Prediction of features of the course of chronic hepatitis C using Bayesian networks

Full Text

АСТ - аспартатаминотрансфераза АФП - альфа-фетопротеин БС - байесовские сети ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ВРВП - варикозное расширение вен пищевода ИМТ - индекс массы тела КТ - конечные точки ПДРФ - полиморфизм длин рестриктных фрагментов ПЦР - полимеразная цепная реакция РФ - ревматоидный фактор ХГВ - хронический гепатит В ХГС - хронический гепатит C ЦП - цирроз печени Введение Течение хронического гепатита C (ХГС) подвержено значительным индивидуальным различиям, что обусловлено, помимо прочего, генетическими факторами. Стратегия лечения ХГС опирается на индивидуальный подход к пациенту. Современные противовирусные препараты позволяют добиться впечатляющих результатов. Вместе с тем, в первую очередь из-за длительного латентного течения заболевания, приводящего к поздней диагностике в период уже развившихся осложнений, а также из-за нежелательных эффектов препаратов требуется дальнейший поиск предикторов неблагоприятных исходов заболевания. Процесс ремоделирования печеночной ткани очень сложен, хронический гепатит прогрессирует от мягкого воспаления к более тяжелому, а затем к фиброзу и циррозу. Участвуют как иммуновоспалительные, так и неиммунные реакции. В этот процесс вовлечено множество медиаторов. Индивидуальность каждого клинического случая, несомненно, зависит и от точечных полиморфизмов генов, контролирующих эти механизмы. Однако вклад их оценить сложно, данные исследований противоречивы. Ранее мы изучали полиморфизмы генов, влияющие на выраженность воспалительной реакции, эндотелиальной дисфункции и ангиотензинпревращающего фермента, свертывающей системы, а также гемохроматоза [1]. С использованием методов логистической регрессии удалось уточнить влияние клинико-генетических факторов на скорость развития фиброза, портальной гипертензии и исходы терапии [1]. Показана связь полиморфизма генов и прогрессирования фиброза, портальной гипертензии, развития криоглобулинемического васкулита. Однако индивидуальный прогноз на основе всех ранее накопленных нами данных не проводился. Прогностические вероятностные модели на основе байесовских сетей (БС) используются в кардиологии и других областях медицины [2], в том числе в онкологии, где многофакторный характер заболевания создает трудности прогнозирования рецидива заболевания, но именно индивидуальный прогноз во многом определяет стратегию лечения [3]. Модели на основе БС [2-5] обладают гибкостью и универсальностью, способны к самообучению и интеграции разнородных данных, а также они нечувствительны к наличию ошибочных или неполных данных. Попытка использования БС для определения прогностической значимости полиморфизма генов эндотелиальной дисфункции в течении ХГС предпринималась нами ранее. Представляется актуальным построение вероятностных моделей на основе БС с их оптимизацией для определения особо важных прогностических параметров, влияющих на течение ХГС. Материалы и методы В исследование включено 253 больных ХГС и циррозом печени (ЦП), наблюдавшихся в Клинике нефрологии, внутренних, профессиональных заболеваний и пульмонологии им. Е.М. Тареева (директор - академик РАН Н.А. Мухин) в период с ноября 2009 г. по июнь 2014 г. Создана база данных, которая включала основные клинические, биохимические, инструментальные параметры, характеризующие факторы вируса и хозяина, позволяющие оценить клиническое течение заболевания и исходы. Критериями включения служили наличие ХГС или ЦП в его исходе, принадлежность к европеоидной расе, а также подписанное информированное согласие на участие в исследовании. Критериями исключения больных являлись: 1) употребление алкоголя (>20 мл/сут для женщин и >40 мл/сут для мужчин), 2) наличие дополнительных этиологических факторов поражения печени (коинфекция ХГВ, ВИЧ, болезнь Вильсона-Коновалова, аутоиммунный гепатит, наследственный гемохроматоз), 3) сахарный диабет 1-го и 2-го типа. Для определения стадии фиброза больным выполняли биопсию печени (119 больных) с последующим гистологическим исследованием; 52 больным выполнена эластометрия печени с помощью аппарата FibroScan (EchoSens, Франция). У 52 больных стадия фиброза расценена как F4 на основании данных клинико-лабораторного и инструментального обследования без проведения эластометрии и биопсии печени. Скорость прогрессирования фиброза оценивали по формуле, предложенной Т. Poynard и