Lymphocyte subpopulations, levels of interferon, and expression of their receptors in patients with chronic hepatitis B and C: Correlation with the species of viruses and the degree of liver fibrosis

Full Text

ГЦК — гепатоцеллюлярная карцинома ИЛ — интерлейкины ИФН — интерфероны ФП — фиброз печени ХГВ — хронический гепатит В ХГС — хронический гепатит С HВV — вирус гепатита В НСV — вирус гепатита С Несмотря на наметившийся закат эры интерферонотерапии вирусных гепатитов, ключевое значение интерферонов (ИФН) в естественной защите организма от вирусов гепатита В (HВV) и вирусов гепатита С (НСV) остается непререкаемым. Кроме того, не вызывают сомнений антифибротическое действие ИФН-α и протективный потенциал этого цитокина в отношении гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) [1]. Весьма заметную роль играют ИФН-λ1—4 в защите от инвазии HВV и НСV и предотвращении ассоциированных с этими патогенами угрожающих жизни заболеваний (цирроз, рак) [2]. Полиморфизм гена ИФН-λ3 (интерлейкина — ИЛ-28В) определяет эффективность противовирусного лечения и вероятность самопроизвольного очищения организма от HВV [3] и НСV [4]. ИФН-γ не обладает таким прямым виростатическим потенциалом, как ИФН I и III типа, но при этом стимулирует адаптивные (Т-клеточные) и врожденные (NK-клеточные) противовирусные реакции, являющиеся ключевыми факторами естественной эрадикации возбудителя. Биологические, в том числе защитные, эффекты ИФН определяются, с одной стороны, полиморфизмом их генов и уровнем продукции в ответ на вирусную инвазию, а с другой — степенью экспрессии рецепторов этих цитокинов на клетках-мишенях. HВV и HСV обладают не только гепатотропностью, но и в значительной степени лимфотропностью [5, 6]. Персистирование в клетках крови рассматривается как важное звено патогенеза хронических форм вирусных гепатитов. От экспрессии сенсоров ИФН I и II типа на лимфоцитах a priori зависит способность этих клеток сопротивляться инфицированию вирусами. Вместе с тем результаты исследований взаимосвязи показателей клеточного иммунитета, экспрессии рецепторов ИФН разных типов на клетках периферической крови с таксономической принадлежностью вируса и степенью фиброза печени (ФП) крайне противоречивы. Цель работы — у больных хроническим гепатитом В (ХГВ) и хроническим гепатитом С (ХГС) определить зависимость субпопуляционного состава циркулирующих лимфоцитов, концентрации ИФН-α, ИФН-γ и ИФН-λ3 в сыворотке крови и экспрессии рецепторов ИФН I и II типов лимфоцитами от вида возбудителя заболевания и выраженности ФП. Материалы и методы Под наблюдением в клиническом отделе инфекционной патологии ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора на базе инфекционной клинической больницы № 2 Департамента здравоохранения Москвы находились 53 больных хроническими вирусными гепатитами в возрасте 41,2±10,5 года (33 мужчины и 20 женщин), в том числе 9 пациентов с ХГВ, 44 с ХГС. Диагноз устанавливали на основании эпидемиологических, клинических и лабораторных данных при обнаружении специфических серологических маркеров ХГС или ХГВ и в отсутствие маркеров других вирусных гепатитов (иммуноферментный анализ), а также при выявлении РНК НСV или ДНК HВV (полимеразная цепная реакция). Контрольная группа состояла из 13 клинически здоровых доноров с отрицательными результатами серологических и молекулярных исследований на наличие маркеров вирусных гепатитов. Степень ФП у больных определяли с помощью транзиентной эластографии печени на аппарате Фиброскан 502 («Echosens», Франция). Образцы крови для гематологических и иммунологических исследований брали утром натощак. Гематологические показатели определяли с помощью анализатора AcT Diff («Beckman Coulter», США). Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови проводили методом проточной цитофлю-орометрии на цитометре EPICS XL («Beckman Coulter», США). Наряду со стандартной панелью, необходимой для определения количества основных субпопуляций лимфоцитов, разработаны дополнительные панели окрашивания для определения числа клеток, несущих на своей поверхности CD118 или CD119, а также популяции клеток CD45+CD4+CD119+. В работе использовали конъюгаты антител CD3-Fitc/HLA-DR-PE, CD8-Fitc/CD38-PE, CD3-Fitc/CD19-PE, CD3-Fitc/CD16-PE, CD45-Fitc/CD4- RD1/CD8-ECD/CD3-PC5, CD3-Fitc/CD56-PE, CD45-PC5, CD118-PE, CD4-Fitc («Beckman Coulter», США), CD119-PE («eBioscience») и лизирующий раствор BD FACS («Becton Dickinson», США). Концентрацию ИФН-α, ИФН-γ и ИЛ-28 В определяли на базе лаборатории онтогенеза и коррекции системы интерферона ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России (зав. — проф. В.В. Малиновская) методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов производства eBioscience из одной партии. При этом оптическую плотность проб измеряли на микропланшетном фотометре Anthos 2020 («Anthos Labtec Instruments GmbH», Австрия) при длине волны 450 нм с коррекцией 620 нм. Математическую обработку данных осуществляли с помощью программы Statistica 8 («StatSoft Inc»). Множественные межгрупповые сравнения независимых выборок проводили с использованием критерия Краскела—Уоллиса, парные сравнения независимых выборок — критериев Данна и Манна—Уитни. При анализе связи переменных рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена. Нулевая гипотеза отвергалась при p<0,05. Количественные данные представляли в виде медианы (Me) с указанием 25-го и 75-го процентилей, а также в виде минимальных и максимальных (Min—Max) значений показателя. Результаты Таксономическая принадлежность возбудителя хронического гепатита статистически значимо не влияла на большинство изученных гематологических показателей: число эритроцитов, тромбоцитов, моноцитов, эозинофилов, гематокрит, содержание гемоглобина в крови, средний объем эритроцитов и среднее содержание в них гемоглобина. Несмотря на некоторый тренд к снижению числа циркулирующих лейкоцитов у больных ХГВ — 5,3 [(4,1; 6,5); 3,1—9,1] ·109/л в сравнении с группой здоровых доноров — 6,8 [(6,5; 7,3); 4,8—12,7] ·109/л и пациентами с ХГС — 6,5 [(5,1; 8,1); 1,0—13,9] ·109/л, математическая обработка с использованием критериев множественного и парного сравнения не выявила межгрупповых различий по этому показателю. Вместе с тем установлены различия между указанными группами по относительному количеству лимфоцитов в периферической крови (рис. 1, а). Рис. 1. Доля лимфоцитов (а) и нейтрофилов (б) среди лейкоцитов периферической крови больных ХГС и ХГВ. Здесь и на рис. 2—5: данные представлены в виде «коробок» с «усами», отражающими Me (25-й процентиль; 75-й процентиль; Min—Max). Здесь и на рис. 3: при множественном сравнении: p<0,001 (критерий Краскела—Уоллиса), при сравнении со здоровыми донорами: * — p<0,001 (критерий Данна) или p<0,001 (критерий Манна—Уитни). При сравнении с больными ХГС: ^ — p=0,135 (критерий Данна) или p=0,027 (критерий Манна—Уитни). Их доля среди циркулирующих лейкоцитов у больных ХГС и особенно у пациентов с ХГВ превосходила таковую у клинически здоровых лиц. В рамках множественного сравнения не установлено разницы между больными ХГС и ХГВ по этому показателю (критерий Данна), однако сравнение указанных двух групп с использованием критерия Манна—Уитни выявило статистически значимое превышение относительного числа лимфоцитов у больных ХГВ. Наоборот, относительное количество