Full - transcriptome analysis of miRNA expression in mononuclear cells in patients with acute decompensation of chronic heart failure of various etiologies

Full Text

АД - артериальное давление АРМ - антагонист минералокортикоидных рецепторов БРА II - блокаторы рецепторов ангиотензина II ДАД - диастолическое артериальное давление ДКМП - дилатационная кардиомиопатия ИАПФ - ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента ИБС - ишемическая болезнь сердца ИМТ - индекс массы тела МНК - мононуклеарные клетки крови мРНК - матричная РНК ОНМК - острое нарушение мозгового кровообращения РНК - рибонуклеиновая кислота САД - систолическое артериальное давление СКФ - скорость клубочковой фильтрации ТБКА - транслюминальная баллонная коронарная ангиопластика ФВ - фракция выброса ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких ХСН - хроническая сердечная недостаточность ЧСС - частота сердечных сокращений miR - микроРНК Сердечная недостаточность - одно из наиболее серьезных осложнений, возникающих на фоне патологии сердечной мышцы различной этиологии. На сегодняшний день более 30 млн человек во всем мире страдают этим симптомокомплексом, сопряженным с неблагоприятным прогнозом и очень высоким риском госпитализаций, и, к сожалению, число таких больных неуклонно растет. Полиэтиологичность сердечной недостаточности и зависимость ее течения от множества факторов во многом ограничивают диагностические и терапевтические возможности современной медицины. Выявление маркеров сердечной недостаточности может расширить не только диагностические возможности, но и наши представления о механизмах развития и причинах возникновения этого заболевания. Натрийуретические пептиды доказали свою высокую эффективность в диагностике сердечной недостаточности и уже в течение многих лет рекомендованы для использования в клинической практике Европейским обществом кардиологов [1-4]. Однако на сегодняшний день не существует биологических маркеров, позволяющих одновременно как диагностировать сердечную недостаточность, так и определять этиологический фактор, приведший к ней. Не существует также и биологического маркера, способного с высокой чувствительностью и точностью оценивать и прогнозировать дальнейшее течение заболевания. МикроРНК - семейство малых одноцепочечных некодирующих рибонуклеиновых кислот (РНК), которые негативно регулируют экспрессию белоккодирующих генов на посттранскрипционном уровне за счет связывания со своей мишенью - матричной РНК (мРНК) с ее последующей деградацией или репрессией трансляции. При этом отдельная микроРНК может взаимодействовать с большим количеством мРНК и, наоборот, отдельная мРНК может быть мишенью для многих микроРНК. Установлено, что некоторые микроРНК функционируют не только внутри клеток, но также могут выходить во внеклеточное пространство, участвуя в передаче сигналов между клетками (так называемые циркулирующие микроРНК). Многочисленные исследования позволили обнаружить микроРНК в различных биологических средах организма. Так, известно, что микроРНК содержатся в плазме крови, перитонеальном и плевральном выпоте, моче, цереброспинальной и слезной жидкостях и т.д. [5]. МикроРНК участвуют во множестве как физиологических, так и патогенетических процессов, происходящих в организме человека. В частности, установлено, что микроРНК служат важным звеном в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний [6]. Сходство профилей микроРНК у здоровых лиц, уникальная последовательность нуклеотидов, тканеспецифичность, высокая устойчивость к воздействиям факторов окружающей среды, различия в профилях экспрессии у лиц с различными заболеваниями - все это позволяет рассматривать микроРНК в качестве потенциальных высокоспецифичных диагностических и прогностических биологических маркеров [7]. Целью настоящей работы был анализ уровней экспрессии микроРНК в мононуклеарных клетках крови (МНК) пациентов с острой декомпенсацией хронической сердечной недостаточности (ХСН) различной этиологии и оценка возможности их использования в качестве биологического маркера. Материалы и методы Для исследования отобрано 7 больных мужского пола с острой декомпенсацией ХСН со сниженной фракцией выброса (ФВ), II-IV функционального класса (ФК) по NYHA [среднее значение (М) ФВ 29,2%, стандартное отклонение (SD) 13,27%] в возрасте от 38 до 65 лет [медиана (Ме) 58 лет]. У 3 пациентов сердечная недостаточность развилась вследствие дилатационной кардиомиопатии (ДКМП) после перенесенного вирусного заболевания (группа ДКМП), у 4 пациентов - на фоне постинфарктного