Notch signal pathway - therapeutic target for regulation of reparative processes in the heart

Full Text

ВКМ - внеклеточный матрикс ИЛ - интерлейкин ИМ - инфаркт миокарда ИФН-γ - интерферон-γ МСК - мезенхимальные стволовые клетки ПКС - прогениторные клетки сердца ПЭК - прогениторные эндотелиальные клетки ТФР-β - трансформирующий фактор роста β ФНО-α - фактор некроза опухолей α CTGF - фактор роста соединительной ткани CTGF - фактор роста соединительной ткани HGF - фактор роста гепатоцитов LPS - липополисахарид LPS - липополисахарид MIP-1α - воспалительный белок макрофагов 1α MIP-1α - воспалительный белок макрофагов 1α Проблема регенерации сердечной мышцы привлекает внимание исследователей на протяжении многих десятков лет и особенно актуальна в последнее десятилетие. Это объясняется как высокой социальной значимостью заболеваний сердечно-сосудистой системы, лидирующих в качестве причин смертности уже на протяжении полувека, так и исчерпанием возможностей улучшения этого показателя с помощью современных методов лекарственной терапии, эндоваскулярных и хирургических методов. Известно, что сердце новорожденных млекопитающих (грызунов) в первую неделю после рождения обладает высоким регенеративным потенциалом и полностью восстанавливается после экспериментального инфаркта [1]. Однако по мере взросления этот потенциал значительно снижается и сохраняется лишь для обновления клеток сердца в течение жизни или его крайне ограниченной регенерации при небольших повреждениях. Ведущую роль в регуляции регенеративных процессов в сердце занимают межклеточные взаимодействия, которые необходимы для нормального функционирования клеток и координации их действий в составе миокарда. Сигнальный путь Notch является одним из наиболее широко используемых природой механизмов, который контролирует межклеточные взаимодействия и определяет направление развития и дифференцировки клеток, в том числе стволовых, в онтогенезе [2]. Система Notch играет роль некоего «переключателя», который на стадии примитивного сердца определяет направление развития клеток путем уточнения и усиления функциональных различий между ними. Под контролем этой системы идет образование атриовентрикулярного канала - границы между будущими предсердиями и желудочками, формирование уплотнений эндокарда, которые являются основой для построения клапанов (трикуспидального, митрального, аортального и клапана легочной артерии) и развития трабекулярного слоя миокарда [3]. При этом мутации генов системы Notch способствуют развитию многих врожденных заболеваний сердца, включая дилатационную кардиомиопатию, синдром Алажилля, стенозирование легочной артерии, недостаточность аортального клапана, тетраду Фалло и др. [4]. Учитывая важное значения Notch-сигналинга в эмбриогенезе, мы предположили, что этот сигнальный путь может реактивироваться при повреждении и регулировать регенеративные процессы на клеточном и субклеточном уровнях. Данный обзор направлен на обобщение и анализ научных данных об участии сигнального пути Notch в модуляции активности основных механизмов восстановления/регенерации миокарда (активации резидентных стволовых клеток костного мозга и сердца, воспалительной реакции, пролиферации кардиомиоцитов, ангио- и васкулогенеза), что может быть потенциально использовано с целью разработки инструментов для специфического воздействия. Лиганды и рецепторы системы Notch В клетках млекопитающих обнаружено четыре разных типа рецепторов Notch (Notch1, Notch2, Notch3, Notch4 [5-8]) и пять лигандов семейств Delta like и Jagged (Dll1 [9], Dll3 [10], Dll4 [11], Jagged1 [12] и Jagged2 [13]). Кроме того, описан ряд нетипичных лигандов - DNER, F3/Contactin и NB-3 [14]. Все рецепторы Notch имеют сходное строение и относятся к трансмембранным белкам I типа. Они синтезируются в эндоплазматическом ретикулуме, где EGF-подобные повторы внеклеточного домена подвергаются О-гликозилированию гликозилтрансферазой Rumi, О-фукозилированию и далее по остаткам фукозы, при участии гликозилтрансферазы Fringe могут присоединять N-ацетилглюкозамин. Эти модификации необходимы для регуляции активности рецептора [15]. Cинтезированный de novo рецептор Notch подвергается процессингу в аппарате Гольджи. В результате протеолитического расщепления фуриноподобной конвертазой образуется гетеродимер, состоящий из нековалентно связанных полипептидных фрагментов, которые транспортируются на клеточную поверхность. В его состав входит внеклеточный домен (NECD), состоящий из 29-36 EGF-подобных повторов, ответственных за связывание с лигандом, трех Lin-12-NOTCH (LNR) повторов и гидрофобного участка, опосредующего гетеродимеризацию рецептора. Короткий трансмембранный домен содержит сайт, служащий субстратом протеолитического расщепления γ-секретазой. Внутриклеточный домен (NICD) содержит RAM-домен [16], семь анкириновых повторов, ответственных за белок-белковые взаимодействия [17], два сигнала ядерной локализации (NLS), область активации транскрипции (TAD; отсутствует в Notch3 