Clinical and interferon-modulating efficacy of a combination of rectal and topical dosage forms of interferon-α2b in acute respiratory infections

Full Text

АдВИ - аденовирусная инфекция ВБН - вирус болезни Ньюкасла ИФН - интерфероны ИФН-α2b - интерферон-α2b ИФА - иммуноферментный анализ ОРВИ - острые респираторные вирусные инфекции ОРИ - острые респираторные инфекции ПЦР - полимеразная цепная реакция Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) лидируют в структуре инфекционной заболеваемости населения разных стран мира. На долю ОРВИ приходится около 12-14% случаев временной нетрудоспособности в России [1]. Клинические проявления ОРВИ обусловлены как свойствами возбудителей и массивностью инвазии, так и адекватностью и сбалансированностью иммунного ответа. Центральным звеном иммунной защиты от любых возбудителей ОРВИ является система интерферонов (ИФН), которые оказывают прямые и опосредованные противовирусные эффекты. Непосредственным виростатическим действием обладают ИФН I и III типа, которые через разные рецепторы, но по сходным сигнальным путям приводят к экспрессии ИФН-стимулированных генов, белковые продукты которых блокируют ключевые этапы жизненного цикла вируса, начиная с его внедрения в клетку и заканчивая высвобождением дочерних вирионов, при этом потенцируя адаптивные клеточные противовирусные реакции [1]. Разработка топических и ректальных форм рекомбинантного ИФН-α, обладающих меньшим числом побочных эффектов, чем инъекционные формы этого цитокина, и иными органными/тканевыми мишенями действия, увеличила круг заболеваний, при которых ИФН-α оказывают выраженное терапевтическое и профилактическое действие [2]. Топические и ректальные формы ИФН-α2b достаточно давно применяются в клинической практике для подавления репликации вирусов в разных отделах респираторного тракта. В состав некоторых из них, помимо ИФН-α2b, включены антиоксидантные и/или мембраностабилизирующие компоненты [3, 4]. Основной гипотезой, проверяемой в настоящем исследовании, было то, что дополнительное интраназальное введение ИФН-α2b способно повысить клиническую и ИФН-модулирующую эффективность ректальной формы этого цитокина у больных с неосложненной формой ОРВИ. Кроме того, представлялось целесообразным сравнить клинические и иммуномодулирующие эффекты ИФН-содержащих препаратов с таковыми умифеновира - широко используемого в лечении ОРВИ/гриппа и хорошо изученного противовирусного средства. Цель работы - оценка клинической и ИФН-модулирующей эффективности комбинации ректальной и топической форм ИФН-α2b с антиоксидантами в лечении острых респираторных инфекций (ОРИ) в сравнении с другими вариантами противовирусной терапии. Материалы и методы Под наблюдением находились 90 мужчин-военнослужащих срочной службы в возрасте от 18 до 23 лет (19,2±0,9 года) с неосложненными формами ОРИ, госпитализированных в инфекционные отделения Федерального государственного казенного учреждения «1586 Военный клинический госпиталь» Министерства обороны Российской Федерации в эпидемический сезон 2016-2017 гг. Пациентов включали в исследование не позднее 48 ч от момента проявления первых симптомов заболевания. Критерии не включения: прием противовирусных и иммуномодулирующих препаратов в течение 1 мес до госпитализации, наличие осложнений ОРИ на момент поступления в стационар, сопутствующие хронические заболевания органов дыхания, сердечно-сосудистой и эндокринной систем, аутоиммунные заболевания. Критерии исключения: проявившаяся в ходе исследования аллергическая реакция на лекарственные препараты, несоблюдение кратности и схемы приема препарата, отказ пациента от продолжения участия в исследовании. После добровольного подписания информированного согласия, отобранным пациентам проведено комплексное обследование, включающее клинический анализ крови, общий анализ мочи, флюорографию органов грудной клетки, электрокардиографию. Больных рандомизировали в 3 сопоставимые группы по 30 человек. В 1-й группе («ИФН-α: свечи») пациенты в течение 5 дней в составе