Destruction of the bronchial epithelium in patients with severe asthma according to different patterns of inflammation and cold airway hyperresponsiveness

Full Text

БА - бронхиальная астма ДИ - доверительный интервал ДК - дентритные клетки ИДК - индекс деструкции клеток СОС25-75 - средняя объемная скорость выдоха на уровне 25-75% форсированной жизненной емкости легких ОФВ1 - объем форсированного выдоха за первую секунду ОШ - отношение шансов ФР - факторы роста ХГДП - холодовая гиперреактивность дыхательных путей ACT - Asthma Control Test IL - интерлейкин TGFβ - трансформирующий фактор роста β Клинический феномен холодовой гиперреактивности дыхательных путей (ХГДП), согласно данным клинико-анамнестического тестирования, часто обнаруживается у больных бронхиальной астмой (БА) разной степени тяжести и ассоциируется с низким уровнем контроля болезни на фоне активации нейтрофильного сегмента бронхиального воспаления [1-5]. Наличие ХГДП у больных тяжелой БА, характеризующейся трудно контролируемым течением, низкой обратимостью бронхиальной обструкции под влиянием бронхорасширяющих средств и высоким уровнем бронхиальной гиперреактивности, приумножает сложность терапевтической минимизации проявлений болезни [6]. Ранее показано, что персистирующее воспаление в слизистой оболочке бронхов больных тяжелой неконтролируемой БА на фоне ХГДП манифестируется двумя клеточными паттернами, определяемыми путем исследования цитограмм индуцированной мокроты: эозинофильным и смешанным, при этом отмечается сопряженность паттерна воспаления бронхов с проявлениями тяжести течения болезни, нарушениями вентиляционной функции легких и частотой развития ХГДП [7]. Так как воспаление дыхательных путей составляет морфологическую основу бронхиальной гиперреактивности и ремоделирования, возникает вопрос о взаимосвязи функциональной активности ведущих клеточных эффекторов воспаления, обусловливающих морфофункциональный статус воспалительного паттерна, - эозинофилов и нейтрофилов - с изменениями бронхиального эпителия, активно участвующего в ремоделировании бронхов при астме [8]. Наибольший интерес представляет оценка эпителиальной деструкции как маркера инертности достижения контроля клинических проявлений болезни у пациентов с тяжелой БА в условиях реакции дыхательных путей на постоянное воздействие экологически обусловленных триггеров, таких как низкая температура атмосферного воздуха. Целью настоящей работы явилось изучение состояния эпителия слизистой оболочки бронхов во взаимосвязи с выраженностью клинических проявлений при тяжелой неконтролируемой БА в зависимости от паттерна воспаления и наличия ХГДП. Материалы и методы В холодный период года (ноябрь-март) проведено обследование 48 больных с ранее установленным диагнозом тяжелой БА согласно критериям GINA [9]. Все пациенты подписывали информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с протоколом, одобренным локальным комитетом по биомедицинской этике Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания (протокол №81Т от 29.07.14). Критерии включения: объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1) менее 60% от должного значения; доказанная обратимость бронхиальной обструкции (прирост ОФВ1>12% от исходных значений после применения бронходилататора, но не менее 200 мл); отсутствие обострения заболевания и соматической патологии в стадии декомпенсации; уровень контроля астмы согласно вопроснику Asthma Control Test (ACT, Quality Metric Inc., 2002) <20 баллов; объем базисной терапии, соответствующий 4-й ступени доз ингаляционных кортикостероидов и длительно действующих β2-агонистов. Из сопутствующих заболеваний у 14 пациентов имелась гипертоническая болезнь. На момент обследования все больные получали терапию комбинированным препаратом салметерол/флутиказон 25/250 мкг/доза (суточная доза ингаляционных кортикостероидов в среднем по группе составила 678,0±17,3 мкг/сут); количество обострений БА за предыдущие 12 мес в среднем составило 3,6±0,25; системные глюкокортикостероиды применялись в среднем в 1,6±0,2 обострения БА. Дизайн исследования предусматривал заполнение пациентом специально разработанной скрининг-анкеты по выявлению клинических признаков ХГДП, включающей вопросы о состоянии и субъективных ощущениях больных в зимний период времени при контакте с холодным воздухом. Клинический диагноз ХГДП выставлялся при положительных ответах на наличие приступов удушья и/или затруднения дыхания при контакте с холодом [1]. Исследование функции внешнего дыхания выполнялось по стандартной методике на аппарате Easy on-PC (nddMedizintechnik AG, Швейцария) с последующей проверкой параметров кривой «поток-объем» форсированного