и -4) и участок, обогащенный остатками пролина, глутаминовой кислоты, серина, треонина (PEST). PEST расположен на С-конце полипептидной цепи и регулирует протеолитическую деградацию рецептора [18]. Описано пять канонических лигандов рецепторов Notch млекопитающих, которые, так же как и рецепторы, являются трансмембранными белками и содержат тандемные EGF-подобные повторы (от 5 до 16). Они делятся на два класса по принципу наличия обогащенных цистеином (СR) повторов вблизи трансмембранного домена. К первому классу относятся лиганды, лишенные СR-повторов, так называемые Delta-подобные лиганды - DLL1, DLL3 и DLL4, ко второму классу - Serrate (Jagged)-подобных лигандов - относятся Jagged-1 и Jagged-2 [14]. Общей чертой всех канонических лигандов является наличие DSL-домена (Delta/Serrate/LAG-2). Структурно DSL-домен содержит двухцепочечный антипараллельный β-лист и поэтому близок к EGF-подобным доменам, однако обладает уникальной пространственной укладкой дисульфидных связей. Если в EGF-подобном домене цистеиновые остатки соединены в следующем порядке: C1-C3, C2-C4, C5-C6, то в DSL они соединены в последовательности С1-С2, С3-С4, С5-С6 [19]. DSL-домен важен для взаимодействия с рецептором; кроме того, показано, что вспомогательную роль в связывании с рецептором играет консервативный мотив DOS (Delta/OSM-11-подобный домен). Этот мотив был идентифицирован внутри первых двух EGF-подобных повторов после DSL [14]. В то же время известно, что DLL3 и DLL4 не содержат DOS-мотив; это позволяет предположить, что для полноценной активации сигнального пути Notch для этих лигандов необходимо взаимодействие с DOS-содержащими неканоническими лигандами [20]. На сегодняшний день описано множество неканонических лигандов. Условно их можно разделить на трансмембранные (DLK-1, DLK-2, DNER), лиганды с GPI-якорем (F3/contactin1 и NB-3/contactin6) и белки внеклеточного матрикса [MAGP-1, MAGP-2, CCN3/NOV, EGFL7, тромбоспондин 2 (TSP2), а также YB-1]. Учитывая тот факт, что многие из неканонических лигандов имеют отношение к белкам внеклеточного матрикса (ВКМ), B. LaFoya и соавт. предположили, что ВКМ регулирует Notch-сигналинг на нескольких уровнях, включая прямое взаимодействие между ВКМ и Notch-рецепторами/лигандами и транскрипционный контроль Notch-рецепторов/лигандов через активацию матриксом других сигнальных путей, в частности, интегринов и рилина [21]. Одной из принципиальных особенностей сигнального пути Notch является то, что большинство лигандов могут взаимодействовать с рецепторами в цис- и транс-положениях, когда лиганд и рецептор расположены на одной или разных клетках, соответственно. Цис-взаимодействие является ингибирующим и делает рецептор невосприимчивым к активирующим транс-взаимодействиям. [22]. D. Sprinzak и соавт. выявили различие между сигналингом от Notch-рецептора при транс- и цис-взаимодействии с лигандом Delta. Реакция на транс-Delta градуирована, а реакция на цис-Delta демонстрирует резкий ответ по типу «выключателя» при достижении фиксированного порога, независимо от транс-Delta [23]. Цис-взаимодействие создает чувствительный переключатель между взаимоисключающими сигнальными состояниями: состояние «отправки сигнала» - больше лиганда, чем рецептора, и «принимающим» состоянием - больше рецептора. Таким образом, динамическая конкуренция между цис- и транс-взаимодействиями может обусловливать решение, какая из двух клеток станет отправляющей сигнал, а какая - принимающей [22]. Ранее эту асимметрию объясняли исключительно механизмом обратной связи, посредством которого активация Notch подавляет экспрессию лиганда на уровне транскрипции [14]. Интересно отметить, что некоторые неканонические лиганды Notch, такие как, например, MAGP-1, MAGP-2, CCN3/NOV, YB-1, являются цис-активаторами [14]. Другим принципиальным отличием сигнального пути Notch от большинства других путей является отсутствие амплификации сигнала, поскольку одна молекула лиганда связывается с одной молекулой рецептора, которая сразу после связывания с лигандом разрушается [24]. Активация сигнального пути Notch Ключевым моментом в активации Notch является связывание рецептора на поверхности клетки с лигандом, которое вызывает два последовательных протеолитических расщепления (см. рисунок на цветной вклейке). Первый процессинг рецептора осуществляется во внеклеточном домене металлопротеиназами TACE и ADAM 10 [25, 26]. Непосредственно после внеклеточного протеолиза следует ферментативное расщепление трансмембранного домена рецептора Notch с помощью γ-секретазы [27], приводящее к высвобождению цитоплазматического домена активированного рецептора (NICD). NICD быстро транспортируется в ядро, где с помощью домена RAM взаимодействует с транскрипционным комплексом CSL. Взаимодействие NICD с CSL вызывает изменение его свойств, превращая его из транскрипционного супрессора в транскрипционный активатор. Происходит изменение конформации комплекса CSL, привлечение транскрипционных белков-коактиваторов MAM-L (Mastermind-like) [28] и гистоновых ацетилтрансфераз (CBP/p300) [29], в результате чего активируется экспрессия эффекторных генов семейства HES и родственных ему HERP/Hey/HRT [30]. Помимо вышеописанного классического пути передачи информации от рецептора Notch существуют альтернативные пути реализации сигнала [31]. Так, например, Delta-3-лиганд (DLL3) не может индуцировать классический путь сигнализации от Notch1-рецептора [32], что делает ее уникальной среди семейства лигандов Delta like. DLL3 способен взаимодействовать с рецептором Notch1 только при условии, когда оба белка экспрессируются в одной и той же клетке, что ведет к ингибированию сигнализации и деградации рецептора [32]. В работе профессора S.F. Lee и соавт. было показано, что Mn-зависимая митохондриальная пептидаза (MIPEP), регулирующая импорт белков гомеостаза железа в митохондрии, способна селективно осуществлять протеолиз белка NICD, влияя на его активности и, как следствие, на жизнеспособность клеток [33]. Описан также неканонический сигнальный путь Notch, в регуляции которого важную роль играет эндоцитоз. Примечательно, что эндоцитарный перенос связан не только с лиганд-зависимой сигнализацией: в эндоцитарных компартментах рецептор может при определенных обстоятельствах активироваться лиганд-независимым образом [15]. Неканонический путь не зависит от CSL, вместо этого взаимодействует с сигнальными путями, опосредуемыми PI3K, mTORC2, Akt, Wnt, NF-κB, YY1 или HIF-1α на цитоплазматическом или ядерном уровне [34]. Сигнальный путь Notch в мобилизации стволовых и прогениторных клеток костного мозга Одним из важных этапов восстановительных процессов, возникающих при остром повреждении (инфаркте миокарда - ИМ), является направленная миграция стволовых/прогениторных клеток костного мозга в зону повреждения. В основе «хоуминга» лежит мобилизация стволовых клеток, которая осуществляется в результате активации поверхностных клеточных рецепторов стимулами из поврежденной ткани - цитокинами, хемокинами и факторами роста, секретируемыми ее клетками [35]. Сигнальный путь Notch вовлечен в регуляцию миграции стволовых/прогениторных клеток из костного мозга. Известно, что экспрессия рецептора Notch1 резко возрастает и в костном мозге, и в миокарде после острого ишемического повреждения. Для изучения роли Notch-сигналинга в мобилизации клеток костного мозга в поврежденный миокард ученые использовали гетерозиготных мышей, нокаутированных по гену Notch1 [36] (Notch1+/- мыши), поскольку гомозиготные мыши с нокаутом по гену Notch1 погибают в процессе эмбрионального развития [11, 37]. При моделировании ИМ было установлено, что, несмотря на сходные показатели выживаемости, у Notch1+/- мышей размер постинфарктного рубца был значительно больше, а показатели сократительной способности миокарда хуже по сравнению с животными дикого типа. Трансплантация клеток костного мозга от Notch1+/- животных мышам дикого типа (WT-мыши) существенно снижала функциональные показатели сократимости и неоваскуляризацию миокарда после повреждения [38]. Напротив, трансплантация клеток костного мозга от WT-мышей в организм Notch1+/- мышей способствовала уменьшению повреждения миокарда. Для исследования роли Notch1 в хоуминге клеток костного мозга и их участия в репаративных процессах в поврежденном миокарде были использованы клетки от WT и Notch1+/- мышей, меченные зеленым флюоресцентным белком (GFP+), которые трансплантировали WT-мышам. Установлено, что после трансплантации GFP+ клеток от Notch+/- мышей их количество в периинфарктной зоне было значительно меньше, чем при трансплантации GFP+ клеток от WT-мышей. Более того, трансплантированные GFP+ клетки от WT-мышей обладали большей способностью к пролиферации и сниженным уровнем апоптоза in vivo в сравнении с GFP+ клетками от Notch1+/- мышей. Иммунотипирование выделенных из миокарда GFP+ клеток позволило установить, что основной популяцией клеток костного мозга, мигрирующих и интегрирующихся в миокард после повреждения, являются CD105(+)Sca1(+)CD34(-) CD45(-)c-kit(-)CD4(-) мезенхимальные стволовые клетки (МСК) [39]. Влияние сигнального пути Notch на функции МСК было подтверждено в нескольких исследованиях. Гиперактивация Notch в МСК, трансплантированных в поврежденный миокард, повышала их регенеративные свойства, а подавление Notch1 оказывало противоположные эффекты [40]. Наиболее вероятным механизмом индукции хоуминга МСК костного мозга при участии Notch1 является активация SDF-1/CXCR4- и G-CSF/CSF3R-сигнальных путей [40, 41]. Однако на этот счет существуют довольно противоречивые данные: в одной работе активация рецептора Notch1 сопровождалась повышением экспрессии CXCR4 в клетках костного мозга [42], в другой были получены противоположные результаты: повышение экспрессии CXCR4 вызвалось подавлением сигнального пути Notch [43]. Другим возможным механизмом действия МСК костного мозга может быть предотвращение массивной гибели кардиомиоцитов после ИМ [44, 45]. Эксперименты in vitro показали, что МСК костного