оРТПХ используют высокие дозы метилпреднизолона [7, 8], в большинстве случаев с ингибиторами кальциневрина. Примерно у 1/2 пациентов отмечается положительный ответ на лечение глюкокортикостероидами [7]. В ряде случаев развивается рефрактерность к метилпреднизолону, которая определяется либо как отсутствие какого-то ответа или прогрессирование симптомов после 3–7 дней системной терапии, а также отсутствие полного ответа (ПО) через 14 дней лечения. При констатации резистентности к иммуносупрессивной терапии долгосрочный прогноз у пациентов крайне неблагоприятный, общая выживаемость (ОВ) в течение 1 года составляет менее 30%. Летальность обусловлена проявлениями РТПХ, а также последствиями агрессивной иммуносупрессивной терапии, такими как реактивация вирусных, возникновение жизнеугрожающих бактериальных и грибковых инфекций, развитием рецидива основного заболевания [9, 10]. Стандартного подхода к терапии 2-й линии не существует, так как не доказано преимущество какого-либо метода терапии перед другими. Используют: микофенолат мофетила, сиролимус, такролимус, экстрокорпоральный фотоферез, ингибиторы JAK, ингибиторы протеасом, моноклональные антитела, антитимоцитарный глобулин и мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК) [11, 12].

В 2004 г. K. Le Blanc и соавт. [13] описали полный регресс проявлений тяжелой рефрактерной РТПХ кишечника и печени 4-й степени у 9-летнего мальчика после внутривенного введения МСК. С этого момента проведено немало исследований по изучению терапевтического подхода лечения РТПХ на основе МСК [14, 15].

Мультипотентные МСК – это прилипающие к пластику фибробластоподобные клетки, способные дифференцироваться в остеогенном, хондрогенном, миогенном и адипогенном направлениях [16, 17]. МСК не экспрессируют маркеры гемопоэтических клеток, но экспрессируют CD90, CD73, CD105 [18, 19]. В качестве источников мультипотентных МСК могут использоваться КМ, жировая ткань, плацента, пуповинная кровь, пульпа зуба [20]. В дополнение к их способности к дифференцировке в различные клеточные линии МСК обладают иммуносупрессивными свойствами [18, 19], секретируя большое число растворимых факторов, таких как индолеамин-2,3-диоксеназа (IDO), простагландин-2, интерлейкин (ИЛ)-10, трансформирующий фактор роста β, оксид азота, HLA-G5, белок-индуцибельный фактор-индуцируемый опухолевым геном 6 (TSG-6), МСК способны ингибировать активацию комплемента, подавлять пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток, менять соотношение между различными субпопуляциями Т-клеток, индуцировать пролиферацию регуляторных Т-клеток. Вследствие этого МСК используют для лечения различных заболеваний: болезнь Крона, болезнь Альцгеймера, инфаркт миокарда, сахарный диабет 1-го типа [11, 21–23].

Мультипотентные МСК применяют в том числе для лечения пациентов с оРТПХ и хрРТПХ, резистентной к терапии глюкокортикостероидами. Продемонстрировано, что МСК улучшают ОВ пациентов, у которых достигнут ПО или частичный ответ (ЧО) [24, 25]. Несмотря на эти обнадеживающие результаты, по-прежнему существует необходимость в определении факторов, которые могут влиять на эффективность лечения при использовании МСК.

В этой работе мы представляем ретроспективный анализ лечения пациентов с оРТПХ, которая резистентна к терапии глюкокортикостероидами, с помощью МСК, выделенных из КМ доноров гемопоэтических клеток.