выдоха на обратимый компонент обструкции путем ингаляции 200 мкг сальбутамола. Условия проведения функциональных исследований соблюдены в соответствии с международными стандартами проведения спирометрического исследования (АТS/ЕRS, 2005), бронхолитическая терапия β2-агонистами длительного действия отменялась за 12 ч до предполагаемого исследования [10]. Сбор образца мокроты осуществлялся в 8 ч утра в стерильный контейнер. Цитологическое исследование микропрепаратов проводилось по общепринятой методике не позднее 2 ч после ее получения. Отбирался материал с минимальным уровнем контаминации плоскоклеточным эпителием (менее 20% плоских эпителиоцитов от всех клеток). Подсчитанное количество клеток выражали в процентах от общего числа. Определение степени деструкции в клетках бронхиального эпителия, нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитах проводили по методу Л.А. Матвеевой [11]. В основе указанного метода лежит выделение пяти классов деструкции клеток в зависимости от изменений структурной целостности клеточных элементов. Степень повреждения клеток вычисляли с помощью суммарного индекса деструкции клеток (ИДК): ИДК=n1+n2+n3+n4/100, где 0, 1, 2, 3, 4 - классы деструкции; n0, n1, n2, n3, n4 - количество клеток соответствующего класса. Статистический анализ полученного материала проводился на основе стандартных методов вариационной статистики. Для определения достоверности различий в группах использовали непарный t-критерий (Стьюдента) и критерий Вилкоксона. С целью определения степени связи между двумя случайными величинами проводили корреляционный анализ, рассчитывали коэффициент корреляции (r). Анализ распространенности признака в сравниваемых группах (частота альтернативного распределения) проводили по критерию χ² Пирсона для четырехпольной таблицы. Для всех величин принимался во внимание минимальный уровень значимости р=0,05. Результаты По данным цитологического анализа мокроты, согласно представлениям об основных клеточных паттернах воспаления бронхов, характерных для БА, больных разделили на две группы [12, 13]. В I группу (22 пациента) включены лица с эозинофильным паттерном воспаления (>2% эозинофилов), во II группу (26 пациентов) - со смешанным паттерном воспаления (≥2% эозинофилов и ≥61% нейтрофилов). Сформированные группы больных статистически достоверно различались по уровню контроля астмы, дозе препарата базисной терапии и показателям функции внешнего дыхания (табл. 1). Так, пациенты II группы характеризовались более низким контролем над заболеванием, большей частотой случаев обострения болезни, более значимым снижением показателей бронхиальной проходимости на уровне дистальных бронхов. Они получали достоверно более высокую дозу комбинированного препарата базисной противовоспалительной терапии. Частота встречаемости клинически значимых признаков ХГДП (удушье и/или затрудненное дыхание) у больных II группы составила 79% случаев, у больных I группы - 19% случаев (χ2=14,18; р<0,001). Вероятность появления гиперреактивности дыхательных путей на воздействие холода у пациентов II группы была в 3 раза выше по сравнению с I группой [отношение шансов (ОШ) 3,28 при 95% доверительном интервале (ДИ) от 0,43 до 5,68]. Данные цитологического анализа мокроты больных I и II группы представлены в табл. 2. Эозинофильный паттерн воспаления в I группе характеризовался существенной долей эозинофилов и значительным содержанием нейтрофилов, число которых, однако, было достоверно меньше, чем во II группе. Среднее число лимфоцитов, обнаруженных в мокроте, существенно не отличалось, тогда как количество макрофагов и число клеток бронхиального эпителия преобладало в цитограммах больных I группы. При оценке степени деструкции эпителиальных клеток в мокроте получены более высокие значения во II группе (табл. 3). Одновременно, судя по ИДК, в этой группе прослеживалась более выраженная деструкция нейтрофилов и менее выраженная деструкция эозинофилов по отношению к пациентам I группы. Судя по полученным нами данным, эозинофильный паттерн воспаления манифестировался процессом усиленной десквамации покровных клеток, что нашло отражение в наибольшем их содержании в мокроте и менее выраженной степени деструкции эпителия. Смешанный паттерн сопровождался активной деструкцией эпителия на фоне меньшего по отношению к эозинофильному паттерну количества эпителиоцитов, обнаруженных в мазках мокроты. В то же время у пациентов со смешанным паттерном воспаления выявлена тесная корреляционная связь ИДК эпителия с ИДК нейтрофилов (r=0,61; р<0,01) и ИДК эозинофилов (r=0,48; р<0,05). Кроме того, уровень контроля астмы у них зависел от степени выраженности