Biochemical and molecular-genetic indicators of inflammation and apoptosis in liver cirrhosis as an outcome of the progression of non-alcoholic steatohepatitis

Full Text

АЛТ - аланинаминотрансфераза АСТ - аспартатаминотрансфераза ИЛ - интерлейкин ИФА - иммуноферментный анализ ЛПВП - липопротеины высокой плотности ЛПК - лейкоциты периферической крови ЛПНП - липопротеины низкой плотности НАЖБП - неалкогольная жировая болезнь печени НАСГ - неалкогольный стеатогепатит НАСГ-ВА - неалкогольный стеатогепатит высокой активности НАСГ-СА - неалкогольный стеатогепатит слабой активности НАСГ-УА - неалкогольный стеатогепатит умеренной активности ОХС - общий холестерин ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени СРБ - C-реактивный белок ТГ - триглицериды ТПС - тканевый полипептид-специфический антиген ФНО-α - фактор некроза опухоли-α ЦП - цирроз печени ЩФ - щелочная фосфатаза IL6 (interleukin 6) - интерлейкин 6 TNFα (tumor necrosis factor alpha) - фактор некроза опухоли-α Введение Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) - широко распространенное хроническое, медленно прогрессирующее метаболическое мультифакториальное заболевание. В настоящее время особый интерес представляет проблема детализации патогенетических механизмов НАЖБП, лежащих в основе ее прогрессирования. Выделяют ряд клинико-морфологических форм НАЖБП: стеатоз, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), фиброз и цирроз печени (ЦП). НАЖБП отличается стадийностью течения от стеатоза к стеатогепатиту и ЦП. Патогенез НАЖБП представлен сложными механизмами, включающими запуск процессов воспаления и гибели гепатоцитов (некроз, апоптоз), инсулинорезистентности, активации звездчатых клеток, фиброгенеза, фиброза, в ходе которых формируется НАСГ, затем трансформирующийся в ЦП. Стеатоз печени характеризуется доброкачественным клиническим течением, тогда как НАСГ отличается прогрессирующим течением с возможным развитием ЦП. У четверти пациентов со стеатозом печени возникает фиброз печени [1], в 15-20% случаев у пациентов с НАСГ в течение 20 лет формируются выраженный фиброз и ЦП. У пациентов с цирротической стадией НАСГ возможно развитие гепатоцеллюлярной карциномы [2]. ЦП является финальной стадией развития хронического гепатита, характеризуется развитием фиброза, полным нарушением дольковой и сосудистой архитектоники органа с образованием узлов-регенератов [3]. Единственным эффективным способом радикальной помощи пациентам со сформировавшимся ЦП является трансплантация печени, которую, к сожалению, не всегда можно выполнить своевременно [4]. При этом механизмы патогенеза и особенности клинического течения ЦП при НАЖБП на молекулярно-генетическом и биохимическом уровне остаются малоизученными. В связи с этим проблема прогрессирования НАЖБП в ЦП остается одной из самых актуальных проблем современной гастроэнтерологии. Ранее мы проанализировали результаты исследований зарубежных и отечественных ученых, а также провели собственные исследования, касающиеся патофизиологических механизмов развития НАЖБП, диагностики, особенностей клинического течения и методов лечения НАЖБП [5]. В одной из работ мы показали, что наряду с изменением общеклинической картины при прогрессировании НАЖБП изменяются цитокиновый профиль и уровни экспрессии генов каспаз в периферических лейкоцитах. При этом основное внимание уделялось прогрессированию НАСГ при НАЖБП [6]. В связи со сложностью механизмов патогенеза НАЖБП и особой актуальностью проблемы прогрессирования НАЖБП в ЦП поставлена задача более детально оценить расширенный комплекс биохимических и молекулярно-генетических показателей воспаления и апоптоза при неалкогольном ЦП как исходе прогрессирования НАСГ. Цель настоящей работы - сравнительный анализ комплекса клинико-лабораторных показателей, в том числе содержания цитокинов в плазме крови и уровня экспрессии генов TNF и IL6 в периферических лейкоцитах, а также уровня биохимических и молекулярно-генетических показателей апоптоза, таких как содержание тканевого полипептид-специфического антигена (ТПС) в крови, активность каспаз 3, 8 и 9 и уровень экспрессии кодирующих их генов в лейкоцитах периферической крови, у пациентов с НАЖБП (c