нейтрофилов в периферической крови у больных вирусными гепатитами существенно ниже, чем у здоровых доноров (см. рис. 1, б). Различий между пациентами с ХГС и ХГВ по доле нейтрофилов среди циркулирующих лейкоцитов не установлено. Не выявлено принципиальной разницы между группами больных и здоровых доноров по числу субпопуляций лимфоцитов CD45+CD3+, CD45+CD3+CD8+, CD45+ CD3–CD16+CD56+, CD45+CD3+CD16+CD56+ и CD45+ CD19+, за исключением относительного числа клеток CD45+CD3+ CD4+, которое у больных ХГС статистически значимо (критерий Манна—Уитни) превышало таковое у пациентов с ХГВ (рис. 2, а). Рис. 2. Доля клеток СD45+CD3+CD4+ (а) CD118+ (б) и среди лимфоцитов периферической крови у больных ХГС и ХГВ. а: — при множественном сравнении: p=0,017 (критерий Краскела—Уоллиса), при сравнении с больными ХГС: ^ — p=0,135 (критерий Данна) или p=0,027 (критерий Манна—Уитни); б: при множественном сравнении: p<0,001 (критерий Краскела—Уоллиса), при сравнении со здоровыми донорами: * — p=0,002 (критерий Данна) или p<0,001 (критерий Манна—Уитни); ** — p<0,001 (критерий Данна) или p<0,001 (критерий Манна—Уитни). Доля циркулирующих лимфоцитов, экспрессирующих цепь 2 рецептора ИФНα/β (CD118), у больных ХГС и ХГВ примерно в 1,5 раза выше таковой у здоровых доноров (см. рис. 2, б). В абсолютных числах это разичие было еще более значительным. По экспрессии α-цепи рецептора ИФН-γ (CD119) лимфоцитами периферической крови больные ХГС — 83 (77; 86); 43—94% и ХГВ — 83 (70; 86); 32—89% — не различались между собой и со здоровыми донорами — 77 (73; 81); 68—91%. Относительное число клеток CD119+ среди лимфоцитов CD4+ у больных ХГС было выше, чем у здоровых доноров (рис. 3). Рис. 3. Доля клеток CD119+ среди лимфоцитов CD4+ периферической крови больных ХГС и ХГВ. Статистически значимых различий между группами пациентов с ХГС и ХГВ по этому показателю не выявлено. Уровни ИФН-α в сыворотке крови больных ХГС 7,2 (2,7; 10); 0—45,7 пг/мл и ХГВ 9,1 (4,5; 6,3); 0,8—43,1 пг/мл не различались, однако превышали соответствующие показатели у здоровых доноров. Содержание ИФН-γ в сыворотке крови пациентов с ХГС — 2,94 (2,26; 4,62); 1,53—10,02 пг/мл и ХГВ — 3 (2,67; 3,94); 1,57—5,61 пг/мл также было примерно на одном уровне. Медиана концентрации ИЛ-28 В у больных ХГС 57,5 (47,2; 67,6); 8,2—119,6 пг/мл превышала почти в 2 раза таковую у пациентов с ХГВ — 34,2 (28,4; 55,5); 18,1—72,2 пг/мл], но разница математически не подтвердилась из-за высокой индивидульной вариативности параметра. Обнаружена прямая корреляция уровней ИФН-α и ИФН-γ (R=0,35; p=0,036). Не уставлено различий по всем изученным паказателям между больными ХГС и ХГВ с одинаковой степенью Ф.П. Отчасти это можно связать с ограниченным числом пациентов в пределах каждого кластера по выраженности ФП. В связи с этим проведен анализ зависимости гематологических и иммунологических показателей от степени ФП в объединенной выборке больных ХГС и ХГВ. Не выявлено различий между кластерами больных с разной выраженностью ФП по большинству показателей клинического анализа крови, за исключением количества лимфоцитов и нейтрофилов. Степень Ф.П. диаметрально противоположно влияла на последние два показателя. Если относительное число лимфоцитов увеличивалось с прогрессированием ФП (рис. 4, а; Рис. 4. Доля лимфоцитов (а) и нейтрофилов (б) среди лейкоцитов периферической крови у больных ХГС и ХГВ c разной степенью ФП. Здесь и на рис. 4 и 5 по оси абсцисс — степень Ф.