Материалы и методы

В исследование включены 35 пациентов (16 мужчин, 19 женщин), которым выполнена алло-ТГСК. У большинства лиц алло-ТГСК произведена в качестве этапа программной терапии острого миелоидного лейкоза (18 пациентов) или острого лимфобластного лейкоза (8 больных). В других случаях показание к алло-ТГСК – миелодиспластический синдром – у 5 пациентов, хронический миелолейкоз – у 3, грибовидный микоз – у 1. Медиана возраста больных при проведении алло-ТГСК составила 38 лет (19–60 лет). В 17 случаях алло-ТГСК выполнена от родственного полностью совместимого донора, в 13 – от неродственного полностью совместимого донора и в 5 – от неродственного частично совместимого донора. В качестве источника трансплантата у 24 больных использован КМ, у 11 пациентов – периферические стволовые клетки. Срок возникновения оРТПХ составил 8–162 дня после алло-ТГСК, медиана – 64 дня. У 3 пациентов РТПХ развилась после трансфузии лимфоцитов донора, у 5 – во время отмены иммуносупрессивной терапии. Изолированное поражение кожи выявлено у 3 человек, печени – у 1, кишечника – у 13, кожи и печени – у 2, кожи и кишечника – у 10, печени и кишечника – у 2, у 4 больных отмечено вовлечение 3 органов-мишеней (кожи, печени и кишечника). У большинства пациентов (62,8%) выявлена 3–4-я степень оРТПХ: у 16 – 3-я, у 6 – 4-я. У 13 пациентов диагностирована оРТПХ 2-й степени. Степень оРТПХ определена в соответствии с критериями H. Glucksberg и соавт., 1974 [26].

В качестве 1-й линии терапии назначен метилпреднизолон в дозе не менее 1 мг/кг в сутки (в 2 случаях проводилась терапия ингибиторами кальциневрина в связи с развившимися осложнениями и высоким риском назначения глюкокортикостероидов). оРТПХ считали резистентной к терапии, если не достигнут ПО через 14 дней или при признаках прогрессирования оРТПХ во время лечения, а также при отсутствии какого-либо ответа через 5–7 дней лечения.

Исследование одобрено локальным этическим комитетом. Информированное согласие на применение МСК получено от всех пациентов. С целью терапии оРТПХ, резистентной к лечению, всем пациентам введены МСК, полученные из КМ здоровых доноров – как собственных доноров гемопоэтических стволовых клеток, так и других (сторонних) доноров.

С целью терапии оРТПХ МСК вводили в дозировке 1¥10⁶/кг массы тела больного. У 8 лиц выполнено 1 введение МСК, у 17 – 2, у 8 – 3, у 1 – 4 и у 1 – 5 введений. Интервал между введениями составил 1 нед. В качестве терапии введены МСК, полученные из КМ собственного донора (донора гемопоэтических клеток), 21 пациенту, 14 – МСК из КМ стороннего донора. Медиана срока введения МСК от диагностики РТПХ составила 15,5 дня (7–62). У 27 пациентов МСК использованы в качестве терапии резистентной формы РТПХ как 2-я линия терапии, у 7 – 3-я, у 1 – 4-я (табл. 1).

*Таблица 1.* Характеристика пациентов в зависимости от ответа на лечение
		ПО (n=13)	ЧО/КУ (n=13)	Нет ответа (n=9)
Мужчины/женщины		3/10	6/7	7/2
Возраст, лет		Медиана 42 (19–60)	Медиана 37 (19–55)	Медиана 37 (19–55)
Диагнозы	Острый миелоидный лейкоз	11	5	2
	Острый лимфобластный лейкоз	2	4	2
	Миелодиспластический синдром		2	3
	Хронический миелолейкоз		2	1
	Грибовидный микоз			1
Донор гемопоэтических стволовых клеток	Родственный совместимый по антигенам гистосовместимости донор	7	6	4
	Неродственный совместимый по антигенам гистосовместимости донор	4	6	3
	Неродственный частично совместимый по антигенам гистосовместимости донор	2	1	2
Источник трансплантата	КМ	9	8	7
Источник трансплантата	Стволовые клетки периферической крови	4	5	2
Срок возникновения оРТПХ, дни		Медиана 62 (8–162)	Медиана 87 (15–150)	Медиана 58 (37–90)
Поздние формы оРТПХ (n=8)	Трансфузия лимфоцитов донора	3
Поздние формы оРТПХ (n=8)	Отмена иммуносупрессии		4	1
Поражение органов
Кожа (n=3)		1	2
Печень (n=1)				1
Кишечник (n=13)		5	4	4
Кожа и печень (n=2)		2
Кожа и кишечник (n=10)		3	5	2
Печень и кишечник (n=2)			1	1
Кожа, печень и кишечник (n=4)		2	1	1
Степень поражения	2-я (n=13)	5	5	3
	3-я (n=16)	6	7	3
	4-я (n=6)	2	1	3
Линия терапии	2-я	10	10	7
	3-я	2	3	2
	4-я	1
МСК	Донор собственный	7	8	6
МСК	Сторонний донор	6	5	3
Срок 1 введения МСК от диагностики оРТПХ, дни		Медиана 16 (7–62)	Медиана 15 (8–61)	Медиана 12 (7–31)
Количество введений МСК	1	5	3	1
	2	8	6	5
	3	6	4	1
	4	1		1
	5	1		1
Использование следующих линий иммуносупрессивной терапии, n (%)		4 (31)	4 (31)	9 (100)

