Clinical presentation of Ixodes tick-borne borreliosis caused by Borrelia miyamotoi in the context of an immune response to the pathogen

Full Text

АлАТ — аланинаминотрансфераза АТ — антитела ИКБ — иксодовый клещевой боррелиоз ИКБ-БМ — ИКБ, вызываемый Borreliamiyamotoi КВЛ — клещевые возвратные лихорадки ККС — коэффициент корреляции Спирмена КПТ — комплексный показатель тяжести КЭ — клещевой энцефалит ЛБ — лаймская болезнь МИ — межквартильный интервал МЭ — мигрирующая эритема ПЦР — полимеразная цепная реакция СКФ — скорость клубочковой фильтрации СОС — стандартизованный оптический сигнал СРБ — С-реактивный белок ЧСС — частота сердечных сокращений GlpQ — glycerophosphodiester phosphodiesterase VMPs — variable major proteins Иксодовый клещевой боррелиоз, вызванный Borrelia miyamotoi (ИКБ-БМ), — ранее неизвестное инфекционное заболевание, открытое в России [1, 2]. Клинические особенности этого заболевания на примере 46 больных из Свердловской области в 2009 г. и 71 больного из Удмуртской Республики в 2010—2012 гг. рассмотрены ранее [2—4]. По данным этих исследований, ИКБ-БМ в отличие от «классического» иксодового боррелиоза — лаймской болезни (ЛБ), вызываемой B. burgdorferi sensu lato, представляет собой генерализованную инфекцию с преобладанием лихорадочного синдрома и возможностью развития умеренно выраженных и преходящих нарушений функций печени, почек, сердца и других органов [3—6]. Течение заболевания рассматривалось лечащими врачами как среднетяжелое или реже легкое. Впервые выявленная инфекция привлекает внимание в силу ряда обстоятельств. Во-первых, возбудитель B. miyamotoi обнаруживается повсеместно в иксодовых клещах, распространенных в зонах умеренного климата Евразии и Северной Америки [7, 8]. Во-вторых, вид B. miyamotoi генетически принадлежит к группе боррелий — возбудителей клещевых возвратных лихорадок (КВЛ). Эти лихорадки протекают тяжело, в Африке в отсутствие адекватной терапии летальность при КВЛ может достигать нескольких десятков процентов [9—11]. В-третьих, показано, что у пациентов со сниженным иммунитетом инфекция B. miyamotoi может сопровождаться таким угрожающим жизни осложнением, как менингоэнцефалит [12, 13]. Несмотря на то что выявление больных ИКБ-БМ включено в рабочие планы ряда профильных европейских и американских лабораторий, до настоящего времени оно не вполне успешно из-за трудности выявления ИКБ-БМ на фоне многочисленных лихорадочных заболеваний с неспецифическими симптомами и неразвитости средств лабораторной диагностики этой инфекции. Однако, по мнению американских специалистов, распространенность ИКБ-БМ в США как минимум сопоставима с распространенностью других клещевых инфекций, таких как анаплазмоз и бабезиоз [8, 14, 15]. Цель настоящей работы — сбор и анализ нового массива данных по клинической картине ИКБ-БМ в России, подтверждение или опровержение представления об ИКБ-БМ как об инфекции среднетяжелого течения без летальных случаев, уточнение списка наиболее типичных клинических проявлений ИКБ-БМ. Развитие лабораторной базы, в частности разработка в ЦНИИ эпидемиологии методов измерения бактериальной нагрузки в крови при ИКБ-БМ и оценки спектра и интенсивности антительного ответа на основные специфические антигены B. miyamotoi, позволило рассмотреть клиническую картину этой инфекции в контексте взаимодействия возбудителя с иммунной системой организма человека. Материалы и методы Исследованные группы пациентов. Исследование проведено на базе ООО МО «Новая больница» Екатеринбурга в эпидемический сезон (июнь—июль) 2010, 2011, 2015 и 2016 гг. Критерием включения в исследование служило подозрение на клещевую инфекцию. Применяли как стандартные диагностические методы (определение антител — АТ — IgM и IgG к боррелиям и вирусу клещевого энцефалита — КЭ), так и оригинальные методики специфических полимеразных цепных реакций (ПЦР), выявляющих ДНК B. miyamotoi или B. burgdorferi s.l., описанные в деталях ранее [1, 2]. ИКБ-БМ диагностировали на основании выявления ДНК B. miyamotoi в крови больного в отсутствие лабораторных признаков иных инфекций. Всего выявлено 117 случаев ИКБ-БМ; 10 случаев предположительной микст-инфекции B. miyamotoi и вируса КЭ в данной работе не рассматриваются. При этом 53 случая ИКБ-БМ в 2015—2016 гг. дополнительно подтверждены путем выявления специфических АТ (см. ниже). Диагноз Л.