Expression of DROSHA and DICER genes in peripheral blood leukocytes in lung sarcoidosis

Full Text

Саркоидоз (болезнь Бенье-Бека-Шауманна) - системное воспалительное заболевание неизвестной этиологии, которое характеризуется образованием неказеинфицирущихся гранулем в различных органах и тканях. Патологический процесс наиболее часто локализуется в легких [1]. В большинстве случаев заболевание заканчивается спонтанной ремиссией, однако в 20% наблюдается прогрессирующее течение с последующим развитием фиброза легких и респираторной недостаточности [2, 3]. Среди многих факторов риска, инфекционной или неинфекционной природы, генетическая предрасположенность, по-видимому, играет ключевую роль при данном заболевании [4, 5]. Известно, что к таким генетическим детерминантам относятся иммунорегуляторные гены, продукты которых регулируют различные аспекты морфо- и ангиогенеза (пролиферация, апоптоз, миграция и др.), ангиостаз, а также участвуют в патогенезе фиброза легких [4, 6-8]. В настоящее время в ряде исследований показано, что при саркоидозе легких, так же как и при многих других патологических состояниях, имеет место нарушение экспрессии некоторых малых некодирующих молекул РНК (микроРНК) [9-12]. МикроРНК действуют как небольшие отрицательные регуляторы экспрессии генов посредством снижения трансляции белка или деградации мРНК [13, 14]. Аберрантная экспрессия микроРНК приводит к дизрегуляции различных сигнальных путей, регулирующих нормальное функционирование клетки [15]. Кроме того, показано нарушение транскрипционной активности генов, вовлеченных в процесс биогенеза микроРНК [10, 16]. Биогенез (формирование зрелой молекулы микроРНК) - это сложный многоступенчатый процесс, который начинается в ядре клетки при участии различных белковых комплексов. В ходе биогенеза микроРНК процессируется от молекулы пре-микроРНК (первичный транскрипт длиной порядка 1000 нуклеотидов) до зрелой микроРНК размером около 25 нуклеотидов [13]. Ключевую роль в биогенезе микроРНК играют рибонуклеазы DROSHA и DICER [17]. DROSHA (ядерная рибонуклеаза III типа) в комплексе с белком DDG8 (DiGeorge syndrome critical region gene 8) расщепляет первичный транскрипт (пре-микроРНК) в короткий (~70 пар нуклеотидов) предшественник микроРНК (пре-микроРНК). В дальнейшем пре-микроРНК транспортируется в цитоплазму клетки, где процессируется в небольшие РНК-дуплексы микроРНК: микроРНК (~22 пары нуклеотидов) при участии рибонуклеазы III типа DICER [18]. В настоящее время, несмотря на имеющиеся уже результаты исследований по изучению роли отдельных микроРНК в патогенезе саркоидоза легких, в литературе нет информации о том, как при данном заболевании изменяется транскрипционная активность генов, вовлеченных в процесс биогенеза микроРНК, а именно DROSHA и DICER. В связи с этим цель настоящего исследования заключалась в изучении уровня экспрессии генов DROSHA и DICER в ЛПК больных саркоидозом легких. Материалы и методы В исследование включено 68 человек: 32 больных с диагнозом персистирующий саркоидоз легких (средний возраст 41,56±1,27 года) и 36 здоровых доноров (контроль; средний возраст 42,79±1,95 года). Материал для исследований получен при содействии отделения респираторной терапии Республиканской больницы им. В.А. Баранова. Диагноз «саркоидоз легких» установлен на основании клинико-рентгенологических изменений, подтвержден морфологически. У всех пациентов саркоидоз верифицирован гистологически на основании исследования биоптата. Оценены результаты функциональных тестов пациентов, исключая пациентов с диагностируемыми в анамнезе бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). В 4,3% случаев выявлены рестриктивные, в 2,3% - обструктивные нарушения. Данные изменения зарегистрированы у пациентов со II-III стадией заболевания. Снижение диффузионной способности легких выявлено у 3,7 % пациентов [снижение переноса оксида углерода (DLco) и низкое отношение DLco к объему альвеолярного газа (DLco/Vа), что характерно для паренхиматозных нарушений]. Критерии исключения из исследования: наличие сахарного диабета, выраженные нарушения функции внутренних органов, перенесенные в последний месяц инфекционные заболевания, курение табака, беременность и лактация, алкогольная зависимость, индекс массы тела ≥28 кг/м2. Пациенты, включенные в настоящее исследование, не принимали каких-либо лекарственных препаратов (в том числе гормональных) и находились в состоянии ремиссии. Материалом служили пробы периферической крови. Забор венозной крови осуществлялся утром натощак. Информационное согласие получено от всех пациентов. Работа утверждена Этическим комитетом ГБУЗ «Республиканская больница им. В.А. Баранова». Тотальную РНК (тРНК) из клеток крови выделяли на колонках Axyprep Multisource Total RNA Miniprep Kit («Axygen», США). Для удаления остатков ДНК раствор тРНК обрабатывали ДНКазой («Сибэнзим», Россия) (1 е.