Ответ на лечение МСК оценивали через 28 дней после их введения. Ответ на введение МСК определен как ПО в случае полного исчезновения всех признаков оРТПХ или ЧО – при уменьшении симптомов поражения в органах-мишенях более чем на 50%, клиническое улучшение (КУ) – менее чем на 50%. Стабильное или прогрессирующее течение РТПХ классифицировано как отсутствие ответа.

МСК выделяли из КМ, полученного во время эксфузии у доноров после подписания ими информированного согласия. Для получения ядросодержащих клеток КМ смешивали с одинаковым объемом среды αМЕМ (ICN), который содержал 0,2% метилцеллюлозы (1500 cP, Sigma-Aldrich). Большинство эритроцитов и гранулоцитов оседало через 40 мин, в то время как мононуклеарные клетки оставались в суспензии. Далее клеточный осадок ресуспендировали в стандартной среде для культивирования, которая состояла из среды αMEM с 4% плазмы, обогащенной тромбоцитами, 100 ЕД/мл пенициллина («Ферейн», Россия), 2 мМ L-глутамина (ICN) и 50 мкг/мл стрептомицина («Ферейн», Россия). Клетки культивировали по 27–30¥10⁶ клеток на флакон T175 см² (Corning-Costar). После формирования конфлюэнтного монослоя клетки отмывались 0,02% ЭДТА (ICN) в физиологическом растворе (Sigma-Aldrich), а затем обрабатывались трипсином (ICN). Клетки рассаживали по 4¥10³ клеток на 1 см² площади флакона. Культуры держали в условиях гипоксии при 37ºC в атмосфере с 5% CO₂ и 5% O₂. Для лабораторных исследований МСК культивировали с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (Hyclone, США).

Для анализа колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕф) ядросодержащие клетки полученных образцов КМ культивировали по 10⁶ и 5¥10⁵ на флакон с площадью дна 25 см² в среде альфа-MEM с 20% эмбриональной телячьей сывороткой, 2 мМ L-глутамина (ICN, США), 100 ед/мл пенициллина («Ферейн», Россия), 50 мкг/мл стрептомицина («Ферейн», Россия) в течение 14 дней. Подсчет колоний производили под бинокулярной лупой (Opton, Германия) после окрашивания в 1% кристаллвиолете на 20% метаноле.

Определение антигенов комплекса гистосовместимости на МСК выполняли методом проточной цитометрии. После снятия МСК со дна флакона их дважды отмывали раствором CellWash (BD Biosciences, США) и после этого 2¥10⁴ клеток инкубировали 20 мин в темноте с моноклональными антителами. Анализ проводили с использованием проточного цитометра FACSCanto II (BD Biosciences, США), данные анализировали с помощью программы FACSDiva (BD Biosciences, США). Популяцию МСК определяли сначала по параметрам прямого и бокового светорассеяния, далее выделяли клетки, экспрессирующие CD90. В этой популяции клеток оценивали средний уровень флуоресценции (MFI) по каналам PE (CD90, CD146, CD73), APC (HLA-DR, CD178, CD54, CD86), FITC (HLA-ABC, CD80, CD105, CD274).