мозга, экспрессирующие лиганд Jagged1 на поверхности, способны активировать деление и выживаемость неонатальных кардиомиоцитов за счет активации Notch1/Jagged1-сигналинга и паракринных механизмов [46]. Имеющиеся данные, несомненно, указывают на важную роль сигнального пути Notch в восстановлении сердечной мышцы после повреждения за счет регуляции хоуминга МСК костного мозга, хотя детальный механизм этой регуляции, в частности, связь с системой SDF-CXCR4, нуждается в дальнейшем изучении. Notch-сигналинг в регуляции воспалительного ответа Воспаление миокарда в ответ на повреждение является важнейшим элементом процесса репарации сердца после повреждения. Предполагается, что система Notch участвует в регуляции иммунного ответа клеток воспаления и резорбции дебриса в зоне некроза. В основе этого механизма лежит способность Notch-сигналинга контролировать активацию и дифференцировку клеток иммунной системы. Многочисленные исследования подтверждают участие Notch в гомеостазе T-лимфоцитов (CD4+, CD8+), В-лимфоцитов, естественных киллеров (NK cells) и дендритных клеток [47, 48]. Блокада Notch-сигналинга с помощью ингибитора γ-секретазы оказывает иммуносупрессивное действие, проявляющееся уменьшением инфильтрации поврежденных тканей Т-лимфоцитами и их пролиферативной способности [49]. Другой мишенью действия системы Notch являются макрофаги, формирующие центральное звено иммунного ответа. После ИМ моноциты аккумулируются в зоне повреждения, где трансформируются в поляризованные макрофаги М1- и М2-типов. Макрофаги М1 активируются под действием интерферона-γ (ИФН-γ), фактора некроза опухолей α (ФНО-α), и бактериальных липополисахаридов (LPS) [50-52] и продуцируют большое количество активных провоспалительных цитокинов: интерлейкина 6 (ИЛ-6), ФНО-α, ИЛ-12, ИЛ-1, воспалительного белка макрофагов 1α (MIP-1α) и активных форм кислорода. Хотя M1-макрофаги необходимы для нормальных механизмов защиты ткани во время острого повреждения, их способность усиливать воспалительные реакции может усугублять течение патологического процесса. М2-макрофаги, активирующиеся ИЛ-4 и ИЛ-13, являются противовоспалительными и способствуют процессу ранозаживления и репарации, в том числе за счет секреции ИЛ-10, ИЛ-1 и аргиназы-1 [51, 53, 54]. Показано, что ко-культивирование макрофагов с DLL1+ МСК линии OP9 и стимуляция LPS вызывает активацию Notch-сигналинга и формирование М1-фенотипа, в то время как блокада передачи сигналов Notch (с помощью ингибитора γ-секретазы) способствует M2-поляризации даже в присутствии таких индукторов М1-фенотипа, как LPS и ФНО-α, что указывает на модулирующую роль Notch-сигналинга в поляризации макрофагов [55]. Недавно установлено, что воспалительный ответ распространяется и усиливается посредством активации Notch1-рецептора в макрофагах, что способствует их поляризации в M1-фенотип [56]. Так при культивировании в воспалительных условиях на поверхности моноцитарных клеток линии ТНР-1 повышается экспрессия Notch1-рецептора, они преимущественно дифференцируются в направлении M1-макрофагов. Добавление ингибитора Notch-сигналинга (DAPT) снижало способность макрофагов к формированию M1-фенотипа и экспрессию Notch1-рецептора на поверхности макрофагов. В целом, представленные данные указывают, что Notch-сигналинг может служить регулятором воспалительного ответа в зоне повреждения, преимущественно за счет модуляции М1/М2-фенотипа клеток моноцитарно-макрофагального ряда. Роль Notch-сигналинга в защите кардиомиоцитов от ишемического повреждения Исследования последних лет показывают, что во взрослом сердце присутствует небольшой пул кардиомиоцитов, способных вступать в клеточный цикл, что обеспечивает постоянное обновление кардиомиоцитов в течение жизни и крайне ограниченную регенерацию миокарда после повреждения [57]. Оказалось, что дедифференцировка и вступление в клеточный цикл зрелых кардиомиоцитов возникают исключительно в условиях выраженной активации сигнального пути Notch, а при наступлении терминальной дифференцировки его активность резко снижается [58]. При этом амплитуда и длительность Notch-сигнализации напрямую зависят от ацетилирования эффекторного домена рецептора - NiCD [59]. Обнаружено, что внутриклеточный домен Notch1 ацетилирован в неонатальных кардиомиоцитах крысы, что значительно повышает его стабильность, транскрипционную активность и способствует пролиферации этого типа клеток. По мере культивирования in vitro активность Notch падает, что совпадает с остановкой деления кардиомиоцитов. Показано, что реактивация этого сигнального пути может происходить во взрослом сердце при повреждении, и эта система обеспечивает защиту кардиомиоцитов от ишемического повреждения путем регуляции Akt-mTOR-Stat3 сигнального каскада [60, 61], а также ограничивает развитие их гипертрофии [62, 63]. Реактивация Notch-сигналинга при ишемическом повреждении может регулироваться гипоксией, которая усиливает передачу сигналов Notch от соседних клеток путем индукции экспрессии в них лигандов