кардиосклероза ишемической природы [группа пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС)]. Клинико-демографическая характеристика пациентов этих групп представлена в табл. 1. Группы пациентов и здоровых добровольцев были сопоставимы по полу и возрасту. Все больные находились на оптимальной медикаментозной терапии, включавшей в себя ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (ИАПФ) или, в случае их непереносимости, блокаторы рецепторов ангиотензина II (БРА II), бета-адреноблокаторы, антагонисты минералокортикоидных рецепторов (АРМ) в целевых или максимально переносимых дозах; на момент забора крови все больные находились на активной диуретической терапии. Критериями исключения являлось наличие каких-либо сопутствующих аутоиммунных или онкологических заболеваний, а также активного воспалительного процесса. В группу контроля включены 5 сопоставимых по возрасту (от 41 до 57 лет, Ме 49 лет) здоровых мужчин-добровольцев. Критериями исключения из данной группы, помимо аутоиммунных или онкологических заболеваний, являлось наличие какой-либо сердечно-сосудистой патологии в анамнезе. От всех пациентов и здоровых добровольцев получено информированное согласие на проведение исследования. Анализировали экспрессию микроРНК в МНК, которые выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-гепака. РНК, содержащую фракцию микроРНК, выделяли из МНК с помощью коммерческих наборов miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) согласно протоколу производителя. Оценку качества выделенной РНК, содержащей фракцию микроРНК, проводили с помощью системы капиллярного гель-электрофореза QIAxcel Advanced System (Qiagen, Германия). Для дальнейшего анализа использовали только образцы, индекс целостности РНК (RNA integrity number, RIN) которых был больше 8. Концентрацию микроРНК определяли с помощью высокочувствительного набора для измерения концентрации РНК на флуориметре Quantus (Promega, США). Образцу РНК от каждого индивида присваивали свой баркод, после чего образцы смешивали в мультиплексные пулы по 4 образца в каждом. Библиотеки для секвенирования приготовлены из 1 мкг РНК, содержащей фракцию микроРНК, с помощью набора для проведения пробоподготовки TruSeq small RNA preparation kit (Illumina, США); секвенирование проводили по протоколу для фрагментов длиной 36 п.о. (36-bp fragment protocol) на секвенаторе MiSeq (Illumina, США). В результате секвенирования сгенерировано от 2 до 4 млн ридов (прочтений) на один образец. Риды всех образцов разделили в соответствии с баркодами с использованием ПО CASAVA (Illumina, США). Для удаления последовательностей адаптеров использовали ПО Trimmomatic. Все риды выровнены и проаннотированы на базу данных микроРНК miRBase-21 (http://www.mirbase.org/). Анализ дифференциальной экспрессии проводили при помощи статистического пакета edgeR version 3.14.0 из репозитория Bioconductor (https://bioconductor.org) по стандартному протоколу, включавшему нормализацию с использованием Relative Log Expression (RLE) метода и оценку дифференциальной экспрессии при помощи обобщенных линейных моделей (GLM). Технические вариации (например, разница в запусках секвенатора) учитывались при моделировании с использованием дизайн-матрицы. При множественных сравнениях оценки статистической значимости (p-value) корректировали по методу Бенджамини-Хохберга, рассчитывая значение FDR (False Discovery Rate). МикроРНК считали дифференциально экспрессирующейся, если удовлетворялись два критерия: 1) более чем двукратная разница в уровне экспрессии в сравниваемых группах: Fold Change (FC) более 2 (соответственно -1<log2FC>1); 2) значение FDR <0,05. Для визуализации отношений в профилях экспрессии всех микроРНК у отдельных индивидов использовали функцию plotMDS(), реализованную в пакете edgeR. Описательная статистика проводилась с помощью пакета программ «SPSS Statistics, версия 23» и представлена в виде среднего±стандартное отклонение (при нормальном распределении параметров) и медианы, 25-го и 75-го процентилей (в случае существенного отклонения распределения параметров от нормальных значений). Нормальность распределения определяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Результаты С помощью высокопроизводительного секвенирования на платформе MiSeq (Illumina) проведен полнотранскриптомный анализ экспрессии микроРНК в МНК 7 пациентов с ХСН (независимо от этиологии) в сравнении с 5 здоровыми индивидами контрольной группы. Полученные результаты в форме графика рассеяния для массива данных (Volcano Plot) при попарных сравнениях уровней отдельных микроРНК у пациентов и здоровых контролей представлены на рис. 1 (см. на цветной вклейке). Выбранным критериям значимости различий в уровнях экспрессии между пациентами с ХСН и индивидами контрольной группы удовлетворяли пять микроРНК: miR-182, miR-144, miR-183, miR-486-5р и miR-143. Как видно из рис. 1, а (см. на цветной вклейке), все они расположены на графике рассеяния в правом верхнем секторе, соответствующем значениям log2FC>1, т.