Biomarkers of inflammatory bowel disease activity

Full Text

Α1-АТ - α1-антитрипсин БК - болезнь Крона ВЗК - воспалительные заболевания кишечника ИФА - иммуноферментный анализ КИС - колоноилеоскопия КП - кальпротектин ЛФ - лактоферрин НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты ПК-М2 - пируваткиназа типа М2 СОК - слизистая оболочка кишечника СРК - синдром раздраженного кишечника ФКП - фекальный кальпротектин ЯК - язвенный колит Степень активности и глубину ремиссии язвенного колита (ЯК) и болезни Крона (БК) обычно оценивают с помощью колоноилеоскопии (КИС) и лестничной биопсии слизистой оболочки кишки (СОК). К перспективным методам скрининга и контроля активности воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) относятся неинвазивные способы, основанные на определении в кале кальпротектина (КП), лактоферрина, кальгранулина С, лейкоцитов, меченных изотопом индия 111In, и пируват киназы типа М2 (ПК-М2). При ВЗК повышается проницаемость СОК и происходит потеря белков в просвет желудочно-кишечного тракта. Предложено оценивать активность воспаления по величине теряемого с калом белка [1-3]. В качестве маркера активности воспаления используют белок острой фазы α1-антитрипсин (α1-АТ). Он относится к группе протеазных ингибиторов, инактивирующих продукты фагоцитарных клеток, участвует в связывании коллагеназы, эластазы и позволяет выявлять энтеропатию, связанную с потерей белка [4, 5]. По количеству α1-АТ в кале можно подсчитать количество теряемого белка при ВЗК [5]. Уровень фекального α1-АТ тесно коррелирует с содержанием альбумина, меченного 51Cr, и с другими лабораторными показателями, являющимися индикаторами активности БК [6]. В начале 1980-х годов предложено определять в кале лейкоциты, меченные изотопом индия - 111In, в качестве контроля активности воспаления в кишечнике [2, 3]. Однако высокая стоимость исследования и радиоактивное влияние на пациента ограничивают использование этих методик сугубо научными целями. Кальпротектин. Основной проблемой, сдерживающей развитие концепции диагностики ВЗК с помощью фекальных маркеров, являлась их неустойчивость вследствие бактериальной деградации при транзите по кишечнику. Одним из весьма устойчивых к воздействию кишечных бактерий является фекальный КП (ФКП) [7]. КП впервые выделен из гранулоцитов и назван L1-белком, но позже переименован в кальпротектин из-за своих антимикробных способностей и связи с кальцием. Этот гетеросложный белок состоит из двух тяжелых звеньев (L-H) и одного легкого звена (L-L), которые соединены нековалентной связью. Высвобождение КП из клетки происходит во время ее гибели. Доказано, что С-терминальная связь L-H-звена идентична N-терминалу пептидов и известна как нейтрофильная иммобилизирующая активность, которая зависит от фосфоризации и способствует накоплению гранулоцитов в зоне воспаления [9]. ФКП - это белок активной фазы воспаления с молекулярной массой 36 кДа, он также называется МRP 8/14 или S100A8/A9 [8] и состоит из двух мономеров - S100A8 и S100А9. Интерес к ФКП как маркеру воспаления, локализованному в кишечнике, возник после того, как стала доказана возможность диагностики ВЗК с помощью абдоминального сканирования лейкоцитов, меченных индием (¹¹¹In) [2, 3]. Эти данные навели на мысль, что миграция гранулоцитов в слизистую оболочку кишечника в условиях воспалительного процесса может проявляться в повышенных уровнях белка этих клеток в каловых массах. Помимо этого, КП может быть обнаружен в плазме, моче, цереброспинальной жидкости, слюне, синовиальной жидкости [8]. Однако относительно высокие уровни КП обнаруживают и в кале здоровых людей - в 6 раз выше уровней плазмы. Это совпадает с данными, предполагающими, что у здоровых людей большинство циркулирующих нейтрофилов мигрирует через мембрану СОК, завершая, таким образом, свое существование [10]. Последующий лизис нейтрофилов в кишечнике и высвобождение клеточного КП создают уровень ФКП у здоровых людей в пределах 50 мкг/г [2]. «Золотым стандартом» в оценке активности ВЗК считается определение экскреции нейтрофилов, меченных изотопом индия 111In, но изотопный метод очень дорог, требует госпитализации пациента и из-за экспозиции радиоактивного вещества