П. При множественном сравнении: p=0,011 (критерий Краскела—Уоллиса); p<0,05 при парном сравнении (критерий Манна—Уитни) с больными со степенью ФП 0 (*) или I (^) или II (&). а: p<0,05 при парном сравнении (критерий Манна—Уитни) с больными со степенью ФП 0 (*) или I (^) или II (&); б: # — p=0,017 при парном сравнении (критерий Данна) с больными со степенью ФП 0.R=0,48; p=0,004), то доля нейтрофилов среди циркулирующих лейкоцитов снижалась (см. рис. 4, б; R=<0,64; p<0,001). Оба гематологических показателя находились в сильной обратной корреляционной связи (R=–0,94; p<0,001). Несмотря на отсутствие межкластерных отличий по числу тромбоцитов в периферической крови, установлена обратная корреляция этого показателя с выраженностью ФП (R=–0,66; p<0,001). Множественные сравнения кластеров больных с разной степенью ФП по численности основных субпопуляций лимфоцитов различий не выявили. Следует выделить только субпопуляцию клеток CD45+CD3+CD16+CD56+ (NKT), относительное количество которых увеличивалось вместе с выраженностью ФП (R=0,451; p=0,008), вследствие чего обнаружено математически подтвежденное превышение этого показателя у больных с ФП IV степени по сравнению с таковым у пациентов с ФП степени 0 (p=0,024; критерий Манна—Уитни). Различий между кластерами больных вирусными гепатитами с разной выраженностью ФП по доле клеток CD118 и CD119 среди циркулирующих лимфоцитов, а также по концентрациям ИФН-α, ИФН-γ и ИФН-λ3 в сыворотке крови не установлено. В рамках множественного сравнения не выявлено математически подтвержденной межкластерной гетерогенности по доле лимфоцитов CD4+CD119+ среди клеток CD45+ периферической крови (рис. 5). Рис. 5. Доля лимфоцитов CD4+CD119+ среди клеток CD45+ периферической крови у больных ХГС и ХГВ c разной степенью ФП. При множественном сравнении: p=0,156 (критерий Краскела—Уоллиса). При парном сравнении: * — pIII—IV=0,028 (критерий Манна—Уитни) или pIII—IV=0,216 (критерий Данна). Однако при парном сравнении с использованием критерия Манна—Уитни выявлен более высокий уровень этого показателя у больных с ФП IV степени по сравнению с пациентами с ФП III степени. Обсуждение Выявленный лимфоцитоз при обоих этиологических вариантах хронического гепатита выглядит вполне ожида-емым, так как многие вирусные инфекции сопровождаются увеличением числа лимфоцитов. Положительная связь лимфоцитоза и выраженности ФП также закономерна. Степень лимфоцитоза и ФП считаются независимыми негативными предикторами ответа на лечение пегилированным ИФН-α и рибавирином. В этом отношении подтвержденные нами нейтропения и лимфоцитоз и их корреляция со степенью ФП у больных ХГС и ХГВ вполне укладываются в представления, сформулированные в ранее опубликованных работах. Так, M.-T. Kuo и соавт. [7] установили, что отношение числа нейтрофилов к числу лимфоцитов в периферической крови является предиктором эффективности лечения пегилированным ИФН-α и рибавирином. В свете того, что ФП увеличивает вероятность развития ГЦК, также следует привести данные литературы о прогностическом значении соотношения нейтрофилы/лимфоциты при различных вариантах лечения ассоциированных с HCV и HBV неопластических заболеваний печени [8, 9]. Можно предположить, что персистенция HCV и особенно HBV в лимфоцитах увеличивает пролиферативный потенциал и снижает уровень апоптоза этих клеток по аналогии с тем, что происходит при вирусной инфекции Эпштейна—Барр [6]. Выявленная обратная связь числа тромбоцитов и степени ФП у больных ХГС и ХГВ согласуется с результатами исследований других авторов [10]. Заслуживают внимания данные о более низком уровне циркулирующих клеток CD3+CD4+ у больных ХГВ по сравнению с таковым у пациентов с ХГС. Это требует дополнительных исследований саногенетической/патогенетической роли данной популяции лимфоцитов при разных по этиологии формах хронического гепатита. Корреляция относительного числа NKT-клеток