Определение уровня экспрессии генов в МСК осуществляли на первом пассаже методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР) в режиме реального времени (модификация Taq-Man) на приборе Abiprism 7500 (Applied Biosystems). РНК выделяли, используя стандартный протокол с небольшими модификациями. Обратную транскриптазу (M-MLV, Promega) применяли для построения первых цепей ДНК после гибридизации мРНК со смесью поли-Т-праймеров и случайных гексамеров. Нуклеотидные последовательности специфичных к соответствующим генам праймеров и зондов приведены ранее в статье [27]. Для анализа полученных данных использовали метод ΔΔCt [28]. После проведения ПЦР вычисляли средние значения порогового цикла Ct из 3 проб для каждого из образцов. Вычисляли разницу средних значений порогового цикла для исследуемого гена между опытным и контрольным образцом (в качестве контрольного образца взята смесь кДНК из проб от 8 доноров). Ненормированную разницу экспрессии гена вычисляли по формуле:

D=2-ΔCt (1),

где D – ненормированная разница в экспрессии исследуемого гена, а ΔСt – разница средних значений порогового цикла опытного и контрольного образцов. Для нормирования количества кДНК в исходных пробах использовали гены домашнего хозяйства, кодирующие GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) и BACT (β-актин). Для каждого из этих генов проводили ПЦР в режиме реального времени с соответствующими праймерами и зондом. Вычисляли показатель D по каждому из этих генов по формуле (1). Показатель D в случае гена домашнего хозяйства отражает разницу в количестве исходного материала (тотальной РНК) в разных пробах. Суммарный фактор нормализации вычисляли как среднее геометрическое из факторов нормализации по отдельным генам домашнего хозяйства. Нормированную разницу экспрессии интересующих нас генов вычисляли по формуле (2):

$D n = \frac{D}{N F}$ (2),

где Dn – нормированная разница экспрессии гена, D – ненормированная разница экспрессии гена, NF – суммарный фактор нормализации по 2 генам домашнего хозяйства.

ОВ всех больных, включенных в исследование, рассчитывали от 1-го дня введения МСК; за событие принимали смерть от любых причин. Для сравнения показателей ОВ больных, у кого отмечался или не отмечался положительный ответ на лечение, за точку отсчета приняли максимальное время до достижения эффекта от введения МСК (+24-й день), поскольку это позволяет избежать отрицательной селекции в группе лиц, у которых МСК оказались неэффективны (смерти до возможного достижения ответа).

Статистический анализ выполнен с помощью программы GraphPad Prism version 8.1 (GraphPad Software Inc.). Применяли непарный Т-критерий Стьюдента и событийный анализ Каплана–Майера. Достоверными считали различия при р<0,05.

Результаты

Ответ на лечение с использованием МСК достигнут у 26 (74%) больных, при этом ПО отмечался у 13 (37%) пациентов, ЧО/КУ – также у 13. У 9 пациентов не наблюдалось положительного эффекта после начала лечения МСК.

Отмечено, что в группе больных, у которых достигнут положительный ответ на лечение, медиана времени от начала терапии с использованием МСК до улучшения состояния пациента составила – 7 дней (2–24). У 17 пациентов после терапии МСК использованы следующие линии иммуносупрессивной терапии, которая назначалась при отсутствии ответа, прогрессии или рецидива РТПХ.

Не выявлено тяжелых осложнений при терапии МСК, и только у одного пациента отмечался небольшой озноб при повторном введении.

При анализе результатов лечения не выявлено различий в возрасте пациентов, степени оРТПХ, сроков ее возникновения, вовлечения органов-мишеней, совместимости с донором гемопоэтических клеток и источником трансплантата (КМ или стволовые клетки периферической крови), интервала от времени диагностики РТПХ до начала лечения с использованием МСК среди пациентов, у которых достигнут ПО или ЧО/КУ или нет ответа на лечение. Не выявлено зависимости частоты ответов на терапию от возраста донора МСК и количества введений, а также в качестве какой линии терапии использовали МСК, хотя у большинства пациентов во всех группах МСК применяли в качестве 2-й линии терапии. При этом выявлено, что среди ответивших на терапию МСК достоверно больше женщин, чем мужчин (по критерию ÷² р=0,012).