НАСГ разной активности, ЦП классов А и В) и у доноров контрольной группы. Материалы и методы Обследовано 158 больных НАЖБП: 116 пациентов с диагнозом НАСГ, установленным впервые [НАСГ слабой (СА), умеренной (УА) и высокой (ВА) активности] и 42 пациента с диагнозом НАЖБП на стадии ЦП, установленным впервые (ЦП классов А и В по Чайлд-Пью). Контрольную группу составили 54 здоровых донора (без клинических проявлений НАЖБП). Клиническая характеристика исследуемых групп приведена в табл. 1. Диагноз c оценкой степени активности НАСГ и класса ЦП устанавливался на основании традиционных клинических, лабораторных, инструментальных и гистологических данных. Выполнялось ультразвуковое исследование органов брюшной полости (аппарат Vivid Pro-7, General Electric, США) с оценкой эхогенности и размеров печени, размеров селезенки, наличия асцита, при допплерографии определялись диаметры воротной и селезеночной вен и линейная скорость кровотока в них для выявления портальной гипертензии. При эзофагогастроскопии оценивалось наличие варикозного расширения вен пищевода и кардиального отдела желудка. Части больных выполнялась спиральная компьютерная томография печени с оценкой плотности печени и слепая чрескожная пункционная биопсия печени с оценкой степени активности и фиброза по методу Brunt [7]. Тяжесть цирроза рассчитывалась с помощью классификации Чайлд-Пью [8, 9]. Доноры включены в исследование на основании информированного согласия. Критерии исключения, общие для изучаемых групп: перенесенные в последний месяц инфекционно-воспалительные заболевания, беременность и лактация, курение, сахарный диабет, индекс массы тела ≥30 кг/м2. У обследованных лиц исключен вирусный, лекарственный и аутоиммунный генез поражения печени, сахарный диабет 1-го и 2-го типа. Все доноры являлись жителями Республики Карелия. На проведение исследований получено согласие Комитета по медицинской этике Министерства здравоохранения Республики Карелия и Петрозаводского государственного университета. В качестве материала для исследования использовали образцы венозной крови доноров изучаемых групп. Взятие материала для исследования проводилось до назначения гепатопротекторной и иной терапии. Оценивались печеночные функциональные пробы: активность АЛТ, АСТ, уровень общего и прямого билирубина, ЩФ, альбумина, γ-глобулина, СРБ, протромбина, фибриногена, ОХС, ЛПВП, ЛПНП, ТГ - на анализаторе Random Access F-15 (BioSystems, Испания). Концентрацию цитокинов и содержание ТПС (фрагменты цитокератина 18) в крови определяли методом неконкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест-систем «Интерлейкин-1бета-ИФА-Бест», «Интерлейкин-6-ИФА-Бест», «Интерлейкин-10-ИФА-Бест» («Вектор-Бест», Россия), Human TNFα Platinum ELISA (eBioscience, Австрия), TPS (ТПС) ELISA (Biotech, Швеция) на анализаторе Sunrise (Tecan, Швейцария). Для определения уровня транскрипции генов TNF, IL6 и генов каспаз из цельной крови выделяли лейкоциты периферической крови (ЛПК). Тотальную РНК из ЛПК выделяли с помощью реагента ExtractRNA («Евроген», Россия). Первую цепь комплементарной ДНК синтезировали из 5 мкг тотальной РНК с помощью набора MMLV RT kit («Евроген», Россия). Степень чистоты и концентрацию кДНК определяли на приборе SmartSpecPlus (Bio-Rad, США). Уровень транскрипции генов в ЛПК оценивали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на приборе iCycler с оптической приставкой iQ5 (Bio-Rad, США), используя набор для амплификации с интеркалирующим красителем SYBR Green («Евроген», Россия). Специфичность продуктов амплификации проверяли плавлением ПЦР фрагментов. Повторность при ПЦР-анализе - 2-кратная. Уровень транскрипции изучаемых генов рассчитан относительно уровня транскрипции гена GAPDH [10]. Описание праймеров для генов GAPDH, каспаз 3, 8, 9 в ЛПК представлено в работе [6]. Последовательность праймеров для генов TNF и IL6 указана в работах [11, 12]. Активность каспаз 3, 8 и 9 в ЛПК определяли с использованием наборов Caspase 3 Assay Kit, Colorimetric (содержащий субстрат каспазы 3 N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-Nitroanilide), Caspase 8 Assay Kit, Colorimetric (содержащий субстрат каспазы 8 