Б. устанавливали на основании типичной мигрирующей эритемы (МЭ) размером более 5 см, что допускается отечественными и международными стандартами диагностики [16, 17]. В группу сравнения (больные с ЛБ, моноинфекцией B. burgdorferi s.l.) случайным образом отобран 71 пациент. При этом у 15 из них диагноз ЛБ подтвержден методом ПЦР, а у 52 выявлены АТ к боррелиям с помощью зарегистрированной коммерческой тест-системы («Euroimmun», Германия). Сравниваемые группы сопоставимы по полу и возрасту. Доля мужчин среди больных ИКБ-БМ (59%) статистически незначимо выше, чем у больных ЛБ (45%; p=0,072; критерий Фишера). Средний возраст (медиана) у пациентов с ЛБ (60 лет) выше, чем у больных ИКБ-БМ (57 лет; p=0,051; критерий Манна—Уитни). В целом возраст пациентов находился в диапазоне от 15 до 88 лет. Методы выявления специфических АТ кB. miyamotoi. У видов группы B. burgdorferi sl. и B. miyamotoi есть несколько общих мембранных белков-антигенов, в результате чего зарегистрированные тест-системы не способны дифференцировать иммунный ответ на эти инфекции. Однако фермент GlpQ не синтезируется B. burgdorferi s.l., но встречается у B. miyamotoi. Недавно показано, что B. miyamotoi способна экспрессировать также ряд высокоиммуногенных вариабельных поверхностных белков (variable major proteins— VMPs), в частности белки Vlp15/16, Vlp18, Vsp1 и Vlp5 [18]. Разработанный в ЦНИИ эпидемиологии планарный белковый биочип включает белки-антигены как B. burgdorferi s.l. (B. afzelii — p100, VlsE, p39, p41, p58, BBK32, OspC, p17; B. garinii — p100, VlsE, p41, BBK32, OspC, p17), так и B. miyamotoi (GlpQ, Vlp15/16, Vlp18, Vsp1, Vlp5), для которых получены генно-инженерные конструкции, кодирующие антигенную область, фрагмент белка или полную последовательность белка. Антигены экспрессированы в Escherichia coli и очищены методами аффинной и ионообменной хроматографии. Иммуночипы изготовляли на слайдах с альдегидным покрытием 3D-Aldehyde Glass Slides («PolyAn», Германия) с помощью плоттера для бесконтактной пьезопечати S3 («Scienion AG», Германия). Учет результатов анализа после нанесения на иммуночип сыворотки крови больных и вторичных АТ к иммуноглобулинам человека проводили с помощью многоканального флюоресцентного сканера MarS («Ditabis», Германия), а подсчет, стандартизацию и интерпретацию результатов — с использованием специально разработанного программного обеспечения StarSky. Уровень специфических АТ IgM и IgG характеризовали полуколичественным способом по величине стандартизованного оптического сигнала (СОС). На основании исследования сывороток здоровых доноров и больных с иными заболеваниями СОС больше 5 условных единиц (усл. ед.) считали превышающей пороговый уровень, который свидетельствует о наличии исследуемых АТ в образце [19]. Количественная ПЦР. Бактериальную нагрузку в крови больных ИКБ-БМ измеряли в копиях в 1 мл с помощью количественных ПЦР в реальном времени, амплифицирующих 16S РНК или ДНК гена 16S РНК, с использованием калибровочных кривых с раститровкой соответствующих мишеней от 107 до 103 копий на 1 мл [1, 2]. Статистические методы. Эпидемиологические и клинико-лабораторные данные сохраняли в базе данных, имеющей более 100 полей на каждую запись (пациента). Все статистические расчеты и оценки проведены с помощью лицензионной программы IBM SPSS Statistics 19 [20]. Для оценки значимости различий распределений количественных и качественных переменных в группах использовали стандартные непараметрические методы [21]. Результаты представлены в виде медианы и межквартильных интервалов (в скобках). Результаты Из анамнеза 116 из 117 больных ИКБ-БМ и 68 