Endothelial immune activation and functional state in patients with hypertensive disease

Full Text

АГ — артериальная гипертония АД — артериальное давление ГБ — гипертоническая болезнь ДЭ — дисфункция эндотелия ОС — окислительный стресс р-α-ФНО-RI — растворимый рецептор I типа α-фактора некроза опухоли СН — сердечная недостаточность NOS — NO-синтаза α-ФНО — α-фактор некроза опухоли е-NOS — эндотелиальная NOS i-NOS — индуцибельная NOS Гипертоническая болезнь (ГБ) — сложная медико-социальная проблема во всем мире, занимающая одно из ведущих мест в структуре кардиальной патологии в связи со значительной распространенностью и ранним развитием осложнений. В настоящее время проблема ГБ выходит за рамки кардиологической, принимая многодисциплинарный и социально значимый характер. Патогенез ГБ представляет собой многокомпонентный процесс. Одним из первых проявлений является развитие дисфункции эндотелия (ДЭ). В последние годы доказана роль иммуновоспалительной активации, опосредованной провоспалительными цитокинами, и окислительного стресса (ОС) в развитии ДЭ [1—3]. Среди провоспалительных цитокинов особого внимания в контексте ГБ заслуживает α-фактор некроза опухоли (α-ФНО) [4]. Цель исследования — изучение системы оксида азота, активности эндотелиальной (i-NOS) и индуцибельной (i-NOS) NO-синтаз во взаимосвязи с уровнем α-ФНО и его растворимого рецептора I типа (р-α-ФНО-RI) в зависимости от степени ГБ. Материалы и методы В условиях стационара 11-й ГКБ г. Харьков обследовали 317 лиц, среди которых 284 пациента с 1—3-й степенью ГБ в возрасте от 30 до 65 лет (средний возраст 54,7±0,58 года), которым ранее не проводили регулярную антигипертензивную терапию, и 33 практически здоровых. Из них 171 (60%) женщина и 113 мужчин (40%), длительность заболевания которых в среднем составила 10,09±0,48 года. На основании комплексного клинико-инструментального обследования верификация диагноза и определение степени ГБ проведены согласно критериям, рекомендованным European Society of Hypertension/European Society of Cardiology (ESH/ESC), 2013. У 100 пациентов диагностирована ГБ 1-й степени; у 92 пациентов — 2-й степени, у 92 пациентов — 3-й степени. Критериями исключения больных из исследования помимо симптоматического характера артериальной гипертонии (АГ) служили сопутствующие воспалительные, эндокринные и другие заболевания, которые могли влиять на активность окислительных процессов. Для исключения вторичного характера АГ всем пациентам согласно приказу М.З. Украины № 247 (1998 г.) выполняли следующий объем обязательных исследований: измерение артериального давления (АД) на ногах (у лиц моложе 45 или старше 55 лет); аускультация сердца и сосудов: шеи, в паравертебральных точках, что соответствует V—XII ребрам, а также в точках проекции почечных артерий; общий анализ крови, общий анализ мочи (неоднократно), анализ мочи по Аддису—Каковскому (Амбурже, Нечипоренко, Зимницкому); определение в крови содержания калия, натрия, креатинина, глюкозы, холестерина и его содержание в липопротеидах разных классов; определение суточной протеинурии, скорости клубочковой фильтрации; электрокардиография, офтальмологическое исследование глазного дна, эхокардиография, определение роста и массы тела пациента. Проведены консультации эндокринолога, нефролога, гематолога с целью исключения вторичного характера ГБ. Анамнез повышения уровня АД мене 5 лет отмечался у 37% лиц, от 5 до 10 лет у — у 26%, более 10 лет — у 37%. У 9% пациентов в анамнезе имелся ишемический инсульт, у 7% — инфаркт миокарда. У отдельных больных диагностированы такие сопутствующие