соавт. [6]: Скорость прогрессирования фиброза печени (ед. фиброза/год) = стадия фиброза по METAVIR (ед. фиброза) / длительность инфицирования (год). Исследовались точечные мутации следующих генов: 1. Участвующих в воспалительных реакциях и противовирусном иммунитете - IL-1β -511C/T, IL-10 -1082G/A, IL28B C/T, IL28B T/G, TNF-α -238G/A, TGF-β -915G/C, IL-6 -174G/C. 2. Активаторов локального печеночного фиброза - AGT G-6A, AGT 235 M/T, ATR1 1166 A/C. 3. Гемохроматоза - HFE C282Y, HFE H63D. 4. Тромбоцитарных рецепторов - ITGA2 807 C/T, ITGB3 1565 T/C. 5. Белков свертывающей системы и эндотелиальной дисфункции - FII 20210 G/A, FV 1691G/A, FVII 10976 G/A, FXIII 103 G/T, eNOS 894 G/T, CYBA 242 C/T, FBG -455 G/A, PAI -675 5G/4G, MTHFR 677 C/T. Выделение геномной ДНК проводили из ЭДТА-стабилизированной периферической венозной крови согласно протоколу с помощью коммерческого набора QIAmp DNA Blood Mini Kit и автоматической станции QIAcube™ (QIAGEN, Германия). Полиморфные аллели генов цитокинов определяли методом полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ), а гена HFE - аллельспецифичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в термоциклере MasterCycler фирмы Eppendorf (Германия). Полиморфизм генов MTHFR 677 C/T, FII 20210 G/A, FV 1691G/A, FVII 10976 G/A, FXIII 103 G/T, ITGA2 807 C/T, ITGB3 1565 T/C, FBG -455 G/A, PAI -675 5G/4G определяли с помощью коммерческих наборов «ДНК-технология», термоциклера DTprime и программного обеспечения для приборов ДТ-96 («ДНК-технология», Россия). Предикторное значение клинико-лабораторных, в том числе и генетических, факторов исследовалось для следующих четырех прогнозируемых состояний (табл. 1) - конечных точек (КТ): развитие цирроза печени (КТ1), скорость фиброза (КТ2), наличие портальной гипертензии (КТ3) и наличие криоглобулинов (КТ4). Целые числа в колонках представляют собой общее количество пациентов из числа пациентов с соответствующим состоянием конечной точки (целевого показателя). Статистический анализ. Прогнозирование проводилось с использованием БС. Каждая БС - это направленный ациклический граф, каждой вершине (узлу) которого сопоставлена одна переменная и таблица условных вероятностей [6]. Переменные, соответствующие узлам БС, могут представлять собой параметры пациентов, КТ и другую информацию. Каждый узел БС может находиться в некотором количестве состояний, соответствующих дискретным значениям переменной, которую этот узел представляет. Вероятность состояния данного узла зависит только от текущего состояния его «родителей» - узлов, из которых исходят стрелки, идущие к данному узлу. Таблица условных вероятностей данного узла содержит вероятности наблюдений состояний этого узла при различных состояниях узлов-родителей. Таблицы получаются в результате выполнения процедуры обучения БС, а процедура опроса обученной БС позволяет определить вероятности состояний узлов в зависимости от имеющейся информации о значениях других узлов. Использовалась наивная топология сети, в которой у всех узлов есть один общий родитель, называемый корневым узлом, в качестве которого выбиралась одна из КТ. Для определения надежности (качества) предсказания с помощью БС и сравнения различных БС использовали ROC-кривую [7-9] и численное значение площади под этой кривой AUC (Area Underthe Curve): чем ближе величина AUC к единице, тем выше надежность предсказания сети. В данной работе для построения ROC-кривой для заданной БС применялся наиболее точный метод «исключения по одному». С целью повышения надежности предсказаний БС проводилась ее оптимизация с целевой функцией - величиной AUC, при варьировании числа узлов-листьев. Эта оптимизация проводилась с помощью разработанной нами программы SiLVIA (Simple Learn Variable Influence Analyzer) тем же способом, как это делалось в работах [10-13]. Более детальное, но все же краткое изложение этой методологии применения БС для прогностических моделей в медицине представлено в работе [10]. Подготовка данных и построение БС. На основании базы данных пациентов, представленной в виде Excel таблицы, для каждого исхода КТ строились начальные БС с наивной топологией (к одному исходу привязывались предполагаемые факторы риска). Корневым узлам БС соответствовали бинарные параметры КТ. В качестве узлов-листьев БС использовались все имеющиеся параметры базы данных, кроме параметров, значения которых напрямую зависят от КТ. В табл. 2 приведено различие во включенных