комплексного лечения получали 2 раза в сутки ректальные свечи, содержащие ИФН-α2b (1 млн МЕ), α-токоферола ацетат (0,055 г) и аскорбиновую кислоту (0,0081 г; ООО «Ферон»). Во 2-й группе («ИФН-α: свечи+гель») больные, кроме того, получали интраназально 3 раза в сутки гель для наружного и местного применения, содержащий ИФН-α2b (36 000 МЕ/1 г), α-токоферола ацетат (0,055 г), бензойную кислоту (0,00128 г) и лимонной кислоты моногидрат (0,001 г; ООО «Ферон») в течение 5 дней. В 3-й группе («Умифеновир») больным назначали умифеновир (АО «Фармстандарт»; референс-препарат) по 200 мг 4 раза в сутки в течение 5 дней. Помимо противовирусной терапии пациенты получали симптоматическое лечение (ирригационные процедуры, деконгестанты, парацетамол при температуре выше 38,5 °С). В течение 6 сут включенных в исследование больных ежедневно осматривали, при этом регистрировали объективные и субъективные проявления заболевания, выясняли переносимость лекарственных препаратов и возможные нежелательные явления, проводили термометрию 2 раза в сутки, пульсоксиметрию, объективно оценивали состояние основных органов и систем. Кроме того, за больными наблюдали в течение 3 мес после окончания лечения для регистрации повторных случаев госпитализации по поводу ОРИ. Верификацию возбудителей ОРВИ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в мазке-соскобе из носоглотки и оценку состояния системы ИФН проводили при поступлении и по окончании противовирусного лечения (6-й день). Концентрацию ИФН-α и ИФН-γ в плазме крови и супернатантах культур клеток крови определяли методом твердофазного «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью наборов производства АО «Вектор-Бест» на микропланшетном ридере Anthos 2020 (Австрия) в лаборатории онтогенеза и коррекции системы интерферона ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России как описано ранее [5]. Кровь забирали из вены в объеме не менее 3 мл в пробирку с гепарином. Полученный образец центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин, после чего отбирали и аликвотировали плазму, в которой определяли концентрацию ИНФ-α и ИНФ-γ. Оставшиеся клетки разводили в соотношении 1:10 средой RPMI-1640 с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки. Полученную суспензию клеток вносили по 0,9 мл в лунки стерильных плоскодонных 48-луночных планшетов. Для определения спонтанной и индуцированной продукции ИФН-α и ИФН-γ клетками крови одного пациента использовали 3 лунки. В одну из них вносили 100 мкл суспензии вируса болезни Ньюкасла (ВБН), штамм Канзас (конечная концентрация - 1 ЦПЕ/мл) для индукции ИФН-α; в другую - 100 мкл раствора фитогемагглютинина (ООО «Компания «ПанЭко»; конечная концентрация - 10 мкг/мл) для индукции ИФН-γ, в третью - 100 мкл культуральной среды. Планшеты инкубировали 24 ч при 37 ºС в атмосфере увлажненного воздуха с 5% СО2. После инкубации из лунок отбирали супернатанты, аликвотировали и замораживали их при -20 ºС для хранения, если постановка ИФА не осуществлялась в ближайшие 24 ч. За условную норму в рамках данной работы приняты результаты изучения системы ИФН в группе 20 клинически здоровых мужчин-военнослужащих, сходных по возрасту и условиям жизни/службы с обследованными больными ОРИ. Математическую обработку данных осуществляли с помощью программы Statistica 8 (StatSoftInc). Парные сравнения независимых выборок по количественным характеристикам проводили с помощью критерия Манна-Уитни, зависимых выборок - Уилкоксона. Для множественного сравнения независимых выборок использован критерий Краскела-Уоллиса. При сравнении по качественным признакам применяли критерии χ2 с поправкой Йейтса и МакНемара для независимых и связанных выборок соответственно. Результаты Основными симптомами при поступлении были повышение температуры тела, кашель (преимущественно сухой), боль в горле, насморк и/или заложенность носа, слабость и головная боль. Среди выявленных возбудителей ОРВИ доминировали вирусы гриппа, аденовирусы и риновирусы; более чем в 1/3 случаев