заболевания, как ишемическая болезнь сердца в виде стенокардии напряжения I (у 20), II (у 66) и III (у 48) функциональных классов, а также диффузный кардиосклероз (у 72). При изучении состояния глазного дна гипертоническая ангиопатия сетчатки выявлена у 70 (59,86%) пациентов. Неврологическое обследование показало наличие дисциркуляторной энцефалопатии с астеноневротическим (у 59), вестибулоатактическим синдромами (у 42) и ликворной гипертензией (у 34). У 266 (93,66%) пациентов течение АГ осложнено сердечной недостаточностью (СН). У 74 (26,06%) больных установлена СН I степени, у 168 (59,15%) — СН IIА степени и у 24 (8,45%) — СН IIБ степени. У 18 (6,34%) пациентов признаки СН отсутствовали. У 100 пациентов (81% женщин и 19% мужчин) из данной группы для изучения функционального состояния эндотелия определяли уровень стабильных конечных метаболитов оксида азота, содержание S-нитрозотиола и активность NO-синтаз. При этом у 18 пациентов диагностирована ГБ 1-й степени, у 27 — 2-й степени, у 55 — 3-й степени. Контрольную группу составили 16 практически здоровых лиц, по полу и возрасту сопоставимых с больными основной группы. Об иммунной активации судили по уровню в сыворотке крови провоспалительного цитокина α-ФНО у всех обследованных и его растворимого рецептора I типа (р-α-ФНО-RI). Показатели определяли иммуноферментным методом с помощью наборов реагентов ProCon TNFα («Протеиновый контур», Санкт-Петербург, Россия) и sTNF-RI EASIA («BioSource Europe S.A.», Бельгия) соответственно. Уровень α-ФНО определяли следующим образом: набор ProCon TNFα предназначен для количественного определения α-ФНО человека в плазме, сыворотке и культуральных жидкостях в интервале концентраций от 20 до 2000 пкг/мл. В наборе ProCon TNFα для определения α-ФНО использован твердофазный иммуноферментный метод с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Согласно методике нормальный уровень α-ФНО в сыворотке крови здорового человека, как правило, не превышает 50 пкг/мл. Уровень стабильных конечных метаболитов оксида азота NO (нитрита NO2– и нитрата NO3–), содержание S-нитрозотиола и активность NO-синтаз (NOS) определяли биохимическим методом. Общую активность NOS оценивали согласно методике L. Green по количеству образованного после инкубирования нитрит-аниона. Все иммуноферментные и биохимические исследования выполняли на базе ЦНИИЛ ХНМУ. Кровь у пациентов для иммуноферментного и биохимического исследований брали утром, на следующий день после поступления пациента в стационар через 12—18 ч после приема пищи. Образцы крови брали из локтевой вены. При этом все больные находились в условиях одинаковой двигательной активности и не принимали нитросодержащих препаратов, а также не употребляли продуктов с богатым содержанием нитратов и нитритов. Статистическую обработку данных исследования проводили с помощью программы Statistica 6 и программы Microsoft Excel 2000 (версия 9.0.3821 SR-1) и представляли исследуемые величины в следующем виде: выборочное среднее значение (Mean) ± стандартное отклонение (SD). Соответствие данных нормальному распределению Гауса выявляли при визуальном анализе категоризированных гистограмм, а также при использовании тестов Колмогорова—Смирнова, Шапиро—Уилка и Лилиефорса. Проверку гипотез о равенстве генеральных средних осуществляли с помощью критерия t Стьюдента и критерия согласия χ2. Результаты В ходе исследования установлено достоверное повышение уровня депонирования свободного NO — S-нитрозотиола. У пациентов с ГБ отмечалось увеличение содержания S-нитрозотиола в сыворотке крови в 2 раза (0,44±0,163 ммоль/л) по сравнению с группой контроля (0,22±0,039 ммоль/л; p<0,05). Содержание нитритов (NO2–) и нитратов (NO3¯), напротив, уменьшалось в сыворотке крови пациентов с Г.