N-Acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroaniline) и субстрата каспазы 9 N-Acetyl-Leu-Glu-His-Asp-p-Nitroanilide фирмы Sigma, в соответствии с инструкциями производителя. Активность ферментов определяли колориметрическим методом по скорости расщепления синтетического субстрата на планшетном ридере CLARIOstar (BMG Labtech GmbH, Германия). Активность каспаз выражали в наномолях p-нитроанилина (p-NA), образующегося за 1 мин, в расчете на 1 мл пробы (при условии, что 100 мкл лизирующего буфера содержит 107 живых клеток). Статистическая обработка материала проведена c использованием программного обеспечения StatGraphics 2.1 (Statistical Graphics Corp., США). Проводили тест на соответствие результатов нормальному распределению. Для оценки различий биохимических и других показателей в группах исследования использовали непараметрический критерий U Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считали достоверными при p<0,05. Результаты У пациентов по мере прогрессирования НАСГ наблюдается повышение маркеров цитолитического и холестатического синдромов - АЛТ, АСТ, ЩФ. Также у них растет уровень показателей мезенхимально-воспалительного синдрома (СРБ и γ-глобулина), закономерно изменяется липидный спектр (см. табл. 1). При ЦП активность АЛТ и АСТ снижена по сравнению с таковой при НАСГ-УА и -ВА и нарастает от класса А к классу В ЦП, а уровень ЩФ достоверно выше у ЦП-А по сравнению с НАСГ-СА и у ЦП-В по сравнению с НАСГ-СА и -УА. При ЦП по сравнению с НАСГ и прогрессивно классу ЦП значимо возрастает концентрация общего и прямого билирубина и снижается уровень протромбина. У больных ЦП также значительно повышен уровень СРБ, который достигает максимума у пациентов с ЦП класса В, уровень γ-глобулина сопоставим с таковым у пациентов с НАСГ-ВА. По мере прогрессирования ЦП (от класса А к классу В) значительно снижается уровень альбумина в крови. О глубоких нарушениях липидного обмена свидетельствует снижение уровней всех основных фракций липидов у пациентов ЦП класса В (см. табл. 1). Анализ содержания цитокинов в плазме крови и уровня транскрипции генов основных провоспалительных цитокинов TNF и IL6 в ЛПК показал, что концентрация ИЛ-6 при НАСГ и ЦП достоверно выше, чем в контроле, при этом содержание данного цитокина в крови значительно выше у пациентов с ЦП, по сравнению с НАСГ, и нарастает прогрессивно классу ЦП, достигая максимального значения при ЦП-В (табл. 2). В то же время уровень экспрессии гена IL6 в ЛПК не различается у доноров изучаемых групп. При ЦП также повышен уровень ИЛ-1β по сравнению с контролем; у пациентов с ЦП класса В содержание ИЛ-1β в крови достоверно выше, чем у пациентов с НАСГ любой степени активности. Содержание ФНО-α и ИЛ-10 у пациентов с НАЖБП повышено по сравнению с контролем и не различается в зависимости от формы НАЖБП. Нужно отметить, что оценка уровня экспрессии генов TNF и IL6 в ЛПК в зависимости от формы НАЖБП проведена впервые. Показано, что пациенты с НАСГ-ВА имеют повышенный уровень экспрессии гена TNF в ЛПК по сравнению с контролем, НАСГ-СА и -УА и по сравнению с ЦП классов А и В (см. табл. 2). Несмотря на отсутствие достоверных различий уровней экспрессии генов каспаз в ЛПК у пациентов с НАСГ разных степеней активности, в результате анализа биохимических и молекулярно-генетических показателей апоптоза гепатоцитов и периферических лейкоцитов в ряде случаев выявлено снижение уровня их экспрессии у больных НАСГ по сравнению с контролем. При НАСГ всех степеней активности уровень экспрессии гена каспазы 3 ниже, чем в контроле. Уровень экспрессии гена каспазы 8 в ЛПК при НАСГ-СА достоверно ниже, чем в контроле, уровни транскрипции гена каспазы 9 при НАСГ-СА и НАСГ-ВА также ниже, чем в контроле. При ЦП экспрессия генов каспаз в ЛПК находится на уровне контроля, за исключением уровня транскрипции гена каспазы 3 при ЦП-А и каспазы 9 - при ЦП-В (данные показатели ниже, чем в контроле; табл. 3). Впервые проведен анализ активности основных каспаз в ЛПК при прогрессировании НАЖБП (см. табл. 3). Показано, что активность каспаз 3, 8 и 9 в ЛПК пациентов с НАСГ всех степеней активности и ЦП классов А и В выше, чем в контроле. При этом наблюдаются достоверные отличия уровня активности каспаз у