Notch [64, 65] и/или активации транскрипции соответствующих генов-мишеней [66]. Биохимический механизм, с помощью которого гипоксия активирует путь передачи сигналов Notch, включает взаимодействие HIF1-α с цитоплазматическим доменом Notch-рецептора (NICD), приводящее к его стабилизации, и их совместное (NICD и HIF1-α) взаимодействие с промотерными областями генов-эффекторов [66]. Сигнальная система Notch выступает в качестве регулятора уровня оксидативного стресса в различных тканях [67, 68]. Окислительный стресс в тканях лежит в основе многих патологических процессов, таких как ишемическое/реперфузионное повреждение сердца, воспаление, хроническая сердечная недостаточность и др. Было обнаружено, что подавление Notch1-рецептора (интрамиокардиальные инъекции Notch1 siRNA) при моделировании ишемии/реперфузии вызывает развитие тяжелого реперфузионного синдрома, проявляющееся усилением повреждения миокарда после возобновления кровотока по коронарным сосудам [69]. В основе этого процесса лежит увеличение экспрессии индуцибельной NO-синтазы (iNOS) и gp(91phox), повышение образования метаболитов NO и супероксида, а также высокотоксичного пероксинитрита, которые контролируются сигналами Notch. Наряду с гипоксией активацию Notch может вызывать фактор роста гепатоцитов (HGF), уровень которого повышен в крови и тканях пациентов с острым ИМ и страдающих постинфарктной хронической сердечной недостаточностью и метаболическими расстройствами [70, 71]. Увеличение продукции HGF в зоне повреждения миокарда и его взаимодействие с рецептором с-Met, экспрессированным на поверхности кардиомиоцитов, приводят к активации Notch1 и увеличению фосфорилирования белка Akt, что подавляет апоптоз кардиомицитов [62, 72]. Эти результаты подтвердились и при гиперэкспрессии N1CD в мышиных кардиомицитах, которая способствовала их вступлению в клеточный цикл и подавлению апоптоза in vivo после индукции инфаркта миокарда [63]. При гемодинамической перегрузке сердца (экспериментальная модель почечной гипертензии «One kidney - one clip») подавление Notch-сигналинга способствовало повышению уровня апоптоза кардиомиоцитов [67]. Кроме того, в кардиомиоцитах, культивированных в условиях гипоксии, активация Notch1 индуцировала экспрессию антиапоптотических генов [68], а ингибирование Notch-сигналинга вызывало повышение их апоптоза [67]. В первую неделю после ИМ в кардиомиоцитах периинфарктной области детектируется экспрессия NICD, свидетельствующая об активации Notch-сигналинга, которая сопряжена с кратковременной активацией пролиферации, о чем свидетельствует появление Ki67-положительных кардиомиоцитов. Однако количество кардиомиоцитов, окрашивающихся на маркер митоза фосфо-Hist3, было значительно меньше, чем Ki67-положительных кардиомиоцитов. Это свидетельствует о том, что активация Notch вызывает неполную прогрессию клеточного цикла, приводящую к его остановке в G2/M-фазе [73]. Возможно, активация Notch-сигналинга носит кратковременный характер, необходимый для поддержания выживаемости кардиомиоцитов, но недостаточный для их вступления в полноценный клеточный цикл. Notch-сигналинг в регуляции функций резидентных прогениторных клеток сердца Помимо ограниченной пролиферативной способности новые кардиомиоциты в поврежденном сердце могут образовываться путем дифференцировки резидентных прогениторных клеток сердца (ПКС), которые были впервые выделены из сердца крысы группой американских ученых под руководством профессора P. Anversa [74]. Эти клетки, характеризующиеся экспрессией рецептора c-kit к фактору стволовых клеток, экспрессией транскрипционного фактора MEF2C и отсутствием экспрессии гематопоэтических маркеров, были способны к самообновлению, образованию клонов из одной клетки и дифференцировке в эндотелиальные, гладкомышечные клетки и кардиомиоциты in vitro и in vivo [74-77]. Позднее такие же клетки обнаружили в миокарде мыши [78, 79], собаки [80], свиньи [81] и человека [82, 83]. В многочисленных исследованиях, проведенных на животных с экспериментальными моделями ИМ и постинфарктной сердечной недостаточности, были получены убедительные доказательства участия ПКС в регенерации миокарда путем образования новых кардиомиоцитов и клеток сосудов и поддержании сократительной функции сердца [74, 83-85]. При исследовании роли сигнального пути Notch в регуляции функции ПКС было показано, что в миокарде животных на поверхности ПКС присутствует преимущественно рецептор Notch 1-го типа [58, 86]. Активация этого сигнального пути происходит при взаимодействии Notch1+ ПКС с кардиомиоцитами, экспрессирующими лиганд Jagged1, что вызывает повышение пролиферации ПКС и индуцирует в них экспрессию Nkx2.5 - транскрипционного фактора, регулирующего дифференцировку в кардиомиоцитарном направлении [87]. Установлено, что усиление экспрессии Nkx2.5 происходит в результате взаимодействия с его промотерной областью комплекса NiCD/RBPJK. При подавлении Notch-сигналинга в неонатальном сердце мыши ингибиторами γ-секретазы происходит