параметрах в начальные сети для различных КТ, а также общее число узлов для всех начальных БС. Поскольку БС работают с дискретными переменными, для всех непрерывных узлов осуществлена дискретизация - распределение значений соответствующих непрерывных параметров на несколько интервалов на основе экспертного мнения врачей-специалистов. Для проверки результатов предсказания на основе БС мы разбили полученную базу данных случайным образом на две части в соотношении 90% для базы отбора наиболее значимых прогностических параметров (основная группа) и 10% для базы контроля (контрольная группа). Дальнейшая работа и анализ осуществлялись с использованием построенных БС, а также двух баз данных пациентов - отбора и контроля. Оценка надежности предсказания сетей осуществлялась программой ANN, использующей метод ROC-кривых. Эта оценка и выявление наиболее значимых прогностических параметров осуществлялись на базе данных отбора, содержащей 90% пациентов исследуемой базы. Для всех четырех КТ проведена валидация начальных БС: построены ROC-кривые и осуществлен расчет численного значения AUC (табл. 3). Далее для улучшения качества предсказания всех КТ и выявления значимых прогностических параметров осуществлена оптимизация БС по числу узлов с использованием величины AUC в качестве целевой функции. При этом количество прогностических параметров для всех исследуемых КТ уменьшилось примерно в четыре раза. Результаты и обсуждение 1. Оценка надежности предсказания БС. Самое лучшее качество предсказания получилось для КТ1 (предсказание ЦП), значение AUC равнялось 0,9, что является отличным показателем в экспертных системах [14]. Наибольшее увеличение качества предсказания достигнуто для КТ3 (предсказание портальной гипертензии), значение AUC увеличилось с 0,48 до 0,81. Качество предсказания оптимизированных БС для всех КТ приведено в табл. 4. В оптимизированные БС вошли как клинические, так и генетические параметры пациентов (рис. 1-4). При прогнозировании КТ1 - ЦП - значимыми оказались следующие параметры: возраст пациента, возраст инфицирования, длительность заболевания, факторы риска, индекс массы тела (ИМТ), концентрация аспартатаминотрансферазы (АСТ), наличие анемии, криоглобулинов, повышенного уровня альфа-фетопротеина (АФП), а также наличие мутации гена гемохроматоза (HFE H63D, C282Y), гена, кодирующего p22phox-субъединицу NADPH оксидазы (C242T), ангиотензина (AGT G-6G), гена тромбоцитарных рецепторов (ITGB31565 T/C). При прогнозировании КТ2 - скорость прогрессирования фиброза - остались следующие параметры: возраст, возраст инфицирования, длительность заболевания, активность АСТ, наличие определенных генотипов вируса гепатита С. Выявлена связь между темпом прогрессирования фиброза печении и наличием полиморфизма генов ангиотензина (AGT G-6G, AGT M235T), фибриногена - Лейденовской мутации (FV 1691G/A), тромбоцитарных рецепторов (ITGB31565 T/C). При прогнозировании КТ3 - портальная гипертензия - в качестве узлов остались наличие васкулита и криоглобулинов, снижение гемолитической активности комплемента (т. е. наличие криоглобулинемического васкулита). Повышенный ИМТ и злоупотребление алкоголем способствуют более быстрому течению болезни и формированию портальной гипертензии. Среди генетических факторов, связанных с портальной гипертензией, оказались полиморфизм генов ингибитора активатора плазминогена (PAI-I -675 5G/4G), фибриногена (FII 20210 G/A), гена, кодирующего p22phox-субъединицу NADPH-оксидазы (C242T), гена гемохроматоза HFE H63D и Il-6 174GC, отвечающего за повышенную секрецию провоспалительного цитокина IL-6 и гена IL28B C/T. Наличие криоглобулинов и криоглобулиемический васкулит (КТ4), по полученным нами данным, ассоциированы с длительностью заболевания, портальной гипертензией, варикозным расширением вен пищевода (ВРВП), а также гепатоцеллюлярной карциномой, повышением титра ревматоидного фактора (РФ), мутациями в гене MTHFR C677T, генах ATR A1166C и HFE H63D. 2. Применение БС для предсказания целевых показателей. На основе проведенного анализа созданы гистограммы риска, позволяющие предсказывать вероятность наступления одного из вышеперечисленных исходов. Гистограммы риска связывают условную вероятность предсказания с априорной вероятностью предсказания для одной из групп риска пациентов. Для каждого исхода (КТ) рассчитаны четыре группы риска по значениям условных вероятностей (0-0,25; 0,25-0,5; 0,5-0,75; 0,75-1). В дальнейшем, используя информацию об имеющихся в базе данных пациентов с их известными исходами, определяли частоту наступления целевого показателя в каждой из этих групп риска (рис. 5-8). Выводы о вероятности попадания пациента в ту или иную группу риска существенно зависят не только от самой группы риска, но и от рассматриваемой КТ: если для КТ1 в первой группе риска вероятность развития ЦП действительно мала - 4% (см. рис. 5), то вероятность развития портальной гипертензии для КТ3 (см. рис. 7) в первой группе риска весьма велика - 50%. 