больных ЛБ из 71 достоверно известно, что заболевание возникло после присасывания иксодового клеща. Удалили клеща в день присасывания (65%) 75 больных ИКБ-БМ и 36 (52%) больных ЛБ (р=0,007). Инкубационный период был несколько длиннее для ИКБ-БМ, чем для ЛБ: 14 (11—17) дней у ИКБ-БМ и 12 (8—19 дней) у ЛБ (р=0,02). Начало ИКБ-БМ было острым и больные госпитализировались в среднем на следующий день (от 1 до 2 дня) после появления клинических симптомов, больные ЛБ — на 4-й день (от 2 до 13 дней; р=10–14). Лечение в стационаре ИКБ-БМ более длительное, чем лечение ЛБ: 13 (11—15) и 10 (10—11) дней соответственно (р=10–14). Для ИКБ-БМ типичны клинические проявления лихорадочного синдрома, редко встречающиеся у больных ЛБ (табл. 1); Таблица 1.Частота выявления клинических симптомов у обследованных больных ИКБ Примечание. Данные представлены в виде медианы (межквартильный интервал), * — в расчете на одного больного, из 22 регистрируемых симптомов, наличие МЭ не учитывается. у 37% больных ИКБ-БМ определяются более 4 соответствующих симптомов заболевания. МЭ при ИКБ-БМ практически отсутствует, поэтому ранее это заболевание клинически классифицировалось как ИКБ в безэритемной форме. Наличие в 5% случаев МЭ при ИКБ-БМ, вероятно, свидетельствует о микст-инфекции B. miyamotoi и B. burg-dorferi s.l. Напротив, лишь у одного больного ИКБ в безэритемной форме в крови обнаружена ДНК B. burgdorferi s.l., что стало основанием поставить диагноз ЛБ в генерализованной форме. Основные количественные лабораторные показатели, отличающие ИКБ-БМ от ЛБ, приведены в табл. 2. Таблица 2. Данные лабораторного обследования больных в разгаре ИКБ Примечание. * — указана доля больных, у которых значение показателя было выше (или ниже) приведенной границы; ** — определение и правила подсчета КПТ приведены в тексте. Прочие общеклинические и биохимические показатели крови и мочи не выходили за пределы физиологической нормы или статистически значимо не различались в обследуемой группе и группе сравнения, и в таблице не приводятся. СКФ — скорость клубочковой фильтрации; АлАТ — аланинаминотрансфераза; СРБ — С-реактивный белок; КПТ — комплексный показатель тяжести. В сравнительном аспекте можно выделить несколько типов симптомов. Во-первых, непосредственные проявления лихорадки и генерализованной воспалительной реакции — высокая температура тела, повышенная ЧСС, высокий уровень СРБ, появление палочкоядерных нейтрофилов в периферической крови, отчасти протеинурия. Во-вторых, лейкопения (за счет лимфопении в отсутствие нейтрофильного плеоцитоза) и собственно лимфопения, гранулоцитопения и тромбоцитопения, что, вероятно, указывает на активацию и «потребление» данных клеток крови при инфекции B. miyamotoi. В-третьих, начальные признаки нарушения функций почек — повышение концентрации креатинина и, как более точный показатель, снижение СКФ (CKD-EPI) по креатинину, рассчитываемой с корректировкой на пол и возраст больных. В-четвертых, повышение почти у 50% больных ИКБ-БМ концентрации печеночных ферментов в крови, в первую очередь АлАт. Следует отметить, что нарушения по этим группам показателей, по-видимому, независимы и не коррелируют друг с другом или с выраженностью клинических проявлений заболевания. За исключением очевидных связей (доля и количество клеток и т. п.) статистически значимые, хотя и слабые корреляции отмечены только для температуры тела и уровня СРБ (коэффициент корреляции Спирмена — ККС=0,32), СРБ и уровня белка в моче (ККС=0,47), количества тромбоцитов и лимфоцитов (ККС=0,24; р<0,05). Поскольку патологические проявления не дублируют, но дополняют друг друга, их совместное воздействие можно отразить на некоторой шкале комплексного показателя тяжести (КПТ) боррелиоза. Для построения шкалы использованы следующие 13 показателей: температура тела, ЧСС, количество лейкоцитов, количество нейтрофилов, доля палочкоядерных нейтрофилов, количество лимфоцитов, количество тромбоцитов, уровень креатинина в крови, СКФ, уровень