Identification of Shiga toxin in patients with acute intestinal infections in the presence of mono- and mixed-O-antigens of pathogens

Full Text

Аг — антигены АгШТ — антиген Шига-токсина КФ — копрофильтрат ОКИ — острые кишечные инфекции РКА — реакция коагглютинации ШТ — Шига-токсина ШПТ— шигаподобные токсины Кишечные инфекционные заболевания занимают одно из ведущих мест в структуре инфекционной патологии и являются актуальной проблемой здравоохранения; для них характерны полиэтиологичность, трудности диагностики и лечения, возможность неблагоприятных исходов и последствий [1]. Диаррейные заболевания остаются ведущей причиной заболеваемости и смертности детей в мире [2, 3]. Вследствие полиэтиологичности и разнообразия клинической картины верификация диагноза острых кишечных инфекций (ОКИ) трудна, далеко не полная и не всегда убедительна, в результате чего в 65% случаев ОКИ не удается установить возбудитель. Бактериальные токсины являются ведущими факторами патогенности при кишечных инфекционных заболеваниях, они на молекулярном уровне изменяют внутриклеточные процессы — дифференцировку, пролиферацию, рост, метаболизм чувствительных клеток, нарушают их эффекторные функции, вплоть до гибели клеток. Активное участие в развитии инфекционного процесса на клеточном уровне оказывает и системное действие бактериальных токсинов на организм. В настоящее время установлены химическая структура, генетический контроль, основные механизмы действия многих токсинов возбудителей [4, 5]. У энтеробактерий наиболее мощным и часто встречающимся является семейство Шига-токсинов (ШТ) [5—10]. ШТ и шигаподобные токсины (ШПТ) продуцируются Shigella dysenteriae (серотип 1), энтерогеморрагическими Escherichia coli и рядом других энтеропатогенных бактерий [5, 9, 11—14]. Так, из окружающей среды и кала больных ОКИ изолированы штаммы Acinetobacter haemolyticus [12], штаммы Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus [14], Citrobacter freundii, Enterobacter, продуцирующие ШПТ, что подтверждает потенциальную возможность его выработки более широким спектром микробов вследствие горизонтального переноса генов [13]. Среди штаммов, принадлежащих к различным видам и родам семейства Enterobacteriaceae, антигена ШТ (АгШТ) обнаруживался у всех штаммов S. dysenteriae-1 и их О(—)-мутантов, различных Escherichia coli, Shigella flexneri различных сероваров, кроме VІ, сальмонелл и йерсиний псевдотуберкулеза и не выявлялся у S-форм S. flexneri VІ (Ньюкасл), Shigella boydii, Shigella sonnei, S. dysenteriae 2 и Salmonella typhi. При этом установлено отсутствие продукции ШПТ при наличии у штаммов энтеробактерий способности синтезировать кислые полисахаридные К- (В-) антигены (Аг), независимо от принадлежности их к тому или другому роду или виду бактерий. При этом неважно, находится ли он в S- или в R-форме, так как О— мутанты (R-форма) этих бактерий также синтезируют АгШТ. При утрате штаммами способности синтезировать К-Аг в процессе мутации в сторону К(—) О(+) или К(—) О(—) у этих мутантов появляются способность синтезировать ШТ [11]. Как правило, для диагностики бактериальных кишечных инфекций используют бактериологический метод, реакцию непрямой гемагглютинации, реже — иммуноферментный анализ и полимеразную цепную реакцию, в то время как другие методы диагностики, не связанные с культивированием микробов, в том числе быстрые методы прямого выявления факторов патогенности возбудителей в биосредах, в первую очередь токсинов патогенов, в практике лабораторной диагностики используются редко [13—16]. Это приводит к относительно запоздалой диагностике. Между тем разработка простых тестов поставлена ВОЗ в качестве важной научной задачи, решение которой способствует улучшению диагностики и лечения многих инфекционных заболеваний [15, 16]. Выявлению ШПТ посвящены в основном работы, связанные с эпидемиологией, патогенезом, клиническими проявлениями и осложнениями эшерихиозов, в то время как ШТ и ШПТ при таких распространенных заболеваниях, как шигеллезы и сальмонеллезы и других кишечных инфекциях, изучены недостаточно в связи с отсутствием экономичных простых быстрых тест-систем. Недостаточно данных о выявлении специфических токсинов возбудителей непосредственно в биосредах организма больных ОКИ — липополисахаридов (ЛПС) различной специфичности и истинных токсинов, динамики продукции антишигатоксических антител, скорости и интенсивности формирования специфических антитоксических комплексов антиген—антитело (ЦИК), которые могли бы послужить основой разработки новых диагностических и прогностических критериев. Информация о возможной продукции возбудителем ШПТ или непосредственном наличии ШПТ в организме чрезвычайно важна при назначении антибактериальных препаратов больным ОКИ: возникает гибель