противопоказан детям и беременным женщинам. Как и меченные ¹¹¹In лейкоциты, ФКП предложен в качестве неинвазивного теста для дифференциальной диагностики ВЗК и синдрома раздраженного кишечника (СРК) [2, 3]. Таким образом, определение КП дает возможность получить результаты без радиологического и/или эндоскопического исследования, поскольку количество его в кале коррелирует с гистологической и эндоскопической оценкой активности БК и ЯК. ФКП может использоваться и для контроля за эффективностью лечения больных с ВЗК [11]. ФКП равномерно распределяется в кале и стабилен в течение 7 дней при комнатной температуре. Уровень ФКП может изменяться в зависимости от возраста, у новорожденных он более высокий, но к 5 годам снижается и остается на уровне взрослых [5]. Специальной подготовки к исследованию не требуется. Кал (из трех-четырех точек) забирается в одноразовый пластиковый контейнер, закрывается крышкой и транспортируется в лабораторию в этот же день. Его можно хранить в холодильнике при температуре от +4 до +8 ºС до двух дней или при температуре -18-20 ºС (морозильная камера) до 30 дней, что не влияет на результат анализа. Однако нужно учитывать, что при водянистой диарее результаты могут искажаться [5]. Таким образом, простота методики определения ФКП в сравнении с меченными ¹¹¹In лейкоцитами (требуется один образец кала) открывает перспективы использования маркера для диагностики ВЗК. Методы лабораторного исследования ФКП. Все варианты измерения ФКП основаны на иммунохимических методах с использованием поликлональных или моноклональных антител. Методы могут быть разделены на количественные и качественные (положительный или отрицательный результат). Первые методы определения основаны на использовании твердофазного иммуноферментного анализа - ELISA (ИФА) [12]. Недостатком его является то, что для проведения анализа нужно набрать партию из 35-40 образцов. Существует еще метод определения ФКП рефлектометром, обеспечивающем количественное экспресс-определение ФКП. Общая продолжительность теста - 15-20 мин [12]. В настоящее время разрабатываются тест-системы для определения уровня ФКП в домашних условиях. Дифференциальная диагностика ВЗК и СРК Поскольку любой воспалительный процесс в СОК сопровождается повышением уровня ФКП, возникает вопрос - какую концентрацию ФКП можно считать диагностически значимой. Нормальным уровнем ФКП у здоровых людей считается <50 мкг/г [2, 13]. За последние 10 лет проведены многочисленные исследования, демонстрирующие ценность ФКП в дифференциальной диагностике между ВЗК и СРК, данные обобщены в метаанализы. В 2012 г. M. Manz и соавт. на материале 538 пациентов с абдоминальным дискомфортом оценили две различные концентрации ФКП (10 и 50 мкг/г) как предиктора органической патологии желудочно-кишечного тракта. Данные ФКП сопоставлялись с результатами эндоскопического исследования. Оказалось, что среди 359 (67%) пациентов с концентрацией ФКП <50 мкг/г по данным эндоскопического исследования в 84% случаев (n=302) органической патологии не выявлено. Напротив, у пациентов с концентрацией ФКП >50 мкг/г (33%; n=179) в 87% случаев (n=155) зарегистрированы изменения в кишечнике (p<0,05). Чувствительность и специфичность ФКП составили 73 и 93% соответственно [3]. В группе пациентов, у которых исследовалась концентрация ФКП 10 мкг/г, чувствительность и специфичность ФКП достоверно ниже (чувствительность 68% и специфичность 85%). Основываясь на вышеизложенных данных, предложено считать нормальным уровень ФКП <50 мкг/г, что в большинстве случаев исключает ВЗК у пациентов с абдоминальным дискомфортом [3]. Таким образом, использование фекальных биомаркеров в качестве скрининга органических изменений кишечника уменьшает потребность в проведении инвазивных эндоскопических процедур и является более предпочтительным методом исследования. Причины повышения концентрации ФКП, не связанные с ВЗК Повышение уровня ФКП возможно и при других заболеваниях, таких как рак, бактериальная инфекция, поэтому тест не является единственным методом диагностики ВЗК и, как и наличие положительного результата на ФКП, при отсутствии эндоскопических и морфологических признаков ВЗК не исключает органической патологии кишечника другой