резкое снижение количества ПКС, подавление пролиферации и окончательной дифференцировки новообразованных кардиомиоцитов, что неминуемо приводит к развитию тяжелой дилатационной кардиомиопатии [58]. Кроме того, нарушение процессов образования новых кардиомиоцитов в результате подавления Notch-сигналинга сочетается с прогрессированием гипертрофии кардиомиоцитов, что ведет к структурным нарушениям анатомии формирующегося сердца неонатальных мышей. Подавление кардиомиогенеза после внутривенного введения ингибиторов γ-секретазы было получено и на модели экспериментального ИМ у взрослых мышей [87]. Таким образом, сигнальный путь Notch участвует в регуляции как пролиферации, так и дифференцировки ПКС [86]. Вероятно, такая форма регуляции важна не только для поддержания клеточного гомеостаза, но и для репарации при патологических состояниях. Notch-сигналинг в регуляции васкулогенеза Неоваскулогенез - процесс образования кровеносных сосудов de novo, является обязательным этапов восстановления сердца после повреждения. Ведущую роль в неоваскулогенезе играют прогениторные эндотелиальные клетки (ПЭК) периферической крови и костного мозга, которые мигрируют под действием цитокинов, продуцируемых в зоне ишемии. Приходя по механизму хоуминга в ишемизированную ткань, ПЭК включаются в образующиеся по механизму ангиогенеза новые сосудистые отростки, способствуя неоваскуляризации ткани и уменьшению ишемии. Считается, что, так же как в эмбриогенезе, ПЭК, приходя в ткань, могут формировать скопления, которые в дальнейшем становятся основой для образования примитивной сосудистой сети. Многие ученые сходятся во мнении, что сигнальный путь Notch тесно связан с другими сигнальными путями (VEGF, PDGF, Wnt и др.), участвующими в построении сосудистой сети после ишемического повреждения [88-90]. На поверхности эндотелиальных клеток постоянно экспрессируются рецепторы (Notch1, Notch4) и лиганды (Jagged1, DLL4) системы Notch [91]. В раннем эмбриогенезе передача сигналов Notch модулирует миграцию ангиобластов от латеральной мезодермы в направлении дорсальной аорты, вызывая образование первичных клеточных кластеров - будущих зачатков кровеносных сосудов. На более поздних стадиях передача сигналов Notch определяет эндотелиальную спецификацию первичных ангиобластов и формирование коронарных артерий [92, 93]. Показано, что передача сигналов Notch путем взаимодействия с лигандом Jagged1 в костном мозге является необходимым условием для развития и дифференцировки ПЭК [94]. Инактивация Jagged1 приводит к подавлению Notch-сигналинга и торможению постнатального васкулогенеза в связи с нарушением пролиферации, выживания, дифференциации и мобилизации из костного мозга ПЭК. ПЭК костного мозга Jagged1-/- мышей демонстрировали сниженную способность к неоваскуляризации в сравнении с ПЭК мышей дикого типа [94]. Одним из возможных механизмов, с помощью которых Notch регулирует функции ПЭК, является регуляция экспрессии рецептора CXCR4, который определяет способность к мобилизации этих клеток в зону ишемического повреждения [95]. В то же время есть работы, показывающие, что влияние Notch-сигналинга на функции ПЭК in vivo, скорее всего, опосредуется через регуляцию их паракринной активности, а не процессов миграции и дифференцировки в эндотелиальные клетки [96]. Notch-сигналинг в регуляции ангиогенеза Другим механизмом повышения васкуляризации поврежденного миокарда является ангиогенез - активация роста и ветвления ранее сформированных сосудов. В этом процессе Notch инициирует появление и стабилизацию новых сосудистых отростков из предсуществующих сосудов. Формирование новых сосудистых отростков определяется скоординированной работой клеток сосуда: происходит частичная «разборка» стенки, часть клеток эндотелия начинают мигрировать в окружающую ткань и формировать первичные капилляроподобные структуры, в то время как другие сохраняют свое расположение. Оказалось, что выбор направления роста первичной трубчатой структуры из инициирующих эндотелиальных клеток (tip cells) определяется не только градиентом VEGF A [96, 97], но и взаимодействием между рецепторами Notch и лигандами на поверхности эндотелиальных клеток [92, 98]. Так, например, формирование комплекса Notch1-DLL4 подавляет ветвление сосудов за счет уменьшения чувствительности к VEGF и снижения экспрессии рецепторов его рецепторов, а Jagged1 - оказывает противоположные эффекты. Подавление Notch-сигналинга путем обработки ингибитором γ-секретазы или делецией гена DLL4 вызывали образование множества tip cells в разных участках сосуда и формированию избыточного количества сосудистых ответвлений [96, 99-101]. Эти эффекты были связаны с регуляцией активности MAPK/PI3K/Akt сигнального пути под действием системы Notch [102]. Кроме того, регуляция ангиогенеза может осуществляться за счет кумулятивного эффекта Notch и других сигнальных систем, таких как uPA/uPAR, Wnt, Sonic Hedgehog и др. [88-90]. Например, подавление Notch1-рецептора вызывает значительное снижение