е. уровни их экспрессии выше у больных ХСН по сравнению с контрольной группой. Из данных табл. 2, в которой представлены значения logFC, p-value и FDR для этого сравнения, следует, что это превышение довольно значительно: у больных ХСН уровень экспрессии этих микроРНК выше, чем в контрольной группе, примерно от 4 до 10 раз. Проведена визуализация отношений профилей экспрессии всех микроРНК в отдельных образцах больных ХСН и здоровых контролей (рис. 2, см. на цветной вклейке). Видно, что включенные в исследование контрольные образцы компактно кластеризуются вместе с двумя из трех образцов больных ХСН вирусной этиологии (группа ДКМП). В то же время образцы больных с ХСН ишемической природы (группа ИБС) сильно отличаются по общим профилям экспрессии микроРНК как от образцов контрольной группы, так и между собой. Эти данные свидетельствуют о неоднородности транскрипционных профилей микроРНК у пациентов с ХСН разной этиологии в отличие от профилей здоровых индивидов. Далее мы сравнили профили микроРНК отдельно в группах ИБС (рис. 1, b, см. на цветной вклейке) и ДКМП (рис. 1, c, см. на цветной вклейке) с профилем микроРНК у здоровых индивидов контрольной группы. При ХСН на фоне постинфарктного кардиосклероза (группа ИБС) наблюдали повышение экспрессии miR-182, miR-486-5р, miR-183, miR-144, miR-144*, miR-451, miR-143, miR-1180 и понижение экспрессии miR-204, miR-99а (табл. 3). Первые 4 микроРНК из этого списка характеризуются весьма высокими уровнями значимости: значения p-value лежат в диапазоне от 6,83E-07 до 5,32E-06, а FDR - от 0,000282 до 0,000687. Сравнение с данными в табл. 2 показывает, что повышены экспрессирующиеся miR-182, miR-486-5р, miR-183, miR-144 и miR-143 выявлены также при сравнении всех больных ХСН со здоровыми контролями, причем для всех из них, кроме miR-143, уровень экспрессии (значения FC) и уровень значимости (значения p-value и FDR) в общей группе больных ХСН были ниже, чем в группе ИБС. У больных ХСН вирусной этиологии (группа ДКМП) наблюдали только пониженную дифференциальную экспрессию двух микроРНК: miR-143 и miR-10b (табл. 4). В табл. 5 представлены сводные данные о дифференциально экспрессирующихся микроРНК при ХСН различной этиологии. Как уже отмечалось, в группе ИБС, для которой наблюдали наиболее разнообразный набор дифференциально экспрессирующихся микроРНК, больше половины микроРНК с повышенной экспрессией (miR-182, miR-486-5р, miR-183, miR-144 и miR-143) выявлены также при сравнении всех больных ХСН со здоровыми контролями. По две микроРНК с пониженной экспрессией были идентифицированы в группах ИБС и ДКМП; они не перекрывались и не выявлены в общей группе. Единственной микроРНК, выявляемой при всех типах сравнения, оказалась miR-143. Однако если в общей группе и в группе ИБС ее экспрессия была повышена по сравнению с контролем, то в группе ДКМП - понижена. Обсуждение Наблюдаемые различия в профилях экспрессии микроРНК в МНК при ХСН, возникшей вследствие ИБС или вследствие вирусной инфекции, скорее всего, связаны с различными механизмами патогенеза в зависимости от этиологии. В этой работе мы не получили данных в пользу участия микроРНК в формировании ХСН после перенесенной вирусной инфекции. Можно предположить, что они, по меньшей мере, не играют важной роли в этиопатогенезе заболевания. Гораздо больший интерес, как с точки зрения изучения патогенетических механизмов, так и в свете обнаружения потенциальных маркеров ХСН, представляют данные для больных с ХСН на фоне ИБС. У таких больных в настоящем исследовании выявлено 10 дифференциально экспрессирующихся микроРНК, из них miR-182, miR-486-5p, miR-183, miR-144, miR-144*, miR-451, miR-143 и miR-1180 характеризуются повышенной экспрессией, а miR-204 и miR-99а - пониженной экспрессией. Причастность некоторых из этих микроРНК к сердечно-сосудистым заболеваниям ранее описана в литературе. Здесь следует оговориться, что в большинстве исследований уровни экспрессии микроРНК определяли в сыворотке и плазме крови, тогда как мы для этого использовали МНК. Тем не менее показано, что существует обратная связь между уровнем