этиологии. Установлена высокая чувствительность ФКП при других заболеваниях, сопровождающихся воспалением в кишечнике: рак, аденомы, микроскопический колит, кишечные инфекции с различным характером повреждения слизистой оболочки, включая повышение проницаемости, наличие эрозивно-язвенных изменений. У 90% из 62 пациентов с колоректальным раком отмечался повышенный уровень ФКП (>50 мг/г), и только у 58% из них - положительная реакция на скрытую кровь. Чувствительность и специфичность ФКП при раке прямой кишки составляют 79 и 72% соответственно [5, 14]. Прием нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) пациентами может привести к эрозивно-язвенным изменениям слизистой оболочки желудка и кишечника, которые часто протекают бессимптомно, но в итоге могут приводить к анемии. В 2015 г. проведено исследование, включающее 40 здоровых добровольцев, принимавших диклофенак в дозе 150 мг в день в течение 14 дней. Концентрация ФКП возросла на 75% по сравнению с исходным уровнем [3, 5]. В Индии в 2013 г. проведено исследование, в которое включены 2383 пациента с острой диареей. Чувствительность и специфичность ФКП составили 83 и 87% соответственно. Концентрация ФКП выше при бактериальных инфекциях, чем при вирусных, и коррелирует с тяжестью состояния [15]. У пациентов с осложненной формой дивертикулярной болезни при гистологическом исследовании СОК всегда отмечаются признаки воспаления. Проведены исследования, в которых показано, что при концентрации ФКП >60 мкг/г существует риск острых осложнений дивертикулярной болезни [9, 16]. ФКП и ВЗК Впервые прогностическая ценность ФКП в диагностике и мониторинге активности ВЗК продемонстрирована J. Tibble и соавт. в 2000 г. и далее подтверждена в многочисленных клинических исследованиях [13, 14, 17]. В 2011 г. P. Ricanek и соавт. показали, что концентрация ФКП у пациентов с ЯК при тотальном поражении составляет в среднем 740 мкг/г, при левостороннем поражении - 2106 мкг/г, при ЯК в форме проктита - 86 мкг/г [18]. G. D’Haens и соавт. исследовали 31 пациента и установили, что уровень ФКП >250 мкг/г характерен для умеренной и высокой активности ЯК. Чувствительность составила 71%, специфичность - 100%. Снижение уровня ФКП до 250 мкг/г свидетельствует о ремиссии БК с индексом активности БК <150 (чувствительность 94%, специфичность 62%) [1]. T. Lobatón и соавт. исследовали 115 больных БК и установили, что концентрация ФКП зависит от локализации воспалительного процесса. Так, при поражении илеоцекальной области она в среднем составляет 1800 мкг/г, при колите - 1297 мкг/г, при илеите - 420,5 мкг/г. При эндоскопической ремиссии концентрация ФКП находилась в пределах 100 мкг/г и не зависела от локализации. На основании этого авторы сделали вывод, что уровень концентрации ФКП может использоваться как предиктор эндоскопической ремиссии. При колите он равен 293 мкг/г (чувствительность 79%, специфичность 100%); при илеите - 107,5 мкг/г (чувствительность 63%, специфичность 100%). По результатам многомерного анализа концентрация ФКП >272 мкг/г является предиктором эндоскопической активности БК [2]. Оценка активности ВЗК Целью лечения ВЗК является достижение глубокой ремиссии и ее поддержание. Медикаментозная терапия включает в себя препараты: 5-аминосалицилаты, глюкокортикостероиды, тиопурины, цитостатики и антицитокиновую терапию. При оценке эффективности терапии основываются на уменьшении симптомов, клинических показателей: индекса активности БК и индекса активности ЯК, изменении скорости оседания эритроцитов и уровня С-реактивного белка. А. Roseth и соавт. отметили, что при ВЗК в стадии клинической, эндоскопической ремиссии и нормальной гистологической картине СОК у 38 из 45 пациентов концентрация ФКП находилась в пределах нормы [19]. Последующие исследования больных с зажившей СОК показали, что концентрация ФКП составляла у них <250 мкг/г и соответствовала 94% чувствительности и 62% специфичности. Отмечено, что ФКП отражает эндоскопическую активность более точно, чем индекс активности БК, и повышается при рецидиве раньше клинических симптомов. Спустя 12 нед после начала антицитокиновой терапии у 40 больных уровень ФКП снизился с 1173 до 130 мг/г, а у 5 больных - до нормы. В