бактерий, но под действием некоторых антибиотиков литический цикл бактерий запускает стимуляцию продукции ШТ, усиливающего тяжесть заболевания и увеличивает распространение генов, кодирующих продукцию ШПТ [5, 9, 13]. Идентификация TLR4 в качестве рецептора ШТ на нейтрофилах человека [10] открывает новые звенья патогенеза заболеваний, вызываемых штаммами, продуцирующими ШТ, и обусловливает необходимость изучения патогенеза моноинфекций в сравнении с микст-инфекциями ввиду возможных различий в динамике показателей ШТ и интоксикационного синдрома в целом у больных с различной ЛПС/О-антигенной «нагрузкой» на организм и опосредованным цитокинами синергизмом воздействия ШТ и ЛПС/О-антигенов кишечных патогенов на организм. Цель работы: изучить динамику частоты выявления и уровни маркера ШТ в кале и составе специфических антишигатоксических ЦИК у больных ОКИ на фоне циркуляции в организме моно- и микст-ЛПС/О-антигенов различных возбудителей кишечных инфекций. Материалы и методы Обследовали 147 больных, госпитализированных с предварительным диагнозом бактериальное пищевое отравление неуточненной этиологии; 90% больных в возрасте от 15 до 55 лет. Бактериологическое подтверждение диагноза получено у 19% больных, в том числе Salmonella enteritidis и Salmonella typhimurium в 15% случаев, шигеллы S. sonnei и S. flexneri 2а в 4%. Заболевания имели среднетяжелое течение. Для уточнения этиологии заболеваний дополнительно к бактериологическому исследованию проведено иммунологическое исследование (реакция коагглютинации — РКА) с целью выявления в кале больных ЛПС/О-антигенов. Исследования проводили в остром периоде и в период ранней реконвалесценции с набором антительных диагностикумов на основе натуральных антител к S. sonnei, S. flexneri 1—6, S. dysenteriae 1, Salmonella В, С1, С2, D, E серогрупп, Yersinia pseudotuberculosis І и ІІІ, Yersinia enterocolitica О3, О7,8, О9, О4,33, О6,30, Campylobacter (на основе смеси сывороток к C. jejuni, C. coli, C. lari). Определение ЛПС/О-антигенов в кале проводили в РКА на стекле в прогретых (100 °С, 30 мин) и осветленных центрифугированием (2000 об/мин, 30 мин) копрофильтратах (КФ). АгШТ в КФ и IgG ЦИК определяли с помощью РКА на планшетах полуколичественным методом. Тест-системы для РКА на стекле и планшетах изготовлены в ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи М.З. Р.Ф. Подробно методики получения ЛПС/О-антигенов и ШТ, изготовления коагглютинирующих тест-систем и постановки РКА описаны ранее [11, 17—19]. В качестве контрольной группы исследованы кал и сыворотка крови (IgG ЦИК) от 40 доноров крови. Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием параметрических (критерий t Стьюдента) и непараметрических методов (χ2) анализа по программам Excel и Biostatistica for Windows. Результаты В результате бактериологического и иммунологического (РКА) исследований моноинфекция бактериальными возбудителями ОКИ (из числа перечисленных) выявлена в 32% случаев, микст-инфекция — в 68%, при этом в пробе материала определялись 2 ЛПС/О-антигенов и более разной специфичности. В соответствии с целью и задачами нашей работы изучены частота выявления и уровни маркера ШТ в пробах КФ и в составе IgG ЦИК сыворотки крови в РКА на планшетах с соответствующими тест-системами у больных ОКИ в динамике заболевания. В отдельных пробах материалов титры АгШТ колебались от 1:2 до 1:4096. В контрольной группе лиц АгШТ выявлен в диапазоне титров от 1:2 до 1:4. Учитывая результаты исследования в контрольной группе и частоту выявления АгШТ в определенном титре, мы условно приняли в качестве диагностического титр, равный 1:8, для АгШТ в кале и титр 1:4 — для АгШТ в IgG ЦИК. В общей группе АгШТ в кале в титре ≥1:8 найден у 25,2% больных, в IgG-ЦИК в титре ≥1:4 — у 90,5% (табл. 1), Таблица 1. Частота выявления (в%) и уровни (lg10 обратного титра) АгШТ в кале и IgG ЦИК у 147 больных ОКИ в динамике заболевания Примечание. Различия достоверны (р≤0,01) по сравнению * — с донорами, ** — с первым анализом. что достоверно превышало показатели у доноров (р≤0,01) и свидетельствовало об определенном уровне иммунитета к ШТ у больных ОКИ. Частота выявления АгШТ в парных анализах кала и парных анализах IgG-ЦИК была практически одинаковой. В динамике заболевания в кале происходило достоверное снижение уровня АгШТ, а в составе IgG-ЦИК — его увеличение (р≤0,01), что вполне закономерно: на фоне снижения интоксикации и токсической нагрузки увеличивался уровень среднемолекулярных антител и связывание ШТ в иммунные комплексы. У больных моноинфекцией частота выявления АгШТ в первом и втором анализах кала также превышала показатели у доноров (табл. 2) Таблица 2. Частота выявления (в %) и уровни (lg10 обратного титра) выявления маркера ШТ в кале и ЦИК у больных