экспрессии циркулирующей miR-182 и индексом массы миокарда левого желудочка [8]. В другом исследовании продемонстрировано преимущество miR-182 в прогнозировании смертности у пациентов с сердечной недостаточностью по сравнению с NT-proBNP и С-реактивным белком [9]. Nobuhiro Mukai и соавт. выявили повышенный уровень экспрессии miR-486-5p у пациентов с врожденными пороками сердца со сбросом крови из правых отделов сердца в левые [10]. Особый интерес вызывает miR-144. В литературе описана способность miR-144 индуцировать апоптоз кардиомиоцитов [11]. При использовании мышиных моделей обнаружено, что внутривенное введение miR-144 уменьшает зону некроза при остром инфаркте миокарда [12]. Еще в одном исследовании, проведенном B. Chen и соавт., выявлен повышенный уровень miR-144 в плазме крови у пациентов с ИБС. Также обнаружено, что повышенный уровень этой микроРНК ассоциирован с плохим прогнозом у данной категории больных [13]. Повышенный уровень экспрессии в крови miR-451 также характерен для пациентов с ИБС, вызванной наличием нестабильной бляшки в коронарных артериях [14]. Стоит отметить, что, по данным другого исследования, уровень экспрессии данной микроРНК снижался на фоне терапии статинами у пациентов с нестабильной стенокардией [15]. В целом обнаруженные нами дифференциально экспрессирующиеся микроРНК могут рассматриваться как потенциальные маркеры для диагностики ХСН на фоне постинфарктного кардиосклероза. Однако необходимо отметить, что вопрос об их специфичности требует отдельного изучения, поскольку по результатам многочисленных работ уровень экспрессии некоторых из этих микроРНК изменяется также и при различных онкологических процессах [16, 17]. Заключение Благодаря своим уникальным свойствам, молекулы микроРНК рассматриваются разными авторами и в качестве перспективных биологических маркеров различных патологических процессов, и в качестве будущего терапевтического «оружия», способного принести победу в битве со множеством неисцелимых на сегодняшний день заболеваний [18]. В то же время способность микроРНК одновременно регулировать экспрессию многих генов остается препятствием для их терапевтического использования. Очевидно, что диагностический и терапевтический потенциал этих молекул будет возрастать по мере расширения наших знаний о регулируемых ими сетях ген-генных взаимодействий [19]. В настоящей работе с использованием подхода без предварительных допущений (hypothesis-free approach), основанного на результатах полнотранскриптомного секвенирования, обнаружены микроРНК, связанные с развитием ХСН со сниженной ФВ левого желудочка на фоне имеющегося постинфарктного кардиосклероза. Однако наблюдаемая высокая гетерогенность по спектру экспрессируемых микроРНК между отдельными пациентами заставляет относиться к полученным результатам с известной осторожностью. Хотя сам факт вовлечения регуляторных молекул микроРНК в формирование ХСН на фоне ИБС представляется убедительно показанным, окончательные выводы об участии отдельных микроРНК могут быть сделаны только после валидации полученных результатов на более крупных группах больных ХСН ишемической природы и здоровых добровольцев. Работа выполнена в рамках Государственного задания МЗ РФ №01201367594 «Изучение новых диагностических, прогностических маркеров поражения органов-мишеней при декомпенсации сердечной недостаточности».

About the authors

I V Zhirov

Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, National Medical Research Center of Cardiology; Russian Medical Academy of Continuing Professional Education

Email: izhirov@mail.ru
Moscow, Russia

N M Baulina

Institute of Experimental Cardiology, National Medical Research Center of Cardiology

Moscow, Russia

S N Nasonova

Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, National Medical Research Center of Cardiology

Moscow, Russia

G Zh Osmak

Institute of Experimental Cardiology, National Medical Research Center of Cardiology

Moscow, Russia

N A Matveyeva

Institute of Experimental Cardiology, National Medical Research Center of Cardiology

Moscow, Russia

D R Mindzaev

Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, National Medical Research Center of Cardiology

Moscow, Russia

O O Favorova

Institute of Experimental Cardiology, National Medical Research Center of Cardiology

Moscow, Russia

S N Tereshchenko

Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, National Medical Research Center of Cardiology; Russian Medical Academy of Continuing Professional Education

Moscow, Russia

References

Supplementary files