Б. Уменьшение содержания NO2– (13,85±6,25 мкмоль/л) и NO3– (20,17±8,15 мкмоль/л) у обследованных пациентов по сравнению с группой контроля (соответственно NO2– 14,19±1,80 мкмоль/л и NO3– 24,06±2,46 мкмоль/л) имело характер тенденции. Анализ NOS у обследованных с ГБ по сравнению с группой контроля показал достоверное повышение среднего показателя активности i-NOS в 2,84 раза (0,591±0,093 против 0,208±0,089; p<0,05); в то же время снижение активностиe NOS в 1,05 раза (0,739±0,1 против 0,782±0,045; p>0,05) по сравнению с таковым в группе контроля оставалось на уровне тенденции. Анализ активности провоспалительных цитокинов показал значительное увеличение уровня α-ФНО у пациентов с ГБ по сравнению с контролем: 186,56±18,12 и 13,23±3,40 пкг/мл соответственно (р<0,05). Среднее содержание α-ФНО в 14,1 раза превышало контрольные значения. Подобная тенденция прослеживалась и для растворимых фракций рецепторов к α-ФНО. Уровень р-α-ФНО-RI при ГБ также превышал таковой в контрольной группе: 2,14±0,28 и 1,20±0,60 нг/мл соответственно (р<0,05). Среднее содержание р-α-ФНО-RI у пациентов с повышенной активностью α-ФНО, обусловленной повышением АД, выросло в 1,78 раза, или на 78,3%, по сравнению с контролем. В целях выяснения влияния не только наличия, но и степени повышения АД на функциональное состояние эндотелия синтез α-ФНО и р-α-ФНО-RI всех больных разделили на группы в зависимости от степени ГБ. содержание последних показателей в плазме крови у обследованных больных и лиц контрольной группы представлены в таблице. Уровень S-нитрозотиола, NO2–, NO3–, i-NOS, e-NOS, α-ФНО, р-α-ФНО-RI у больных ГБ с различной степенью АГ и лиц контрольной группы Примечание. Различия достоверны (р<0,05) по сравнению с * —контрольной группой, ** — пациентами с АГ 1-й степени; *** — пациентами с АГ 2-й степени. По нашим данным, при относительно незначительном повышении АД (АГ 1-й степени) и длительности заболевания 5,52±1,2 года отмечалось увеличение содержания в плазме крови α-ФНО (111,59±26,11 пкг/мл) и р-α-ФНО-RI (2,02±0,22 нг/мл) по сравнению с таковым у лиц с нормальным АД (р<0,05). В дальнейшем (длительность заболевания 7,52±1,36 года) при более значительном повышении АД (2-я степень АГ) отмечалось более выраженное, чем у больных с АГ 1-й степени, повышение продукции α-ФНО (142,15±27,17 пкг/мл; р<0,05) и р-α-ФНО-RI (2,13±0,16 нг/мл; р>0,05). При максимальном уровне АД (АГ 3-й степени) и максимальной длительности ГБ (13,20±1,56 года) содержание α-ФНО уменьшалось (116,78±18,53 пкг/мл; по сравнению с пациентами с АГ 2-й степени; р<0,05), а увеличение содержания в плазме крови р-α-ФНО-RI продолжалось (2,19±0,08 нг/мл; р>0,05). Данные экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют о росте продукции провоспалительных цитокинов в ответ на относительно краткосрочные перегрузки повышенным давлением. В результате ряда экспериментов установлено, что при более длительной АГ наблюдалось генерализованное снижение выброса биоактивности α-ФНО независимо от уровня АД [4, 5]. Подобная тенденция обнаружена и в нашем исследовании. Установлено, что уровень α-ФНО и р-α-ФНО-RI возрастал при увеличении длительности АГ. У пациентов с продолжительностью заболевания менее 5 лет содержание α-ФНО соответствовало 108,82±22,00 пкг/мл, р-α-ФНО-RI — 2,00±0,13 нг/мл; при продолжительности АГ от 5 до 10 лет отмечались достоверно высокие средние уровни α-ФНО — 118,32±24,00 пкг/мл и р-α-ФНО-RI — 2,12±0,18 нг/мл (р<0,05 в обоих случаях). У пациентов с максимальным сроком заболевания средний уровень α-ФНО составил 114, 88±24,11 пкг/мл и р-α-ФНО-RI — 2,28±0,14 нг/мл (р<0,05 в обоих случаях). Однако динамика соотношения α-ФНО/р-α-ФНО-RI отражает снижение иммуновоспалительной активности при длительном (более 10 лет) течении А.