В нашем исследовании вероятность ОВ пациентов после начала терапии МСК составила к 6 мес – 63%, к 24 мес – 48%, к 60 мес – 29% (рис. 1).

Рис. 1. ОВ пациентов с резистентной к терапии оРТПХ, с использованием МСК.

Для оценки скорости достижения ответа и медианы времени его достижения проанализирована вероятность достижения ответа. На рис. 2 видно, что среди пациентов, у которых достигнут ответ на терапию, максимальный срок достижения ответа составил 24 дня после введения МСК, а медиана времени до достижения ответа – 7 дней. При этом вероятность получения положительного эффекта после начала терапии МСК составила 75%.

Рис. 2. Время до достижения ответа на терапию с использованием МСК.

Для того, чтобы сравнить показатели ОВ у больных, у которых достигнут или не достигнут ответ на лечение МСК, за точку 0 принят 24-й день после введения МСК (максимальный срок достижения ПО/ЧО/КУ).

ОВ закономерно выше в группе пациентов с ПО и ЧО/КУ, чем у пациентов, у которых нет ответа на терапию (рис. 3). Также видно, что у большинства пациентов, у которых терапия МСК неэффективна, ОВ крайне низка, так как не наблюдалось ответа и на последующие линии терапии.

Рис. 3. Вероятность ОВ в зависимости от ответа.

У 6 пациентов в группе ПО или ЧО на лечение в дальнейшем развились рецидивы заболевания, а также тяжелые инфекционные осложнения, в то время как рецидивы РТПХ, приведшие к летальному исходу, отмечались реже. У большинства пациентов, у которых не получено ПО или ЧО при лечении МСК (8 из 9), не зафиксировано ответа на все последующие линии терапии. Они погибли в результате прогрессии РТПХ и инфекционных осложнений (табл. 2).

*Таблица 2.* Результаты терапии с использованием МСК в зависимости от ответа на лечение
		ПО (n=13)	ЧО/КУ (n=13)	Нет ответа (n=9)
Живы на момент анализа		6/13 (46%)	6/13 (46%)	1/9 (11%)
Причины смерти	Рецидив	4	2	–
	РТПХ	1	2	6
	Инфекционные осложнения	2	3	2

Одной из целей нашего исследования стала попытка выявить характеристики МСК, влияющие на их эффективность. Анализ приведен в табл. 3.

*Таблица 3.* Характеристика МСК в зависимости от клинического ответа
	ПО (n=13)	ЧО/КУ (n=13)	Нет ответа (n=9)
Возраст донора, лет	Медиана 40 (16–62)	Медиана 34 (13–61)	Медиана 38 (27–55)
КОЕф	18,8±6,5	37,7±14,3	6,1±1,4
Суммарная клеточная продукция МСК	7,5±1,5	11,4±2,5	14,5±6,5
Время до Р0	13,5±0,8	12,7±0,4	14,4±0,9

С целью терапии РТПХ пациентам вводили как МСК, полученные из КМ собственного донора гемопоэтических клеток, так и МСК, полученные из КМ стороннего донора. Анализ не продемонстрировал влияния источника МСК на эффективность терапии. Не выявлено достоверных отличий в возрасте донора, из КМ которого получены МСК, концентрации МСК в КМ (на которую указывает время до Р0) и суммарной клеточной продукции МСК. Однако видна тенденция к повышению суммарной клеточной продукции МСК со снижением клинической эффективности. Суммарная клеточная продукция МСК за 4 пассажа несколько выше, хотя и недостоверно, в тех МСК, введение которых оказалось неэффективным (7,6±1,5¥10⁶ против 14,6±6,5¥10⁶; p=0,37). Выявлено достоверное увеличение концентрации КОЕф в КМ доноров, МСК которых эффективны (27,1±7,5/10⁶ ядросодержащих клеток КМ против 6,1±1,4; р=0,01).