моно- и микст-ОКИ в динамике заболевания Примечание. Различия достоверны по сравнению * — с донорами (р≤0,01), ** — с первым анализом (р≤0,05), *** — с моноинфекцией (р≤0,05). и в динамике заболевания достоверно снижалась, в IgG-ЦИК — была выше, чем у доноров, в динамике заболевания не изменялась. При микст-инфекции частота выявления АгШТ в кале также достоверно превышала таковую у доноров, в динамике заболевания не изменялась и в результате этого становилась выше, чем во втором анализе кала при моноинфекции. В IgG-ЦИК частота выявления АгШТ была выше, чем у доноров, в динамике заболевания превышала показатели при моноинфекции в те же сроки. Уровни АгШТ при микст-инфекции в кале и в IgG-ЦИК превышали уровни у доноров, в первом и втором анализах кала они несколько выше, чем при моноинфекции, и также достоверно снижались в динамике заболевания. В IgG-ЦИК уровни АгШТ в динамике заболевания увеличивались в отличие от монотонных уровней при моноинфекции и в результате во втором анализе превышали показатели при моноинфекции в те же сроки (р≤0,05). Таким образом, при микст-инфекции в кале и IgG-ЦИК отмечены более высокая частота и уровни АгШТ, чем при моноинфекции, при этом в обеих группах больных сохранялась динамика к снижению показателей в кале и рост в IgG-ЦИК. При выписке больных из стационара АгШТ в кале сохранялся в титре 1:8 и выше у 4% больных, что свидетельствовало об отсутствии полной санации организма от возбудителя. Обсуждение АгШТ и ШПТ являются достоверными маркерами наличия в организме штаммов патогенных возбудителей, способных продуцировать эти важные факторы патогенности. Учитывая возможность продукции ШПТ широким спектром кишечных бактериальных патогенов и их отдельных штаммов, выявление его можно расценивать как диагностический поливалентный маркер присутствия патогенных возбудителей в организме. При анализе и интерпретации данных о выявлении АгШТ следует учитывать, какой биоматериал исследован. Так, выявление АгШТ в кале в свободном виде свидетельствует об активной продукции токсина в организме, в то время как его выявление в составе ЦИК — об иммунном ответе на АгШТ, а именно, о продукции антишигаспецифических антител, которые связываются с ШТ в иммунные комплексы, циркулирующие в сыворотке крови. В связи с этим мы изучили присутствие антигена ШТ в этих биоматериалах — кале и сыворотке крови. Впервые проведено исследование по оценке динамики частоты выявления АгШТ в кале и в составе среднемолекулярных IgG-ЦИК, осажденных из сыворотки крови, при острых моно- и микст-кишечных инфекциях различной этиологии. В общей группе больных в динамике заболевания отмечено достоверное снижение уровней АгШТ в кале и их рост в IgG-ЦИК при неизменной частоте его выявления. У больных моно- и микст-инфекциями динамика этих показателей значительно различалась. Больные микст-инфекцией имели изначально более высокие уровни АгШТ в кале с последующим достоверным снижением в динамике заболевания, однако частота выявления АгШТ в кале не снижалась и превышала частоту при моноинфекции. Это приводило к тому, что при микст-инфекции в составе IgG-ЦИК отмечались достоверно более высокая частота выявления и уровни АгШТ в сравнении с моноинфекцией, характеризовавшейся отсутствием увеличения частоты и уровней АгШТ в динамике заболевания. Это могло быть обусловлено более сильной и длительной стимуляцией иммунитета при микст-инфекции. Таким образом, при ОКИ у 25,2% больных в ранние сроки заболевания в кале определяется свободный АгШТ, частота его выявления и уровни при микст-инфекции достоверно выше, чем при моноинфекции. При микст-инфекции, когда в организме больного выявлено наличие нескольких возбудителей (по их ЛПС/О-антигенам), мы определяем также достоверное увеличение уровня АгТШ в составе среднемолекулярных IgG-ЦИК в сыворотке крови, что свидетельствует об активном иммунном ответе организма на возбудитель. Заключение Учитывая наличие штаммов, продуцирующих АгШТ у больных бактериальными ОКИ, следует осторожно подходить к выбору антибактериального препарата с целью предотвращения горизонтального переноса генов, усиления продукции токсина и интоксикации организма. Метод коагглютинации на стекле и планшетах характеризуется простотой выявления основных факторов патогенности широкого спектра основных возбудителей кишечных инфекций (ЛПС/О-антигенов и ТШ) и быстротой при высокой чувствительности и специфичности. Достоинством метода является возможность быстрого изменения спектра тест-систем в зависимости от региона их использования и эпидемиологической обстановки. Авторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.

About the authors

O F Belaia

Yu V Yudina

E V Volchkova

O A Payevskaya

Yu A Belaya

N M Gyulazyan

S N Zuyevskaya

References

Supplementary files