экспрессии урокиназы и урокиназного рецептора [103], которые играют ключевую роль в формировании сосудов при ишемии и воспалении [104], регулируя направленную миграцию клеток сосудистой стенки, моноцитов/макрофагов и ЭПК [105, 106]. Запускаемый урокиназой каскад протеолитических реакций, включающих локальное образование плазмина и активацию матриксных металлопротеиназ, способствует разрушению внеклеточного матрикса на пути формирования новых сосудистых отростков, активацию факторов роста (VEGF и про-HGF) и высвобождение факторов роста, секвестрированных в матриксе (bFGF, IGF и TGF-β) [107, 108]. Notch-сигналинг в формировании рубцовой ткани Постинфарктные изменения сердца принято обозначать термином «ремоделирование», которое представляет собой совокупность его структурных и геометрических изменений, ассоциированных с воспалительной реакцией и последующим образованием соединительнотканного рубца на месте гибели кардиомиоцитов. Степень ремоделирования сердца считается основным фактором, определяющим развитие постинфарктной сердечной недостаточности. Замещение погибших кардиомиоцитов фиброзной тканью является обязательным этапом репарации миокарда, способствующим сохранению его структурной целостности и предотвращению разрывов. Однако постинфарктный фиброз не только оказывает негативное воздействие на процессы сокращения/расслабления миокарда, но и нарушает проведение электрических импульсов, что неизбежно приводит к нарушению функциональных показателей работы сердца. Недавние исследования показали, что Notch-сигналинг участвует в формировании и прогрессировании фиброза путем активации транскрипции гладкомышечного альфа-актина (α-SMA) и дифференцировки фибробластов в миофибробласты через TGF-β-Smad3 сигнальный каскад [109]. Подавление Notch-сигналинга [110] с помощью ингибитора γ-секретазы уменьшало продукцию профибротических факторов, таких как ИЛ-4, ИЛ-6, трансформирующего фактора роста бета (ТФР-β), фактора роста соединительной ткани (CTGF) и ИФН-γ, а также снижало количество миофибробластов и площадь постинфарктного фиброза [3]. Перспективы разработки лекарственных препаратов, оказывающих воздействие на сигнальный путь Notch В соответствии с вышеизложенным, сигнальный путь Notch участвует в регуляции основных звеньев репаративного процесса в миокарде. Активация этого сигнального пути способствует инициации кардиопротективной программы защиты сердца при многих патологических состояниях, включая алкогольную кардиомиопатию [111], ИМ [112], гипертрофию [40] и повреждения в результате ишемии-реперфузии [69]. Такие многообещающие результаты явились стимулом для разработки способов активации и контроля Notch-сигнализации in vitro и in vivo. Среди основных направлений исследований в этой области можно выделить активацию сигнального пути Notch с помощью рекомбинантных лигандов, действия специфических активирующих антител, воздействия на внутриклеточные сигнальные механизмы, а также применение методов генной инженерии. Ярким примером успешного использования такого научного подхода является применение рекомбинантных лигандов системы Notch для контроля развития фиброза миокарда, который определяет прогноз у пациентов с различными заболеваниями сердца. Хорошо известно, что появление миофибробластов и ранняя активация профибротических сигнальных путей происходят на самых ранних этапах, еще до наступления выраженного ремоделирования левого желудочка и до появления клинических признаков сердечной недостаточности. В этой ситуации неканонический лиганд Dlk1 демонстрирует подавление дифференцировки сердечных фибробластов в направлении миофибробластов и миокардиального фиброза через miR-370/TGFb-R2 сигнальный механизм [113]. Аналогичные результаты были получены после интрамиокардиального введения Jagged1+ гидрогеля, активирующего Notch-сигналинг в клетках миокарда [114]. У таких животных после ИМ наблюдалось значительное уменьшение размеров рубцовой ткани, активация ее васкуляризации за счет пролиферации зрелых эндотелиальных клеток и клеток-предшественников и улучшение систолической функции левого желудочка. Другим важным направлением исследований в этой области является таргетное воздействие на пул резидентных ПКС, которые участвуют в поддержании клеточного гомеостаза сердца в норме и при повреждении [76]. В наших исследованиях [86] и работах других научных групп [115, 116] было показано, что активация сигнального пути Notch за счет гиперэкспресии NiCD в ПКС способно индуцировать их дифференцировку в васкулогенном направлении, что является важным этапом для предтрансплантационной подготовки клеток, повышения их терапевтического потенциала и васкуляризации миокарда в целом. Дополнительным инструментом для модуляции активности сигнального пути Notch могут служить моноклональные антитела, которые при связывании с рецептором вызывают его активацию [117]. Ряд зарубежных компаний (OncoMed Pharmaceuticals Inc., Regeneron Pharmaceuticals Inc.) имеют в своем арсенале моноклональные антитела