с выраженностью ФП не только мотивирует к дальнейшему изучению возможного профибротического действия этих клеток, но и представляет интерес в свете использования этого показателя как предиктора прогрессирования ХГС и ХГВ. Различий по концентрациям ИФН-α, ИФН-γ и ИЛ- 28B между кластерами больных с разной степенью ФП обнаружить не удалось. Данные литературы о прогностическом значении уровня ИЛ-28B в сыворотке крови противоречивы. A. Al-Qahtani и соавт. [11] установили прямую корреляцию концентрации ИЛ-28B с прогрессированием ХГС, в частности с развитием цирроза и ГЦК. Две независимые научные группы выявили более низкий уровень ИЛ-28B у лиц с вариантом rs12979860CC гена IFNL3 [12, 13], благоприятным в плане прогноза ответа на лечение пегилированным ИФН-α и рибавирином [14], а также спонтанного выведения вируса из организма нелеченых больных гепатитом С [4]. B. Langhans и соавт. [15], наоборот, утановили обратную зависимость концентрации ИЛ-28B и благоприятного аллеля СС этого гена. С результатами нашего исследования более сопоставимы данные другой работы [16], в которой не выявлено различий уровня ИЛ-28B у ответивших и не ответивших на противирусную терапию больных ХГС. Выявленная прямая корреляция уровней ИФН-α и ИФН-γ вполне ожидаема, так как ИФН-α вместе с ИЛ-12 и ИЛ-18 поляризует дифференцировку наивных лимфоцитов CD4+ в направлении Т-хелперов 1-го типа, ключевым продуктом которых является ИФН-γ [17], а также усиливает продукцию этого цитокина NK-клетками и лимфоцитами CD8+ [18]. Значительное увеличение числа лимфоцитов CD118 при ХГС и ХГВ на фоне индуцированного вирусами увеличения уровня циркулирующего ИФН-α может отражать повышенную сопротивляемость лимфоцитов заражению HCV и HBV. Нами не выявлено связи между долей лимфоцитов, экспрессирующих цепь 2 рецептора ИФНα/β, и выраженностью ФП, что противоречит данным Д.В. Донцова и соавт. [19], которые продемонстрировали корреляцию экспрессии CD118 лимфоцитами со степенью ФП и рассматривали этот показатель как предиктор прогрессирования ХГС. Отдельного внимания заслуживает увеличение доли лимфоцитов CD4+CD119+ среди клеток CD45+ периферической крови при прогрессировании ФП от III к IV степени. На фоне неизмененного уровня циркулирующего ИФН-γ рост числа клеток CD4+, экспрессирующих рецептор этого цитокина, должен a prori сопровождаться большей чувствительностью указанной субпопуляции лимфоцитов к ИФН-γ. Вместе с тем это может быть косвенным свидетельством патогенетической (профибротической) роли ИФН-γ, который до сих пор рассматривался главным образом в защитном (противовирусном и антифибротическом) контексте как при ХГВ [20], так и ХГС [21]. Способность этого цитокина стимулировать ФП описана ранее только на моделях мышей in vivo [22]. Нуждается в осмыслении и более высокая доля клеток CD119+ среди лимфоцитов CD4+ в периферической крови у пациентов с ХГС по сравнению с таковой у больных ХГВ и здоровых доноров. Заключение Выявлено несколько новых клинико-лабораторных закономерностей и уточнены характер и степень ранее описанных гематологических и иммунологических сдвигов у больных ХГС и ХГВ при разной степени Ф.П. Некоторые показатели могут быть использованы в качестве дополнительных критериев прогноза течения указанных форм гепатита, а ряд вновь описанных фактов свидетельствует о необходимости пересмотра защитного/флогогенного значения ИФН I, II и III типов при хронических вирусных гепатитах С и В. Авторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.

About the authors

O V Kalyuzhin

Zh B Ponezheva

I V Semenova

O N Khokhlova

L V Serebrovskaya

T S Guseva

O V Parshina

V V Maleev

References

Supplementary files