Г. Размер α-ФНО/р-α-ФНО-RI, отображающий соотношение комплекса лиганд—рецептор, контрольной группы практически здоровых лиц составляла 11,03±2,84. Так, у пациентов с длительностью АГ мене 5 лет (1-я группа) данный показатель соответствовал 54,41, несущественно увеличился до 55,81 при длительности АГ от 5 до 10 лет (2-я группа) и снизился до 50,39 у лиц с длительностью АГ более 10 лет (3-я группа). Динамика данного показателя свидетельствовала о его росте у пациентов с различной длительностью АГ по сравнению со здоровыми лицами (при сравнении группы контроля с пациентами со сроком течения АГ менее 5 лет, от 5 до 10 лет и более 10 лет p<0,05 по критерию χ2). Максимальное значение обнаружено у пациентов с длительностью АГ от 5 до 10 лет, отображающее более значительный рост α-ФНО по сравнению с его естественным антагонистом р-α-ФНО-RI (p=0,99 по сравнению с пациентами с длительностью АГ менее 5 лет; p=0,77 по сравнению с пациентами с длительностью АГ более 10 лет по критерию χ2). У пациентов с длительностью АГ более 10 лет наблюдалось снижение отношения α-ФНО/р-α-ФНО-RI по сравнению с пациентами 1-й и 2-й групп (p=0,97 по сравнению с пациентами с длительностью АГ менее 5 лет по критерию χ2). Согласно данным, представленным в таблице, у пациентов с ГБ отмечалось достоверное увеличение содержания S-нитрозотиола в сыворотке крови: в 1,87 раза (у лиц с АГ 1-й степени), в 1,97 раза (у лиц с АГ 2-й степени) и в 2 раза (у лиц с АГ 3-й степени) по сравнению с группой контроля. При 3-й степени АГ среднее содержание S-нитрозотиола было максимальным по сравнению с таковым при АГ 2-й и 1-й степени, при АГ 2-й степени данный показатель превышает значение последнего при АГ 1-й степени. Однако динамика среднего содержания S-нитрозотиола в зависимости от степени АГ носила характер тенденции. Содержание нитритов и нитратов, напротив, снижено по сравнению с таковым в группе контроля. Наиболее значительно снижены последние показатели у обследованных больных с АГ 3-й степени: NO2– в 1,04 раза (p>0,05) и NO3– в 1,2 раза (p<0,05) по сравнению с группой контроля. При 2-й степени АГ содержание нитритов не отличалось от такового в группе контроля. Недостоверно снижались данные показатели при сравнении последних у лиц с АГ 3-й степени с пациентами с АГ 2-й и 1-й степени, и у лиц с АГ 2-й и 1-й степени. Рассматривая активность e-NOS у пациентов с разной степенью АГ, мы выявили достоверное снижение средних значений последнего показателя: в 1,06 раза, или на 6,14% (у лиц с АГ 1-й степени), в 1,1 раза, или на 10,62% (у лиц с АГ 2-й степени), и в 1,02 раза, или на 2,69% (у лиц с АГ 3-й степени), по сравнению с группой контроля (p<0,05). Вместе с тем активность i-NOS у данных больных достоверно превышала среднее значение активности последнего показателя у лиц с нормальным АД: в 2,8 раза, или на 181,25% (у лиц с АГ 1-й степени), в 2,7 раза, или на 169,97% (у лиц с АГ 2-й степени), и в 2,9 раза, или на 192,3% (у лиц с АГ 3-й степени); р<0,05 для всех сравнений. В результате корреляционного анализа у пациентов с АГ 1-й и 2-й степени между содержанием в плазме α-ФНО и активностью i-NOS получена недостоверная прямая корреляция: при АГ 1-й степени r=0,311 (p=0,38; при АГ 2-й степени r=0,294 (p=0,40). У лиц с АГ 3-й степени между последними