идентифицировать возбудителя не удалось (рис. 1, см. на цветной вклейке). У больных гриппом А отмечалась астенизация, при гриппе В и аденовирусной инфекции (АдВИ) максимально выраженными были интоксикационный и катаральный синдромы. При АдВИ наблюдали относительный лейкоцитоз и повышение уровня нейтрофилов. У пациентов с риновирусной инфекцией отмечали лимфопению и моноцитоз на фоне слабовыраженной интоксикации и катаральных симптомов. Исходно доля больных с верифицированным возбудителем, этиологическая структура, частота проявления и выраженность основных клинических симптомов ОРИ в сравниваемых группах были сопоставимы (математически подтвержденные отличия отсутствовали), что позволило достаточно объективно оценить эффективность различных вариантов противовирусной терапии. Статистически значимых межгрупповых различий в продолжительности проявлений интоксикационного синдрома и катаральных симптомов не выявлено (табл. 1). Вместе с тем у пациентов, получавших комбинацию ректальной и топической форм ИФН-α2b, обнаружена выраженная тенденция к сокращению продолжительности лихорадки и интоксикации в сравнении с больными, получавшими только свечи ИФН-α2b или умифеновир. Так, через 24 ч от начала лечения в группе «ИФН-α: свечи+гель» доля больных, у которых температура тела нормализовалась, превышала в 3 раза таковую в группе «ИФН-α: свечи» (p=0,014) и вдвое - в группе «умифеновир» (p=0,061; табл. 2). Не выявлено статистически значимых межгрупповых различий в степени эрадикации возбудителей ОРВИ (см. табл. 2). При этом большинство (62,5%) случаев отсутствия эрадикации отмечено у пациентов с АдВИ вне зависимости от варианта лечения. В течение 3 мес дополнительного наблюдения, которое совпадало с периодом высокой сезонной заболеваемости ОРВИ и гриппом, в группах больных, получавших умифеновир или ректальные свечи c ИФН-α2b, были повторно госпитализированы по поводу ОРИ 4 (13,3%) и 7 (23,3%) человек соответственно. В то же время не зарегистрировано ни одного повторного случая ОРИ, требующего стационарного лечения, у пациентов, получавших комбинацию ректальной и топической форм ИФН-α2b (см. табл. 2). Статистически значимых межгрупповых различий по показателям клинического анализа крови и общего анализа мочи до и после проведенного лечения не выявлено. У большинства больных ОРИ так же, как и у здоровых доноров, исходный уровень ИФН-α в плазме крови был ниже уровня детекции использованной тест-системы (табл. 3). Исключение составляла лишь группа пациентов, которых впоследствии лечили с использованием ИФН-α2b в свечах. При поступлении у них обнаружена тенденция к повышению концентрации ИФН-α в плазме крови, а после проведенной терапии отмечено статистически значимое снижение уровня этого цитокина. В других группах больных лечение вызывало лишь тенденцию к снижению концентрации ИФН-α в плазме. Во всех группах пациентов и до, и после проведенной терапии математически подтвержденных отличий уровня этого цитокина от показателей здоровых лиц не выявлено. Концентрация ИФН-γ в плазме крови, а также спонтанная продукция ИФН-α и ИФН-γ ex vivo клетками крови больных ОРИ не отличались от условной нормы и были ниже уровня детекции в большинстве случаев и до, и после лечения вне зависимости от варианта использованных противовирусных препаратов (см. табл. 3). Во всех группах больных ОРИ до лечения индуцированная выработка ИФН-α ex vivo клетками крови не отличалась от таковой у здоровых лиц (см. рис. 1 на цветной вклейке). В результате всех трех вариантов лечения продукция ИФН-α, стимулированная ВБН, снижалась. Множественные и парные сравнения не выявили межгрупповых отличий по этому показателю как до лечения, так и после его завершения. В целом динамика индуцированной выработки ИФН-α в большей степени зависела от фазы ОРИ, а не от использованного метода противовирусной терапии. Представлялось целесообразным изучить характер влияния разных вариантов лечения на указанный показатель в зависимости от его исходного уровня. Поскольку медиана и среднее арифметическое