АлАт, концентрация СРБ, протеинурия (см. табл. 2) и «суммарное число симптомов заболевания» (см. табл. 1). Если значения показателя у конкретного больного выходили за референтные, указанные в табл. 1, 2, в патологическую область, то его вклад в КПТ оценивали в 1. (исключение составляла температура тела, считавшаяся высокой, вклад — 1 при значениях выше 39,2 °С). Средний КПТ при ИКБ-БМ (5,7±1,9) в 5 раз превышал КПТ при ЛБ (1,1±1,1). Боррелиозом с повышенной тяжестью течения далее будет считаться заболевание с КПТ 5 или выше: к нему отнесено 71% случаев ИКБ-БМ и 1 из 71 случая ЛБ (см. табл. 2). Концентрация ДНК и РНК B. miyamotoi измерена по гену 16S РНК в крови 19 больных ИКБ-БМ при поступлении в стационар и в динамике в течение 5 дней. Как показатель уровня бактериемии далее будет использована только концентрация ДНК/РНК при поступлении, поскольку в ходе лечения она резко падает и на 3—4-й день в стационаре определяется только у 2 больных, а на 5-й день не выявляется. Среднюю величину и диапазон концентраций правильнее анализировать и представлять в логарифмических единицах, поскольку распределение концентраций сильно скошенное (не гауссовское), а распределение Log10[концентрации] — «нормальное», колоколообразное. Медиана Log10[ДНК] при поступлении равна 4,0 (3,4—4,3), т. е. концентрация ДНК равна 10 000 копий/ мл; медиана Log10[РНК] при поступлении равна 4,3 (3,3—4,8). Размах уровня РНК B. miyamotoi в крови от 0 до 420 000 копий/мл. Количество РНК коррелирует с количеством ДНК (ККС=0,83), но в среднем в 2,5 раза превышает количество ДНК. Это указывает на то, что перед взятием образца в момент поступления больного происходило размножение боррелий, хотя и не слишком активное. Концентрация ДНК (и РНК) B. miyamotoi в крови обратно коррелирует с инкубационным периодом (ККС=–0,55) и длительностью промежутка времени между началом заболевания и госпитализацией (ККС=–0,40), т. е. спирохетемия максимальна, когда заболевание развивается сравнительно быстро (рис. 1, а). Рис. 1. Связь бактериальной нагрузки в крови с эпидемиологическими и лабораторными показателями при ИКБ-БМ. Концентрация ДНК B. miyamotoi в крови в разгаре ИКБ-БМ выражена в копиях генома на 1 мл и представлена на графиках по логарифмической шкале, как Log10[концентрация ДНК]. а — совмещены два графика — зависимость Log10[концентрация ДНК] от инкубационного периода заболевания (кружки) и интервала между появлением симптомов до госпитализации (квадраты); отдельные точки соответствуют значениям, зарегистрированным для каждого из 19 изученных больных; сплошные линии представляют собой аппроксимацию зависимости между переменными по осям X и Y, выполненную методом наименьших квадрантов с локальным взвешиванием по функции ядра Епанечникова. Горизонтальные штриховые линии (б—з) соответствуют границе между «нормальными» (референтными) и «патологическими» значениями показателей, отложенных по оси Y. Концентрация ДНК B. miyamotoi коррелирует с температурой тела в стационаре (ККС=0,34), ЧСС при поступлении (ККС=0,60) и суммарным числом клинических симптомов заболевания (ККС=0,48), т. е. с непосредственными проявлениями лихорадочного синдрома (см. рис. 1, б—г). Неожиданным оказалось, что при высокой концентрации ДНК B. miyamotoi слабее выражены тромбоцитопения (ККС=0,51) и нейтропения (ККС=0,51), ниже уровень креатинина в крови (ККС=–0,38) и белка в моче (ККС=–0,43) (см. рис. 1, д—з). Вероятно, эти наблюдения объясняются тем, что на пике спирохетемии данные нарушения еще не успевают проявиться, а в процессе взаимодействия иммунной системы с патогеном не только падает концентрация боррелий в крови, но и снижается количество эффекторов-клеток крови, а также развивается органная патология. В силу разнонаправленности связей уровня спирохетемии с патологическими проявлениями ИКБ-БМ корреляций концентрации ДНК или РНК B. miyamotoi с КПТ не обнаружено. Концентрация специфических IgM и IgG измерялась дважды: при поступлении больного ИКБ-БМ (в среднем на 