При анализе относительного уровня экспрессии генов иммуномодулирующих факторов достоверных различий не выявлено при анализе 3 групп (ПО, ЧО/КУ и отсутствие ответа), однако также видна тенденция повышения экспрессии генов, отвечающих за иммуномодулирующие свойства МСК (IL6, IDO1, IL1BR1, ICAM1) в группе неэффективных, кроме того, повышен относительный уровень экспрессии генов основным фактором роста фибробластов (FGF2) и рецептора ИЛ-1β (IL1BR1); табл. 4. При объединении групп ПО и ЧО/КУ достоверно отличается относительный уровень экспрессии VEGF.

*Таблица 4.* Медиана относительного уровня экспрессии генов, важных для иммуномодуляции, в МСК в зависимости от их клинического эффекта
Ген	МСК		Значение р
Ген	Эффективные	Неэффективные	Значение р
IL6	2,4	5,5	0,07
IDO1	0,004	8,7	0,2
PDGFRa	0,8	2	0,32
IL1BR1	1,4	2,2	0,38
FGF2	3,4	9,1	0,18
LIF	1	2,7	0,24
ICAM1	0,2	0,6	0,4
VEGF	1,6	0,2	0,005

Анализ среднего уровня флуоресценции поверхностных маркеров на МСК из 2 групп показал достоверные отличия между эффективными и неэффективными для терапии оРТПХ образцами МСК (табл. 5). В эффективных образцах МСК экспрессия молекул главного комплекса гистосовместимости, CD90 и PDL-1 повышена по сравнению с неэффективными.

Таблица 5. Средний уровень флуоресценции поверхностных маркеров МСК в зависимости от их клинического эффекта
Маркер	Средний уровень флуоресценции МСК
Маркер	Эффективные	Неэффективные	Значение р
HLA-ABC	14549±1164	10115±1226	0,03
HLA-DR	420±74	259±122	0,31
CD90	79473±5946	54338±7646	0,03
CD274 (PDL-1)	92±34	0–2	0,02

Обсуждение

В метаанализ результатов терапии резистентной к глюкокортикостероидам РТПХ с использованием МСК включены данные более 25 крупных исследований [22, 29]. Большинство из них использует МСК стороннего донора, при этом клиники получают клетки из других учреждений, что не позволяет изучать свойства отдельных образцов МСК и сопоставлять их с клиническими результатами. В нашем исследовании получена уникальная возможность проанализировать все образцы МСК, использованные для лечения оРТПХ, резистентной к глюкокортикостероидам, и сопоставить характеристики МСК с эффективностью терапии.

Данные об эффективности МСК в терапии резистентных форм РТПХ очень разнятся, ПО наблюдается у 6,5–54,5%, ЧО – у 17–50,7% пациентов [11, 22]. Показано, что МСК более эффективны у пациентов детского возраста [13, 30, 31]. В нашем исследовании зависимости эффективности терапии от возраста доноров и пациентов не выявлено. Возможно, это связано с тем, что вся когорта лиц, включенных в исследование, взрослая.

Отсутствие крупных исследований не позволяет выявить факторы, влияющие на эффективность МСК, как со стороны самих клеток (протоколы получения и введения, характеристики клеток), так и со стороны пациентов (у кого может быть достигнут ответ на лечение, сроки, дозы и т.п.) [32]. В анализе, включившем 15 работ по лечению резистентной к глюкокортикостероидам РТПХ у 558 пациентов (269 взрослых и 289 детей), по данным разных исследователей, продемонстрировано, что вероятность ОВ в течение 6 мес составила от 37 до 71%, 24 мес – от 17,4 до 40%, что превышает результаты некоторых других подходов к терапии. В нашем исследовании получены практически аналогичные результаты: ОВ в течение 6 мес составила 63%, в течение 2 лет – 48%.