дальнейшем авторы исследовали 60 пациентов с ВЗК (34 с БК и 26 с ЯК), получавших инфликсимаб и адалимумаб. У 52% из них концентрация ФКП оказалась ниже 100 мкг/г. Таким образом, уровень ФКП позволяет предсказать [19], кто из пациентов не отвечает на антицитокиновую терапию и требует хирургического лечения. M. De Vos и соавт. показали, что концентрация ФКП в пределах нормы дает возможность прогнозировать длительность ремиссии ВЗК у больных, получающих глюкокортикостероидную и антицитокиновую терапию, при условии исследования ФКП до и спустя месяц после изменения терапии [20]. В некоторых исследованиях отмечена связь между уровнем ФКП, эндоскопической активностью и локализацией БК. Так, при исследовании 115 больных с БК в форме илеоколита средняя концентрация ФКП составляла 1800 мкг/г, колита - 1297 мкг/г, илеита - 420,5 мкг/г. Также доказано, что показатель ФКП может служить предиктором эндоскопической ремиссии БК. Для колита Крона он равен 293 мкг/г (чувствительность 79%, специфичность 100%), для илеита - 107,5 мкг/г (чувствительность 63%, специфичность 100%). По результатам многомерного анализа, концентрация ФКП >272 мкг/г является предиктором эндоскопической активности БК [21, 22]. Возможность прогноза рецидива ВЗК Ряд исследователей показали, что у пациентов с ремиссией БК с помощью ФКП можно прогнозировать рецидив в течение ближайших 12 мес. Показано также, что, в отличие от пациентов с БК, риск рецидива у больных ЯК увеличивается в 14 раз, если ФКП превышает 150 мкг/г [4, 31]. По данным J.A. Tibble и соавт., у больных ВЗК с уровнем ФКП >50 мкг/г частота рецидива достигает 85%, а у больных с ФКП <50 мкг/г - 10-15%. У детей при уровне ФКП >100 мкг/г частота рецидива составила 39%, а с уровнем ФКП менее порогового уровня - 25%. Некоторые авторы используют значения ФКП в качестве предиктора колэктомии у больных с ЯК. При сравнении пациентов с тяжелым иммунорезистентным ЯК с концентрацией ФКП 1020 мкг/г и с его уровнем >1922,5 мкг/г максимальный риск колэктомии у последних составил 9,23 (специфичность 97,4%) [23]. ФКП может также использоваться для оценки риска послеоперационного рецидива БК [6, 24]. При обследовании 39 пациентов с БК в форме илеоколита, подвергшихся оперативному вмешательству, установлено, что повышение концентрации ФКП >200 мкг/г через 3 мес после операции являлось критерием предиктора рецидива БК. Чувствительность составила 63%, специфичность - 75%. По данным М. Aguas и соавт. [25], предиктором рецидива БК является повышение концентрации ФКП >100 мкг/г через 6 мес после операции (чувствительность 89%, специфичность 58%). Известно, что приблизительно 20% пациентов с БК в течение жизни подвергаются хирургическому лечению - резекции терминального отдела подвздошной кишки или колэктомии. При этом рекомендуется через 6-12 мес после операции выполнять контрольную КИС. Чтобы свести к минимуму количество эндоскопических исследований, можно использовать возможности неинвазивных биомаркеров в качестве предикторов рецидива. Проведено несколько исследований, в которых подтверждено это предположение. Высокая концентрация ФКП в послеоперационном периоде отмечалась у пациентов с развившимся впоследствии рецидивом. В то же время у больных с нормальным уровнем ФКП обострения не происзошло. Также показано, что у больных ЯК, перенесших колэктомию, уровень ФКП может служить дополнительным маркером риска развития резервуарита [24, 25]. Другие биомаркеры ВЗК В настоящее время известны и другие маркеры воспаления кишечника, которые могут предоставить дополнительную информацию. Лактоферрин Лактоферрин (ЛФ) - гликопротеин, содержащийся в ткани и секретах большинства желез экзокринового типа, а также во вторичных гранулах нейтрофилов. ЛФ выполняет ряд важных функций: участвует в неспецифической иммунной защите, является фактором созревания и активатором клеток лимфоидного ряда, а также внеклеточным транскрипционным фактором. К механизмам его функциональной активности относят способность обратимо связывать ионы железа и тем самым подавлять рост микроорганизмов и опухолей, а также усиливать фагоцитоз. Обнаружена рибонуклеазная активность одной из изоформ ЛФ, а также его способность ослаблять повреждающее действие