2-й день заболевания) и при выписке (в среднем на 14-й день заболевания). Хотя с помощью иммуночипа оценен иммунный ответ на широкий спектр антигенов (см. раздел «Материалы и методы»), из которых наибольший интерес вызывают АТ к основным вариабельным поверхностным белкам (VMPs) различных семейств (Vlp15/16, Vlp18, Vsp1 и Vlp5), в данной публикации для простоты ответ на VMPs будет характеризоваться наибольшим ответом на 1 из 4 VMPs. Кроме того, будет рассмотрен ответ на GlpQ, специфический фермент боррелий — возбудителей КВЛ. При поступлении только 4 из 32 обследованных больных ИКБ-БМ имели АТ IgM к GlpQ и всего 1 больной — IgG (и IgM) АТ (рис. 2). Рис. 2. Концентрация специфических IgM и IgG АТ против GlpQ и VMPs в крови больных ИКБ-БМ при госпитализации (а, б) и выписке из стационара (в, г). Концентрация АТ IgM и IgG против GlpQ и VMPs измерена с помощью иммуночипа и выражена в условных единицах по величине СОС. Горизонтальные и вертикальные штриховые линии соответствуют порогам между значениями СОС, указывающими на достоверное наличие АТ, и значениями СОС в отсутствие или при низком уровне А.Т. Отдельные точки соответствуют значениям, зарегистрированным для каждого из 32 изученных больных: 21 больного с более тяжелым течением ИКБ-БМ (белые кружки) и 11 больных с менее тяжелым течением (черные кружки) На рис. а, г и особенно б многие точки лежат в области, соответствующей отсутствию АТ (левый нижний квадрант) и отчасти перекрывают друг друга. Стрелками указаны данные больных, поступивших на 29-й и 44-й дни после присасывания клеща, вероятно, во время рецидива ИКБ-БМ. Примечательно, что этот больной госпитализирован через 29 дней после присасывания клеща, а за 18 дней до этого в анамнезе у него имелось серьезное недомогание, вероятно, спровоцированное первым эпизодом ИКБ-БМ, но диагностированное как соматическое заболевание. Иммунный ответ на поверхностные антигены VMPs развивается раньше, при поступлении уровень АТ IgM и IgG к VMP превышал пороговый у 10 и 4 больных соответственно. При выписке 26 и 28 больных имели АТ IgM соответственно к GlpQ и VMPs. Только у 1 больного из 32 отсутствовали АТ IgM как к GlpQ, так и к VMPs. АТ IgG к VMPs и GlpQ вырабатываются у 19 и 14 больных соответственно (см. рис. 2); у 11 (34%) больных еще не обнаруживались специфические АТ. (По нашим данным, максимальный уровень АТ IgG к B. miyamotoi достигается через 30—90 дней после заболевания ИКБ-БМ.) При выписке уровень специфических АТ варьировал в широких пределах: от 5 усл. ед. (пороговое значение) до 50 усл.ед. по величине СОС. Статистически значимых корреляций уровня АТ с индивидуальными особенностями острой фазы заболевания, в том числе с показателями, перечисленными в табл. 1, 2, и концентрацией ДНК и РНК B. miyamotoi при поступлении, не выявлено. При этом у 21 (66%) из 32 пациентов наблюдалось повышенная тяжесть течения ИКБ-БМ. В этой подгруппе больных (см. рис. 2, в, г, белые кружки) уровень IgM к VMPs и GlpQ ниже, чем в подгруппе 11 лиц с менее тяжелым течением (p=0,005 и р=0,05 по критерию Манна—Уитни соответственно). Уровни специфических IgG при выписке в этих подгруппах не различаются. Обсуждение Результаты этого и параллельных исследований [3—6, 22] подтверждают широкое распространение инфекции B. miyamotoi в России и укрепляют представление об ИКБ-БМ как о заболевании среднетяжелого течения без летальных исходов и инвалидизирующих последствий. Становится возможным с патогенетических позиций проследить стадийность развития инфекции. Заражение происходит быстро, как правило, в 1-й день присасывания клеща, что выявляется и в опытах на животных [23] и объясняется изначальным присутствием возбудителя в слюнных железах клеща-переносчика. В течение инкубационного периода происходит медленный, вероятно экспоненциальный, рост популяции боррелий. Если предположить, что характеристики роста приблизительно такие же, как в условиях in vitro [24] (удвоение каждые 28 ч), то за 14 сут 1 боррелия должна дать