Известно, что эффективность лечения при резистентных формах РТПХ может определяться вовлечением органов-мишеней. Так, при поражении печени и кишечника реже отмечаются ПО на лечение. Эффективность терапии РТПХ с помощью МСК также зависит от пораженных органов [23, 33, 34]. Лучший ответ, по данным других исследователей, достигается при лечении РТПХ с поражением кожи, при более низкой степени РТПХ и при большем количестве введений [35]. В нашем исследовании локализация и степень поражения не оказывали значительного влияния на эффективность ответа на терапию, нередко отмечался положительный эффект на лечение у пациентов с прогностически неблагоприятными формами РТПХ с поражением кишечника, при сочетанном вовлечении органов.

Некоторые исследователи предполагают, что более раннее после диагностики резистентности к глюкокортикостероидам введение МСК эффективнее [36]. Мы не отметили такого влияния времени начала терапии МСК на эффективность лечения.

Большинство опубликованных работ описывает введения МСК от стороннего донора. В нашем исследовании имелась возможность проанализировать также введение МСК от собственного донора гемопоэтических клеток. Не выявлено зависимости эффективности терапии с использованием МСК от того, вводились клетки от собственного донора гемопоэтических клеток или от стороннего (не совместимого по антигенам HLA) донора.

Ранее не выявлено никаких факторов, прогнозирующих эффективность использования МСК при внутривенном введении [29]. В нашем исследовании характеристик использованных МСК обнаружены отличия между эффективными и неэффективными для терапии оРТПХ образцами. Оказалось, что на поверхности МСК из эффективных образцов достоверно выше экспрессированы молекулы главного комплекса гистосовместимости. Считалось, что молекулы HLA-ABC слабо экспрессированы, а HLA-DR крайне слабо экспрессированы на поверхности МСК [37, 38]. При анализе множества образцов выявились отличия в уровне экспрессии этих молекул. На эффективных образцах их экспрессия достоверно выше примерно в 1,5 раза. Известно, что при активации МСК, например интерфероном γ или при сокультивировании с лимфоцитами, экспрессия этих молекул сильно повышается [39]. Можно предполагать, что клетки из эффективных образов более активны в ингибировании Т-клеток, вызывающих РТПХ, за счет повышенной способности к иммуномодуляции. Более того, достоверное повышение экспрессии CD274(PDL-1) свидетельствует о более высокой способности ингибировать пролиферацию Т-клеток. Известно, что в присутствии PDL-1 снижаются пролиферация Т-клеток и секреция ими цитокинов [40].

В эффективных для лечения образцах МСК отмечалась меньшая суммарная клеточная продукция, чем в неэффективных, что коррелирует с экспрессией FGF2 и IL1BR1. Пролиферация МСК стимулируется основным фактором роста фибробластов (FGF2) и ИЛ-1β (IL1B) [41, 42]. Несмотря на отсутствие достоверных различий, в неэффективных МСК повышен относительный уровень экспрессии генов FGF2 и рецептора IL1BR1 (см. табл. 3).

Мировое научное сообщество пытается рационализировать клиническое применение МСК и выявить закономерности успешной и неуспешной терапии [11, 29]. Ранее нами выявлены различия в свойствах МСК при взаимодействии с лимфоцитами [43]. На основании этой работы проведен анализ всех МСК, использованных для лечения оРТПХ, который выявил существенные различия между эффективными и неэффективными образцами. Эти данные позволяют выбирать потенциально более эффективные образцы для лечения оРТПХ, что может в дальнейшем улучшить клинические результаты.

Заключение

Терапия РТПХ с помощью МСК показала сопоставимую эффективность по сравнению с другими методами терапии оРТПХ, резистентной к глюкокортикоидам РТПХ. Учитывая низкий процент осложнений и высокую эффективность при крайне неблагоприятных формах РТПХ (3–4-я степень, вовлечение кишечника), этот подход представляется одним из оптимальных для лечения данного осложнения. Дальнейшие изучение и подбор оптимальных для терапии образцов МСК могут позволить добиться лучших результатов терапии резистентных форм оРТПХ.