3. Проверка качества предсказания на контрольных группах. После оптимизации БС качество предсказания для всех КТ увеличилось. Для проверки полученных результатов мы обучили оптимизированные БС на базе данных отбора и далее осуществили предсказание для пациентов, входящих в базу данных контроля. Так как не для всех пациентов в исходной базе данных известны значения конечных точек (см. табл. 1), то контрольные группы для разных КТ содержали различное количество пациентов. Предсказательная способность для контрольной группы в нашем исследовании оказалась самой лучшей для развития ЦП (КТ1), значение AUC на 25 пациентов контрольной группы равнялось 0,8 (табл. 5). Подробное распределение пациентов контрольной группы КТ1 на группы риска продемонстрировано на рис. 9. Полученный результат подтверждает возможность применения экспертной системы предсказания ЦП с использованием оптимизированных БС. Результаты проверки контрольных групп для остальных КТ оказались не убедительны. Возможно, плохое предсказание связано с малым количеством пациентов в основной и контрольной группах. Заключение В проведенном исследовании представлен метод прогнозирования развития ЦП, скорости прогрессирования фиброза, портальной гипертензии и наличия криоглобулинов и криоглобулинемического васкулита у больных хроническим гепатитом С с использованием БС. Полученные результаты позволили нам уточнить вклад не только традиционно исследуемых клинических факторов вируса и хозяина на развитие четырех исходов, определяющих статус больного, но и прогнозировать течение болезни в зависимости от индивидуальных реакций, зависящих от точечных мутаций генов, контролирующих основные патогенетические пути формирования и прогрессирования ХГС. Кроме того, проведенное исследование продемонстрировало возможные направления дальнейшего поиска механизмов прогрессирования ХГС, поскольку не только подтверждена связь изучаемых исходов с факторами, которые хорошо известны из данных литературы, но и выявлена связь с молекулярными механизмами, которые могут быть уточнены при расширении базы данных. Связь данных клинико-демографических параметров и наличия ЦП у пациента понятна, однако выявленные генетические связи требуют дальнейшего тщательного изучения. Так, ассоциация между полиморфизмом в гене HFE и ЦП, по-видимому, связана с перегрузкой железом, что способствует прогрессированию болезни печени. Того же мнения придерживаются B.Y. Tung и соавт., по данным которых полиморфизм в гене HFE ассоциирован с перегрузкой железом у больных на стадии гепатита и компенсированного ЦП [15-17]. Наше исследование впервые продемонстрировало роль полиморфизма гена, кодирующего p22phox-субъединицу NADPH оксидазы (C242T), на течение и прогноз хронических заболеваний печени. Известно, что наличие этого полиморфизма ассоциируется с артериальной гипертензией [18] и позволяет предположить, что данная мутация приводит к эндотелиальной дисфункции, тем самым способствуя прогрессированию фиброза через портальную гипертензию. Полиморфизм гена AGT обусловливает не только активацию ангиотензина в плазме, но и активацию локально тканевой его формы, что является стимулом к формированию фиброза органов [19]. Нами впервые продемонстрировано влияние полиморфизма гена тромбоцитарных рецепторов ITGB31565 T/C на прогрессирование фиброза печени. Связь между полиморфизмом тромбоцитарного рецептора ITGB31565 T/C и наличием цирроза печени, возможно, объясняется дисфункцией тромбоцитов при наличии мутации, что приводит к активации сосудистого компонента (в том числе и развитие лейкокластического васкулита). Известно, что носительство мутации в гене FV 1691G/A связано с формированием микротромбозов в ткани печени [20-22], несомненно способствующих прогрессированию фиброза. КТ2 - скорость прогрессирования фиброза - зависела от уже известных параметров, таких как возраст, возраст инфицирования, длительность заболевания, концентрация