свободных радикалов [26, 27]. ЛФ является одним из неспецифических универсальных маркеров рака. Повышенное содержание ЛФ в крови наблюдается при таких злокачественных новообразованиях, как лимфогранулематоз и лимфосаркома (в 2-20 раз), лейкозы, рак молочной железы, яичников, пищевода, желудка, кишечника (в 2 раза и более). Диагностическая значимость теста на ЛФ существенно возрастает при его повторном определении (мониторинге), а также при одновременном определении других опухолевых маркеров [28]. Исследования, посвященные ЛФ, показывают, что с его помощью можно эффективно дифференцировать ВЗК с функциональными заболеваниями кишечника. S. Buderos и соавт. наблюдали 5 пациентов с БК в процессе лечения инфликсимабом и показали, что уровень фекального ЛФ снижается по мере достижения клинической ремиссии [29]. Однако, по мнению авторов, необходимы дальнейшие исследования для уточнения места этого маркера в дифференциальной диагностике воспалительного и иного поражения кишечника, преимущества количественного определения фекального ЛФ перед качественным и его возможностей в прогнозировании рецидива ВЗК [27, 29]. В 2007 г. проведено исследование фекального ЛФ как маркера ЯК. Анализы кала взяты у 66 пациентов с ЯК, у 20 здоровых лиц и пациентов с СРК. Концентрация ЛФ у пациентов с ЯК составила в среднем 61,6±4,8 мкг/г, что значимо выше, чем у пациентов с СРК (7,9±1,1 мкг/г) и здоровых людей (3,0±0,5 мкг/г; р≤0,01). Концентрация ЛФ у пациентов с СРК также оказалась выше, чем у лиц контрольной группы (р≤0,05), и коррелировала с эндоскопическими результатами ЯК (r=0,871; р≤0,01). Авторы делают вывод, что с помощью этого биомаркера можно оценивать степень активности воспаления при ЯК [30]. Однако, основываясь на данных рандомизированных клинических исследований, можно утверждать, что ФКП имеет преимущество по сравнению с ЛФ в диагностике ВЗК, так как обладает более высокой чувствительностью (85,9%) и специфичностью (85,1%) [28, 30]. S100A12 (кальгранулин С) Как и КП, кальгранулин С относится к семейству протеинов S100 [2, 4, 28, 30]. В отличие от других биомаркеров, S100A12 выделяется кишечным эпителием под влиянием гранулоцитов. Подобно КП, кальгранулин С относится к белкам острой фазы и обладает антимикробными свойствами [4]. Данные проведенных исследований не однозначны: некоторые из них показали более высокую чувствительность кальгранулина С для дифференциальной дигностики ВЗК, СРК, вирусных и бактериальных колитов, другие не подтвердили его преимуществ [4, 15]. ПК-М2 (пируваткиназа типа М2) ПК-М2 - это димер изоформы гликолитического фермента пируваткиназы, который вырабатывается опухолевыми клетками и применяется в качестве онкомаркера для ранней диагностики предраковых заболеваний и рака толстой кишки. Немногочисленными исследованиями выявлено повышение уровня ПК-М2 в кале (3,7-4 U/g) у 100% пациентов с ВЗК, связанное с активностью воспаления. По данным разных авторов, чувствительность данного метода колеблется от 67 до 87,7%, а специфичность - от 62,9 до 88% [19, 27, 28]. Однако прогностическая значимость ПК-М2 в сравнении с ФКП и другими биомаркерами пока не изучена. Заключение Исследование ФКП является неинвазивным, недорогим и в то же время высокочувствительным и специфичным биомаркером, который должен использоваться для диагностики ВЗК, оценки эффективности лечения и прогнозирования рецидивов. Значение других маркеров воспаления в кишечнике (ЛФ, кальгранулин С, ПК-М2) для диагностики и оценки эффективности проводимой терапии у больных с патологией кишечника еще предстоит оценить. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов

About the authors

N A Fadeeva

A.S. Loginov Moscow Clinical Research and Practical Center of the Department of Health of Moscow

Moscow, Russia

I A Korneeva

A.S. Loginov Moscow Clinical Research and Practical Center of the Department of Health of Moscow

Moscow, Russia

O V Knyazev

A.S. Loginov Moscow Clinical Research and Practical Center of the Department of Health of Moscow

Moscow, Russia

A I Parfenov

A.S. Loginov Moscow Clinical Research and Practical Center of the Department of Health of Moscow

Email: asfold@mail.ru
Moscow, Russia

References

Supplementary files