деструктивных процессов в гранулоцитах мокроты, что подтверждалось наличием обратной корреляции между АСТ и ИДК нейтрофилов (r=-0,71; р<0,01), АСТ и ИДК эозинофилов (r=-0,53; р<0,05). Обсуждение Известно, что отличиями смешанного паттерна воспаления у больных тяжелой трудно контролируемой БА от эозинофильного паттерна служат не только многочисленность нейтрофильного пула, но и более высокие параметры окислительной ферментативной активности гранулоцитов - уровень синтеза и депонирования пероксидазы в цитоплазматических гранулах, степень деструкции клеточных мембран, интенсивность цитолиза клеток [7]. Высокий при смешанном паттерне уровень ферментативной функциональной активности, дегрануляции, деструкции и цитолиза нейтрофилов и эозинофилов ассоциирован с эскалацией оксидативного стресса и свободнорадикального повреждения бронхов, потенцированием синтеза оксидантов, усиленным выбросом из клеток-эффекторов в экстрацеллюлярное пространство флогогенных агентов, прогрессированием и персистенцией воспаления. Доказано, что деструкция бронхиального эпителия, сопряженная с воспалительными деструктивно-цитолитическими изменениями гранулоцитов, оказывает непосредственное влияние на развитие бронхоспастической реакции. Медиаторы воспалительных клеток-эффекторов при альтерации и нарушении структурной целостности эпителия стимулируют суб- и интраэпителиально расположенные нервные окончания - С-волокна, связанные с неадренергическими/нехолинергическими ганглиями «третьей» сигнальной нервной системы (NANC), играющей особую роль при БА [8]. В результате проведения нервного импульса по С-волокнам высвобождаются субстанция Р и нейрокинины А и В - нейротрансмиттеры с выраженными бронхоконстрикторным и вазодилататорным эффектами, которые активируют тучные клетки, макрофаги, Т- и В-лимфоциты, усиливают сосудистую адгезию и являются хемоаттрактантами для эозинофилов и нейтрофилов. Кроме того, воспалительное повреждение эпителия сопровождается отсутствием эффектов синтезируемого нейросекреторными клетками иммуномодулирующего нейропептида VIP - бронхо- и вазодилататора, ингибирующего выработку интерферона-γ, интерлейкина (IL)-12, IL-2 и индуцибельной NO-синтазы, что, наряду с нарушением выработки эпителиоцитами простагландина Е2, ведет к усилению бронхоспазма [8]. В качестве факторов, способствующих формированию и поддержанию гиперреактивности бронхов, рассматриваются функциональные особенности эпителия больных БА, позволяющие покровным клеткам активно участвовать в воспалении и индукции Тh2-иммунного ответа. К ним относятся повышенная базальная экспрессия провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-8), резко возрастающая под воздействием поллютантов, высокие уровни продукции поверхностных клеточных рецепторов, хемоаттрактантов, колониестимулирующих факторов (GMСSF), приверженность к особому фенотипу антиген-презентирующих дентритных клеток (ДК), ассоциированному с гиперпродукцией IL-4 и IL-5 и связанному с отдельной субпопуляцией легочных ДК, избирательно направляющей дифференцировку Тh0-лимфоцитов по Th2-пути с экспрессией рецептора тирозиновых киназ CD117 (c/kit) в качестве мембранного маркера [8, 14]. Важным звеном в патогенезе бронхообструктивного синдрома являются уплотнение и фиброз собственной пластинки слизистой оболочки бронхов, развивающиеся у больных тяжелой БА [15]. О вкладе деструкции эпителия в процессы фиброплазии и ремоделирования бронхов свидетельствуют данные экспериментов in vitro. Поврежденные эпителиоциты вырабатывают активирующие репаративные механизмы фиброгенные и провоспалительные факторы роста (ФР) - тромбоцитарный фактор роста, факторы роста фибробластов, инсулиноподобные факторы роста, бронхо- и вазоконстриктор эндотелин-1, а также трансформирующий фактор роста β (TGFβ), уровень экспрессии которого в наибольшей степени выражен у больных тяжелой БА [8, 16, 17]. TGFβ участвует в формировании ключевого механизма ремоделирования бронхов - фенотипической трансформации фибробластов в миофибробласты, индуцирует синтез белков экстрацеллюлярного матрикса (коллагенов) и рост бронхиальных лейомиоцитов [17]. Синтетическая активность фибробластов и миофибробластов собственной пластинки слизистой оболочки бронхов обусловлена характером и выраженностью бронхиального инфильтрата [8, 15]. При нейтрофильном типе воспаления у больных тяжелой БА за счет стимуляции нейтрофилами продукции ФР и металлопротеиназ, регулирующих превращение фибробластов в миофибробласты и лейомиоциты, в слизистой оболочке увеличивается относительный объем соединительной ткани и утолщается базальная мембрана, эпителий атрофируется и достигает минимальной объемной плотности [15, 17, 18]. Эксфолиация эпителия, преобладающая при эозинофильном профиле воспаления у больных БА легкого и среднетяжелого течения, связана с цитотоксическим действием агрессивных эозинофильных протеинов - эозинофильного катионного белка, главного белка с основными свойствами [15, 19, 20]. Медиаторы, высвобождающиеся из гранул эозинофилов, обильно инфильтрирующих слизистую оболочку бронхов в условиях эозинофильного воспаления, способствуют эксфолиации поверхностных эпителиоцитов при сохранении достаточно высокой объемной плотности эпителиального пласта [15]. Данные литературы о стимуляции эозинофилами десквамации эпителия нашли подтверждение в максимальном содержании эпителиоцитов в мокроте больных тяжелой неконтролируемой БА с эозинофильным паттерном воспаления, между тем как у пациентов-носителей смешанного воспалительного паттерна и наиболее интенсивной деструкции нейтрофилов преобладали процессы разрушения эпителиальных клеток. Сравнительное изучение клинических проявлений астмы позволило выявить негативное влияние нейтрофильного сегмента воспаления на проходимость дыхательных путей, достижение контроля заболевания и формирование ХГДП, при котором активируются оксидантная синтетическая функция, секреция пероксидазы, дегрануляция, деструкция и цитолиз нейтрофилов [5, 7]. Возможно, более сложный клинический аспект смешанного паттерна воспаления обусловлен не только активной деструкцией и цитолизом нейтрофилов, но и усиленной гибелью эпителиоцитов воспалительного инфильтрата. Передача сигналов апоптоза эпителия в этом случае осуществляется не по прямому пути, от лигирования рецептора смерти до каспазной активации каскада и гибели эпителиоцитов, а по пути, опосредованному свободнорадикальным повреждением крист митохондрий, разрушением эндоплазматического ретикулума и деэнергизацией клеток [16]. По всей видимости, апоптоз и некроз эпителия у больных II группы в значительной мере зависят от активации нейтрофильных лизосомальных ферментов и осуществляемого при деструкции и цитолизе нейтрофилов выброса высокореакционноспособных реагентов - активных форм кислорода и галогенов. О зависимости повреждения эпителия от интенсивных деструктивных изменений нейтрофилов свидетельствует найденная нами связь между ИДК эпителия и ИДК нейтрофилов и эозинофилов. За гибелью эпителиальных клеток следуют процессы ремоделирования слизистой оболочки бронхов - пролиферация эпителиоцитов и фибробластов с трансформацией последних в миофибробласты и гладкие миоциты, продукция цитокинов, неоангиогенез, реэпителизация и фиброз, при тяжелой БА - депонирование не только матричных белков, но и трансцеллюлярных компонентов основного вещества соединительной ткани (фибронектина, тенасцина) [15-17]. Стимулирующие эпителиальную деструкцию деструктивные изменения гранулоцитов у этих больных способны оказывать отрицательное влияние на проходимость дыхательных путей, тяжесть течения болезни и формирование ХГДП. Об этом свидетельствует и выявленная связь между уровнем контроля астмы и степенью выраженности деструктивных процессов в гранулоцитах мокроты. Заключение Степень деструкции эпителия слизистой оболочки бронхов у больных тяжелой БА с неконтролируемым течением ассоциируется с паттерном воспаления бронхов и степенью деструкции гранулоцитов воспалительного инфильтрата. Наиболее выраженная деструкция эпителия наблюдается у больных со смешанным воспалительным паттерном и связана с интенсивными деструктивными изменениями нейтрофильного пула. Деструкция эпителия слизистой оболочки бронхов оказывает негативное влияние на клинические проявления БА, достижение контроля над заболеванием и формирование ХГДП. Таким образом, степень деструкции эпителия и гранулоцитов обладает диагностической значимостью для оценки тяжести заболевания, клинических проявлений реакции дыхательных путей на холодовой триггер и инертности достижения контроля у больных тяжелой неконтролируемой БА. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

A B Pirogov

Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration

Blagoveshchensk, Russia

D A Gassan

Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration

Blagoveshchensk, Russia

S S Zinov’ev

Amur State Medical Academy of the Ministry of Health of the Russian Federation

Blagoveshchensk, Russia

A G Prikhodko

Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration

Blagoveshchensk, Russia

V P Kolosov

Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration

Blagoveshchensk, Russia

J M Perelman

Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration

Email: jperelman@mail.ru
Blagoveshchensk, Russia

References

Supplementary files