АСТ, наличие определенных генотипов вируса гепатита С [5, 23]. Представляет интерес выявленная нами связь между темпом прогрессирования фиброза печени при ХГС и наличием полиморфизма генов ангиотензина (AGT G-6G, AGT M235T), фибриногена, Лейденовской мутации (FV 1691G/A), тромбоцитарных рецепторов (ITGB31565 T/C). Таким образом, одни и те же полиморфизмы оказались тесно связаны с темпом развития ЦП и с его выраженностью, что, очевидно, позволяет относить больных с этими особенностями к наиболее прогностически неблагоприятной группе, требующей лечения. Ремоделирование портальной системы кровотока с развитием портальной гипертензии (КТ3) оказалось связанным с наличием повышенного ИМТ и злоупотреблением алкоголем, что в качестве неблагоприятных ко-факторов развития портальной гипертензии хорошо известно. А взаимосвязь портальной гипертензии с наличием криоглобулинов и криоглобулинемического васкулита, вероятно, связано не только с тем, что наиболее часто развитие криоглобулинемического васкулита ассоциировано с более поздней стадией болезни [24, 25]. Наше исследование выявило ряд генетических факторов, связанных с портальной гипертензией. Ими оказались гены, участвующие через активацию эндотелия и формирование микрооангиопатий в повреждении сосудистой стенки, такие как полиморфизм генов ингибитора активатора плазминогена (PAI-I -675 5G/4G), фибриногена (FII 20210 G/A), гена, кодирующего p22phox-субъединицу NADPH оксидазы (p22phoх C242T). Взаимосвязь с портальной гипертензией установлена с полиморфизмом гена гемохроматоза HFE H63D, связанного с синдромом перегрузки железом. Перегрузка железом может приводить к агрессивным локальным окислительным процессам. Ген Il-6 174GC, отвечающий за повышенную секрецию провоспалительного цитокина IL-6, вероятно, способствует более быстрым фибротическим процессам в ткани печени через активную воспалительную реакцию, тем самым ускоряя развитие портальной гипертензии. Влияние мутации в гене IL28B C/T на наличие портальной гипертензии трудно объяснимо, однако можно предположить, что данная мутация приводит к ослаблению естественной противовирусной защиты, а следовательно, способствует персистенции вируса. Ранее показана связь гена IL28B C/T с ответом на противовирусную терапию. Наличие криоглобулинов (КТ4), по полученным нами данным, ассоциировано с длительностью заболевания, портальной гипертензией, ВРВП, а также гепатоцеллюлярной карциномой, что легко объяснимо, так как все перечисленные факторы определяются стажем болезни и длительной персистенцией в организме вируса гепатита С, приводящих к изменению иммунного ответа. Более высокий уровень гомоцистеина при наличии мутации в гене MTHFR C677T может способствовать формированию криоглобулинемического васкулита, что также показано и в работе M. Casato и соавт. [26]. Нами не найдено данных, объясняющих влияние полиморфизма генов ATR A1166C и HFE H63D на образование криоглобулинов, но возможно, что они играют роль в повреждении сосудистой стенки через оксидативный стресс (HFE H63D) и индукцию (ATR A1166C) лейкокластического васкулита, где повреждающая роль тромбоцитов хорошо известна. Полученные в данной работе оптимизированные обученные БС могут быть использованы для уточнения прогноза у каждого нового пациента на основе его персональных параметров при расчете гистограммы риска. Исследование выполнено в рамках проекта № 14-50-00029 Российского научного фонда. Конфликт интересов отсутствует.

About the authors

L M Samokhodskaya

M.V. Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

E E Starostina

M.V. Lomonosov Moscow State University

Email: starostinaee@gmail.com
Moscow, Russia

A V Sulimov

M.V. Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

T N Krasnova

M.V. Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

T P Rosina

M.V. Lomonosov Moscow State University; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Moscow, Russia

V G Avdeev

M.V. Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

I A Savkin

M.V. Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

V B Sulimov

M.V. Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

N A Mukhin

M.V. Lomonosov Moscow State University; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Moscow, Russia

V A Tkachuk

M.V. Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

V A Sadovnichii

M.V. Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

References

Supplementary files