продукции ИФН-α, вызванной ВБН, в группе здоровых лиц были близки к 200 пг/мл, это значение использовано как демаркационная линия для кластеризации больных по исходному уровню индуцированной продукции этого цитокина. У больных с исходно высоким уровнем индуцированной выработки ИФН-α все три варианта лечения сопровождались примерно двукратным снижением этого показателя (рис. 2). При использовании ректальных свечей с ИНФ-α2b и их комбинации с топической формой этого цитокина продукция ИНФ-α ex vivo на 6-й день заболевания возвращалась к уровню здоровых лиц, тогда как у пациентов, получавших умифеновир, выявлена тенденция к падению этого показателя ниже условной нормы. У больных ОРИ с исходной продукцией ИФН-α, стимулированной ВБН, ex vivo ниже 200 пг/мл после лечения с применением только ректальных свечей с ИНФ-α2b или умифеновира статистически значимые изменения этого показателя не выявлены (рис. 3). Вместе с тем включение в комплексную терапию комбинации ректальной и топической форм ИНФ-α2b сопровождалось двукратным увеличением индуцированной выработки ИФН-α ex vivo и полной «нормализацией» этого показателя. Группы больных оказались исходно гетерогенными по индуцированной продукции ИФН-γ (критерий Краскела-Уоллиса: p=0,005) в связи с тем, что до лечения этот показатель у пациентов, которым потом назначали ИФН-α2b в ректальных свечах, был статистически значимо ниже, чем в других группах больных и у здоровых лиц (критерии Данна и Манна-Уитни: p<0,05; рис. 4). У пациентов, получавших комбинацию ректальной и топической форм ИФН-α2b, индуцированная продукция ИФН-γ также была ниже условной нормы (рис. 5). В результате применения ректальной формы ИФН-α2b отмечено математически подтвержденное повышение способности клеток крови к индуцированной продукции ИФН-γ, а после курсового приема умифеновира - тенденция к тому же. Сочетанное применение ректальной и топической формы ИФН-α2b не оказывало значимого изменения индуцированной продукции ИФН-γ. В ходе наблюдения за пациентами во всех группах не зарегистрировано ни одного случая непереносимости использованных лекарственных препаратов и нежелательных явлений, связанных с их применением. Обсуждение По окончании 5-дневного курса лечения у всех наблюдавшихся пациентов отмечена положительная динамика и регрессия основных клинических признаков ОРИ, что можно объяснить не только эффективностью проводимого лечения, но и особенностями дизайна исследования, в которое включали больных только с неосложненными формами заболевания. Вирусологические и клинические эффекты разных вариантов противовирусной терапии были в целом сопоставимы. Вместе с тем, несмотря на отсутствие статистически значимых межгрупповых различий в длительности основных проявлений интоксикации и катаральных симптомов, выявлена выраженная тенденция к ускорению регрессии лихорадки и интоксикации у больных, получавших комбинацию ректальной и топической форм ИФН-α2b. Дополнительное интраназальное введение ИФН-α2b пациентам, получающим этот цитокин в ректальных свечах, существенно увеличивало долю больных с нормальной температурой тела уже на второй день лечения. Сочетанное применение назальной и ректальной форм ИФН-α2b с антиоксидантами, но не лечение референс-препаратом (умифеновиром), более эффективно предотвращало повторные госпитализации по поводу ОРИ в течение 3-месячного наблюдения, чем терапия только ректальными свечами с ИФН-α2b и антиоксидантами. Эти данные интересны в контексте дискуссии о принципиальной целесообразности применения препаратов рекомбинантного ИФН-α при ОРВИ. Скептики в качестве одного из контраргументов приводят данные о том, что использование различных лекарственных форм рекомбинантного ИФН I типа потенциально может ослабить эффективность собственного интерферонового ответа при повторных вирусных инфекциях в результате индукции нейтрализующих антител к этому цитокину [6]. В задачу настоящего исследования не входило определение выработки таких антител; более того, этот феномен в большей степени характерен