пациентов с ЦП по сравнению с НАСГ. Так, активность эффекторной каспазы 3 при ЦП выше, чем при НАСГ-СА. Активность каспазы 8 снижена при ЦП относительно НАСГ-УА и -ВА, а активность каспазы 9 при ЦП значительно выше, чем при НАСГ любой степени активности (см. табл. 3). Обсуждение В связи со сложностью механизмов патогенеза НАЖБП и особой актуальностью проблемы прогрессирования НАЖБП в ЦП после тщательного отбора пациентов, которым на момент забора материала не назначена гепатопротекторная и иная терапия, проведен сравнительный анализ целого комплекса клинико-лабораторных, биохимических и молекулярно-генетических показателей повреждения печени, воспаления (в том числе экспрессии в ЛПК генов основных провоспалительных цитокинов, отвечающих за воспаление при прогрессировании НАЖБП), апоптоза (ТПС как показателя апоптоза гепатоцитов, активности каспаз и экспрессии кодирующих генов в ЛПК). В целом, нами зарегистрированы специфические изменения клинической картины при прогрессировании НАСГ и ЦП. При ЦП изменения клинических показателей свидетельствуют о развитии печеночно-клеточной недостаточности вследствие уменьшения массы паренхиматозной ткани, нарушении белкового и липидного обменов, прогрессирующем воспалении. В результате анализа содержания цитокинов в плазме крови и уровня транскрипции генов основных провоспалительных цитокинов TNF и IL6 в ЛПК получены интересные новые данные, свидетельствующие о достоверных отличиях уровня экспрессии гена TNF в ЛПК у пациентов с НАСГ высокой активности от такового у здоровых людей и пациентов с НАСГ-СА, -УА и ЦП. Высокий уровень экспрессии гена TNF в ЛПК у пациентов НАСГ-ВА позволяет рассматривать этот показатель как новый диагностический маркер НАСГ-ВА. Изменение цитокинового профиля при прогрессировании НАСГ и ЦП подтверждает ключевую роль провоспалительных цитокинов как медиаторов воспалительного процесса при прогрессировании НАЖБП [13]. В настоящее время возрастает количество работ, в которых наряду с цитокинами в качестве перспективных маркеров прогрессирования НАЖБП рассматриваются показатели апоптоза. При этом проблема роли апоптоза как одной из форм программируемой гибели клеток в прогрессировании НАЖБП остается малоизученной [14]. В связи с этим проведен сравнительный анализ биохимических и молекулярно-генетических показателей апоптоза гепатоцитов (уровня ТПС в крови) и периферических лейкоцитов (активности каспаз и уровня экспрессии генов каспаз). ТПС представляет собой фрагмент промежуточных филаментов цитоскелета клетки, которые нарезаются эффекторной каспазой 3 при апоптозе гепатоцитов, и служит сывороточным маркером данного явления при НАСГ [15]. Результаты исследования уровня ТПС при НАЖБП неоднозначны, хотя большинство авторов рассматривают его в качестве информативного маркера воспаления и фиброза при прогрессировании данного заболевания [16, 17]. Индукция апоптоза, как известно, опосредуется активацией каспаз - ферментов семейства протеаз, причем увеличение активности эффекторных каспаз, а именно - каспазы 3, как правило, указывает на необратимую деградацию клеток. Так, у пациентов с неалкогольным и алкогольным стеатогепатитами возрастает количество клеток с признаками апоптоза, сопровождаемое увеличением активности каспазы 3 [18]. Следует отметить, что, несмотря на все возрастающее количество работ, посвященных изучению вклада каспазо-зависимого апоптоза в патогенез неинфекционных заболеваний печени, роль каспаз в развитии этих патологий до конца не изучена. Кроме того, в литературе мало информации об интенсивности апоптоза периферических лейкоцитов при прогрессировании НАЖБП, в то время как ЛПК являются главными клетками, реализующими иммуновоспалительный процесс в печени и прогрессирование печеночно-клеточной недостаточности. Основная часть данных об экспрессии и изменении активности каспаз получена на гепатоцитах, а не на лейкоцитах периферической крови [19]. Сведения об изменении уровня апоптоза клеток периферической крови при развитии патологий печени малочисленны и касаются в основном заболеваний вирусного и аутоиммунного генеза [20]. В связи с этим актуальным является вопрос изучения показателей апоптоза данных клеток при