около 4000 потомков, что ниже среднего уровня спирохетемии при поступлении (11 000 копий/мл, или 33 млн на 3 л плазмы крови). Согласовать это расхождение можно двумя способами: либо предположив, что in vivo время удвоения популяции короче — около 14 ч, либо начальная инфицирующая доза не одна, а около 10 000 боррелий. Весьма вероятно, истина посередине: инфицирующая доза лежит в пределах от10 до 1000 боррелий, а время их удвоения — от 16 до 24 ч. Острое начало заболевания, характеризующееся максимальной выраженностью лихорадочного синдрома, соответствует пику спирохетемии. У некоторых больных оно приходится на догоспитальную стадию, у некоторых при своевременной госпитализации наблюдается в стационаре. Остается неясным, что является причиной лихорадки, поскольку липополисахарида (эндотоксина), основного пирогена многих бактерий, боррелии не производят [9—11]. Однако при добавлении клинических штаммов B. miyamotoi в кровь человека in vitro нам удалось зарегистрировать продукцию провоспалительных цитокинов, в частности интерлейкина-6, сравнимую с эффектом добавления эндотоксина (неопубликованные данные). На этом этапе, предположительно, только начинается выработка специфических АТ, в первую очередь IgM к VMPs, поскольку большинство больных подходят к пику лихорадки в отсутствие АТ в крови. Далее спирохетемия и общие воспалительные реакции провоцируют микроциркуляторные нарушения [5], сопровождающиеся резким снижением уровня «свободных» тромбоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов в крови. Эта вторая стадия заболевания характеризуется возможностью нарушения функций ряда органов [2—6], при этом не обнаруживается связанности типа и выраженности нарушений между собой, например корреляции уровня АлАТ и протеинурии. Возможно, отличия в тяжести течения ИКБ-БМ и типе органных нарушений определяются по принципу «слабого звена» в организме конкретного больного. У некоторых пациентов разгар ИКБ-БМ сопровождался осложнением предшествующих соматических заболеваний, в частности хронической почечной недостаточности или дисциркуляторной энцефалопатии. На третьей стадии клиническая симптоматика угасает, происходит выработка специфических АТ, боррелии в крови не выявляются. При условии адекватной антибиотикотерапии рецидивов ИКБ-БМ не возникает; без антибиотикотерапии возможны, как и при КВЛ, новые приступы лихорадки через 1—2 нед [25]. Предполагается, что в основе рецидивов лежит механизм «иммунного избегания»: часть спирохет, выживая во время иммунной атаки, выключает синтез одного поверхностного антигена VMP и включает синтез иного антигенного варианта VMP, к которому АТ еще отсутствуют. Рецидив возникает в результате размножения в крови нового поколения B. miyamotoi. Подобное явление обнаружено в опытах на животных и in vitro [18]. Наконец, на стадии реконвалесценции практически у всех больных вырабатываются АТ не только IgM, но и IgG к VMP и GlpQ [19, 26]; максимальный уровень специфических IgG регистрируется через 30—90 дней после острого периода ИКБ-БМ. Однако иммунитет не является полноценным и пожизненным. Протективные А.Т. эффективны, в первую очередь против штамма B. miyamotoi, вызвавшего заболевание, но не против всех антигенных вариантов этих боррелий, циркулирующих в природе. Уровень специфических АТ существенно снижается через 1—2 года после заболевания, через 5—7 лет АТ у большинства больных не выявляются. Поэтому все население России, проживающее в ареале распространения клещей Ixodes persulcatus, остается в группе риска заболевания ИКБ-БМ. Благодарности Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15−15−00072). Авторы признательны медицинскому персоналу ООО МО «Новая больница» г. Екатеринбурга за помощь в проведении исследования. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

A E Platonov

M G Toporkova

N M Kolyasnikova

O A Stukolova

A S Dolgova

A V Brodovikova

N A Makhneva

L S Karan

J Koetsveld

G A Shipulin

V V Maleev

References

Supplementary files