к рецепторам и лигандам системы Notch, которые могут быть потенциально использованы для лечения ишемии миокарда. Определенный интерес вызывает воздействие на сигнальный каскад, запускаемый при активации рецептора Notch. Продемонстрировано, что Gremlin2, который относится к семейству лигандов ТФР-β и является антагонистом костных морфогенных белков (BMP), способен активировать сигнальный путь Jagged1-Notch1, регулируя баланс внутриклеточных регуляторных белков Smad1/5 и Smad2/3, тем самым инициируя дифференцировку ПКС [118]. При разработке средств потенциального воздействия на сигнальный путь Notch нельзя не отметить революционные возможности систем CRSPR-Cas, применяемых для редактирования генома. В целом, большинство врожденных патологий сердца сопряжены с мутациями в генах, кодирующих компоненты сигнального пути Notch [119], которые потенциально могут быть устранены при помощи этой системы. Стратегия работы CRSPR-технологии заключается в осуществлении двухцепочечного разрыва в определенном участке ДНК, детерминированного последовательностью спейсера sgРНК. Для исправления «нарушенного» гена в клетку вносят молекулу ДНК с правильной последовательностью и фланкирующими участками, соответствующими последовательностям ДНК, окружающим место разрыва. Эта молекула ДНК служит матрицей для репарации по механизму гомологичной рекомбинации. Такие уникальные возможности систем CRSPR-Cas в ближайшем будущем могут привести к созданию новых методов терапии наследственных заболеваний сердца, связанных с мутациями в генах системы Notch (синдромы Алажиля, Хайду-Чейни, Адамса-Оливера и др.). Несмотря на то что большинство этих работ выполнено на животных, они позволяют осознать огромные возможности, которые заключены в воздействиях на систему Notch, и могут быть основой для создания перспективных лекарственных средств для лечения кардиологических заболеваний. Заключение Сигнальный путь Notch является важнейшей системой, регулирующей процессы обновления и репарации/регенерации сердца. Его активация после ИМ способствует уменьшению апоптоза кардиомиоцитов, улучшает систолическую функцию сердца, активирует резидентные прогениторные клетки сердца и способствует его неоваскуляризации. Эти эффекты создают основу развития новой парадигмы регенерации миокарда, которая охватывает не только широкий круг взаимодействий основных типов клеток миокарда (кардиомиоцитов, клеток воспаления, стромальных клеток, ПКС и клеток костного мозга), но и регуляцию их миграции, пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Принимая во внимание имеющиеся сегодня данные о роли сигнального пути Notch в регуляции восстановительных процессов в сердце, можно утверждать, что модуляция активности этого сигнального пути может служить «ключом» к активации эндогенного регенеративного потенциала сердца. Однако не стоит забывать, что вмешательство в механизмы межклеточной сигнализации, которые специфичны для каждого типа ткани, требует особой осторожности. Активация сигнального пути Notch сопряжена с изменением активности ключевых регуляторов деления и клеточной гибели (Akt, p53, mTOR, NF-kB и др.) и может быть связана с прогрессированием и распространением злокачественных новообразований, таких как рак шейки матки, молочной железы, яичников, аденокарциномы простаты, немелкоклеточного рака легкого и многих других. При разработке терапевтических средств для «управления» сигналами Notch необходимо делать акцент на сугубо таргетное воздействие, направленное не только на конкретную ткань, в данном случае на миокард, но и на определенный тип клеток этой ткани, так как одинаковое воздействие на кардиомиоциты и фибробласты может иметь различные последствия для всего процесса репарации. Учитывая огромное количество точек приложения данного сигнального пути, переход к клиническим испытаниям направленных на него лекарственных средств диктует необходимость еще более углубленного изучения каждого из звеньев Notch-сигнализации и их влияния на организм в целом. Финансовая поддержка. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ №17-15-01368 и гранта РФФИ 18-015-00438 (регуляция эпителиально-мезенхимального перехода и фиброза). Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

K V Dergilev

National Medical Research Center for Cardiology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: doctorkote@gmail.com
Moscow, Russia

E S Zubkova

National Medical Research Center for Cardiology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Moscow, Russia

I B Beloglazova

National Medical Research Center for Cardiology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Moscow, Russia

M Yu Menshikov

National Medical Research Center for Cardiology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Moscow, Russia

E V Parfyonova

National Medical Research Center for Cardiology of the Ministry of Health of the Russian Federation; M.V. Lomonosov Moscow State Universit

Moscow, Russia

References

Supplementary files