прогрессировании НАЖБП. В настоящем исследовании не зарегистрировано достоверных различий уровней экспрессии генов каспаз в ЛПК у пациентов изучаемых групп, в связи с чем эти показатели нельзя считать специфичными для оценки прогрессирования НАЖБП. Данные анализа активности основных каспаз в периферических лейкоцитах при прогрессировании НАЖБП являются абсолютно новыми. Показано, что активность каспаз 3, 8 и 9 в ЛПК пациентов с НАСГ всех степеней активности и ЦП классов А и В выше, чем в контроле. Нужно отметить, что регуляция функционирования каспаз может осуществляться не только на уровне транскрипции. Так, итоговая каспазная активность в каждом конкретном типе тканей определяется не только уровнем транскриптов генов каспаз, но и наличием или отсутствием ингибиторов апоптоза [21, 22]. Также полученные нами результаты могут свидетельствовать о разных механизмах регуляции апоптоза лейкоцитов и гепатоцитов. Зарегистрированные достоверные отличия уровней активности каспаз у пациентов с ЦП по сравнению с НАСГ свидетельствуют о том, что при прогрессировании НАЖБП в ЦП в периферических лейкоцитах имеет место усиление процессов апоптоза, запускаемых по внутреннему митохондриальному пути, и снижение активности апоптоза, активируемого через «рецепторы смерти». Что касается данных об уровне ТПС в крови, они согласуются с данными литературы об усилении процессов апоптоза гепатоцитов при НАСГ [23]. Заключение Таким образом, в настоящем исследовании показано, что при неалкогольном ЦП как исходе прогрессирования НАСГ изменения клинических показателей (свидетельствующие о развитии печеночно-клеточной недостаточности, нарушении белкового и липидного обменов, прогрессирующем воспалении) сопровождаются специфическими изменениями уровней биохимических и молекулярно-генетических показателей апоптоза и воспаления. При прогрессировании НАСГ в ЦП изменяется цитокиновый профиль за счет повышения уровня провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-1β. По сравнению с ЦП, у пациентов с НАСГ-ВА отмечается высокий уровень экспрессии гена TNF в ЛПК, который также значительно выше такового у здоровых людей и пациентов с НАСГ-СА, -УА. Данный факт позволяет рассматривать этот показатель как новый диагностический маркер разграничения НАСГ-ВА и ЦП. При прогрессировании НАЖБП в ЦП в ЛПК имеют место усиление процессов апоптоза, запускаемых по внутреннему (митохондриальному) пути, и снижение активности апоптоза, активируемого по внешнему пути (через «рецепторы смерти»). Увеличение активности каспазы 9 и снижение активности каспазы 8 в ЛПК у пациентов с ЦП, по сравнению с НАСГ, можно рассматривать в качестве перспективного малоинвазивного маркера прогрессирования НАЖБП в ЦП. Исследования выполнены на научном оборудовании Центра коллективного пользования Федерального исследовательского центра «Карельский научный центр Российской академии наук». Финансовое обеспечение исследований осуществлялось из средств федерального бюджета на выполнение государственного задания КарНЦ РАН (0221-2017-0049). Работа выполнена также при финансовой поддержке программы развития опорного университета ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» на период 2017-2021 годов - проекта «Высокие биомедицинские технологии здоровьесбережения населения в арктической и субарктической зонах», проекта «Разработка технологии скрининговой диагностики неалкогольной жировой болезни печени у лиц с избыточным весом и метаболическим синдромом» № 9173ГУ/2015.

About the authors

I V Kurbatova

Institute of Biology of the Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences (IB KarRC RAS), Laboratory for Genetics

Email: irina7m@yandex.ru
Petrozavodsk, Russia

L V Topchieva

Institute of Biology of the Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences (IB KarRC RAS), Laboratory for Genetics

Petrozavodsk, Russia

O P Dudanova

Petrozavodsk State University, Institute of Medicine, Department of Propaedeutics of Internal Diseases and Hygiene

Petrozavodsk, Russia

A A Shipovskaya

Petrozavodsk State University, Institute of Medicine, Department of Propaedeutics of Internal Diseases and Hygiene

Petrozavodsk, Russia

References

Supplementary files