а.) при 37˚C в течение 30 мин. Синтез комплементарной ДНК (кДНК) осуществляли с помощью набора MMLV RT kit («Евроген», Россия). Экспрессию генов DROSHA и DICER оценивали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на приборе iCycler iQ5 («Bio-Rad», США). Для амплификации использовали наборы qPCRmix-HS SYBR. Последовательность праймеров для ПЦР-РВ («Евроген», Россия) указана в работе X. Guo и соавт. [19]. Уровень экспрессии генов DROSHA и DICER рассчитывали относительно уровня экспрессии референсного гена GAPDH. ПЦР-РВ для каждого образца проводили не менее трех раз. Специфичность продуктов амплификации проверяли плавлением ПЦР-фрагментов. Эффективность ПЦР (98%) оценивали по стандартной кривой. Уровень транскриптов генов вычисляли по ∆∆CT [20]. Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета программ «StatGraphics 2.1.». Достоверность различий уровня транскриптов исследуемых генов между группами оценивали с помощью непараметрического критерия U Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считали достоверными при p<0,05. Данные представлены в виде M±SD (среднее значение ± стандартное отклонение). Исследования выполнены на научном оборудовании Центра коллективного пользования ИБ КарНЦ РАН «Комплексные фундаментальные и прикладные исследования особенностей функционирования живых систем в условиях Севера». Результаты Известно, что при развитии саркоидоза легких наблюдается аберрантная экспрессия некоторых микроРНК [11, 21]. Регистрируемые нарушения могут быть причиной дизрегуляции экспрессии других генов, вовлеченных в патогенез данного заболевания. В проведенном нами исследовании показано, что уровень экспрессии мРНК гена DROSHA в ЛПК больных саркоидозом легких значимо снижен по сравнению с группой здоровых доноров (рис. 1). Также отмечено достоверное снижение количества транскриптов гена DICER в ЛПК исследуемых больных по сравнению с группой контроля (рис. 2). Обсуждение По данным литературы, изменения экспрессии некоторых микроРНК, а также генов, вовлеченных в биогенез микроРНК, таких как DROSHA и DICER, отмечены при ряде иммуновоспалительных заболеваний. Так, снижение транскрипционной активности генов DROSHA и DICER в ЛПК установлено у больных с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы, таких как тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса [10]. Авторы исследования предполагают, что снижение уровня экспрессии указанных генов может приводить к снижению уровня таких микроРНК, как miR-27b, miR-let7f, miR-21, miR-98, которые ассоциированы с развитием воспаления при данных заболеваниях. Снижение количества транскриптов гена DICER в ЛПК показано в исследовании W. Magner и соавт. у больных с рассеянным склерозом в ответ на проводимую терапию IFNβ1a. Авторами исследования показано, что изменение экспрессии гена DICER может коррелировать с тяжестью, клиническим течением патологии и ответом на терапию [9]. Аналогичные результаты по изменению транскрипционной активности указанного гена обнаружены в культуре синовиоцитов, полученных от больных ревматоидным артритом [22]. Однако следует отметить, что при некоторых иммуновоспалительных заболеваниях экспрессия мРНК генов DROSHA и DICER может быть повышена. Так, в работе Rostami Mogaddam M. и соавт. показано достоверное увеличение количества транскриптов указанных генов в клетках биоптатов кожи, полученных от больных псориазом [23]. В проведенном нами исследовании отмечено снижение количества транскриптов генов, ключевых регуляторов биогенеза микроРНК, таких как DROSHA и DICER в ЛПК больных саркоидозом легких. Мы предполагаем, что снижение экспрессии исследуемых генов может играть определенную роль в патогенезе данного заболевания. В ряде работ отмечено, что прогрессия саркоидоза не ассоциирована с изменением каких-либо специфических, характерных для данного заболевания иммунологических параметров. Хотя наблюдаемое при данной патологии гранулематозное воспаление характеризуется повышением продукции протеолитических ферментов, цитокинов, лигандов/рецепторов хемокинов и других молекул с иммунорегуляторными функциями [24, 25]. Экспрессия этих провоспалительных факторов может модулироваться различными микроРНК, регулирующими важные сигнальные пути в клетке. По мнению ряда авторов, изменение экспрессии некоторых микроРНК, которое наблюдается в различных типах клеток при саркоидозе легких, может играть определенную роль в патогенезе данного заболевания и выступать в качестве прогностическогого маркера развития и прогрессирования патологии [11]. Заключение Результаты проведенного нами исследования показали, что уровень экспрессии генов DROSHA и DICER в ЛПК снижается при развитии саркоидоза легких, что может вносить определенный вклад в патогенез данного заболевания. Однако функциональная значимость снижения количества транскриптов генов, вовлеченных в биогенез микроРНК, до конца не выяснена. Финансовое обеспечение исследований осуществлялось из средств гранта Правительства РФ по постановлению № 220 (договор № 11.G34.31.0052) и федерального бюджета на выполнение государственного задания (тема № 0221-2014-0034).

About the authors

I E Malysheva

IB KarRC RAS, laboratory of genetics

Email: i.e.malysheva@yandex.ru
Petrozavodsk, Russia

O V Balan

IB KarRC RAS, laboratory of genetics

Petrozavodsk, Russia

E L Tikhonovich

Republican Hospital named after. V.A. Baranov

Petrozavodsk, Russia

T O Volkova

Petrozavodsk state University, Department of Hospital Therapy

Petrozavodsk, Russia

References

Supplementary files