для случаев пролонгированного и инъекционного применения ИФН-содержащих препаратов. Однако выявленный факт снижения частоты повторных ОРИ в результате комбинированного применения рекомбинантного ИФН-α2b позволяет усомниться в клинической значимости указанного лабораторного феномена по крайне мере при использовании коротких курсов ректальных и назальных форм этого цитокина. Противники применения препаратов рекомбинантного ИФН-α и лекарственных средств, которые индуцируют продукцию этого цитокина, часто заостряют внимание на то, что сами возбудители ОРВИ являются мощными триггерами выработки ИФН I и III типа, а также некоторых других провоспалительных цитокинов. По их мнению, это делает назначение препаратов, содержащих ИФН-α или стимулирующих его выработку, необоснованным. В настоящей работе, несмотря на первичное взятие биологических образцов для иммунологических исследований не позже 48 ч от дебюта заболевания, не установлено существенного повышения уровня системно циркулирующего ИФН-α в ранние фазы ОРИ. Это можно объяснить известной способностью многих респираторных вирусов не только вызывать выработку ИФН-α, но и подавлять продукцию этого цитокина и индуцируемых им виростатических сигналов [7]. Все варианты противовирусной терапии корригировали индуцированную продукцию ИФН-α клетками крови ex vivo в подгруппах с исходным высоким уровнем этого показателя (>200 пг/мл). Однако при исходно низких значениях этой переменной (<200 пг/мл) только комбинация ректальной и топической форм ИФН-α2b вызывала полную нормализацию индуцированной выработки ИФН-α, отражающей функциональные резервы врожденного противовирусного ответа. Заключение Математически подтвержденных отличий между группами больных, получающих разные варианты противовирусной терапии, по эрадикации возбудителей ОРВИ и продолжительности основных клинических проявлений заболевания не установлено. Однако при дополнительном интраназальном введении ИФН-α2b в форме геля больным неосложненными формами ОРИ, получающим ректальную форму этого цитокина, выявлена выраженная тенденция к ускорению регрессии интоксикации и лихорадки. Пятидневный курс лечения ОРИ с использованием комбинации ректальной и топической форм ИФН-α2b с антиоксидантами более эффективно, чем 5-дневный курс противовирусной терапии только ректальными свечами с ИФН-α2b и антиоксидантами, предотвращал повторные госпитализации по поводу ОРИ в период высокой сезонной заболеваемости ОРВИ и гриппом. Комбинированное применение ИФН-α2b с антиоксидантами вызывало наиболее полную коррекцию индуцированной выработки ИФН-α клетками крови ex vivo при ее исходном отклонении от условной нормы в сравнении с другими вариантами противовирусной терапии. Полученные данные требуют проверки в исследованиях с большим числом больных в разных возрастных группах, но в целом указывают на целесообразность применения комбинации ректальной и топической форм ИФН-α2b с антиоксидантами в лечении неосложненных форм ОРИ. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

O V Kalyuzhin

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, Department of Clinical Immunology and Allergy

Email: kalyuzhin@list.ru
Moscow, Russia

Zh B Ponezheva

Central Research Institute of Epidemiology of the Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance

Moscow, Russia

A N Kupchenko

Central Research Institute of Epidemiology of the Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance

Moscow, Russia

A N Shuvalov

N.F.Gamaleya Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Moscow, Russia

T S Guseva

N.F.Gamaleya Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Moscow, Russia

O V Parshina

N.F.Gamaleya Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Moscow, Russia

V V Malinovskaya

N.F.Gamaleya Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Moscow, Russia

V G Akimkin

Central Research Institute of Epidemiology of the Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance

Moscow, Russia

References

Supplementary files