показателями получена достоверная обратная корреляция (r=–0,676; p=0,032). Полученный результат объясняется снижением выброса α-ФНО в результате истощения клеток — продуцентов цитокина с возрастом и длительностью АГ, с одной стороны, и инактивацией его растворимыми рецепторами р-α-ФНО-RI, с другой стороны. Обсуждение Нами установлено повышение уровня циркулирующих провоспалительных цитокинов (α-ФНО, р-α-ФНО-RI), уровня S-нитрозотиола и активности i-NOS. В то же время отмечено снижение активности e-NOS и уровня конечных метаболитов оксида азота — нитритов и нитратов. В данном случае у лиц с АГ 1-й степени отрыв экстрацеллюлярных частей р-α-ФНО-RI при высоком уровне циркулирующего цитокина можно расценить как адаптивный механизм, который, с одной стороны, уменьшает количество активных рецепторов на поверхности клеток-мишеней, а с другой стороны, путем связывания с α-ФНО растворимые формы рецепторов (р-α-ФНО-RI) могут нейтрализовать его биоактивность. У лиц с АГ 2-й степени одновременное увеличение содержания р-α-ФНО-RI, возможно, недостаточно для нейтрализации негативного действия α-ФНО, о чем свидетельствует дальнейшее увеличение отношения α-ФНО/р-α-ФНО-RI (66,74) по сравнению с таковым у пациентов с АГ 1-й степени (55,24) и лиц с нормальным АД (11,03). При максимальном уровне АД (3-я степень АГ) содержание α-ФНО уменьшалось по сравнению с таковым у пациентов с АГ 2-й степени, что частично может быть обусловлено связыванием α-ФНО с р-α-ФНО-RI. В то же время не исключено, что α-ФНО запускает апоптотический каскад, который приводит к гибели клеток — продуцентов цитокина. Дальнейшее увеличение содержания р-α-ФНО-RI на фоне уменьшения α-ФНО имеет позитивное значение. Последнее объясняется тем, что растворимые рецепторы р-α-ФНО-RI являются ингибиторами α-ФНО, поскольку, связываясь с циркулирующими в кровотоке α-ФНО, инактивируют активность цитокина [6, 7]. То, что отношение α-ФНО/р-α-ФНО-RI 53,32 и плазматический уровень α-ФНО, несмотря на снижение, превышает аналогичные показатели пациентов с АГ 1-й степени и здоровых лиц, может свидетельствовать, что такой уровень р-α-ФНО-RI неспособен инактивировать цитотоксичность α-ФНО. Рассматривая функциональное состояние эндотелия, выявлено, что концентрация S-нитрозотиола возрастала одновременно с увеличением уровня АД у пациентов с АГ 1, 2 и 3-й степени, а концентрация нитритов и в большей степени нитратов, наоборот, убывала у пациентов с АГ 3-й степени. Это свидетельствует о возможности буферного накопления в нитрозотиолах NO. Снижение же синтеза NO у лиц данной категории можно объяснить уменьшением активности e-NOS, ускоренным метаболизмом NO (при повышенном образовании свободных радикалов) или их комбинацией, что и наблюдается нами в данном случае. Одним из звеньев патогенеза ГБ является О.С. Как нами уже отмечено в предыдущих статьях, это подтверждается увеличением уровня 8-изопростана в сыворотке крови как главного маркера ОС, по сравнению с практически здоровыми лицами, причем степень увеличения зависит от уровня АД [8, 9]. Свободные перекисные радикалы инактивируют e-NOS и активируют i-NOS [10]. ОС в патогенезе ГБ как повреждающий механизм способствует активации иммунных механизмов, опосредованных провоспалительными цитокинами, и дальнейшему прогрессированию заболевания. Неспецифическая активация макрофагов и моноцитов при тяжелых стрессорных нарушениях микроциркуляции служит индуктором синтеза провоспалительных цитокинов, в частности α-ФНО, а также интерлейкинов 1α, 1β, 6 и др. Кроме того, как показали экспериментальные и незначительное количество клинических исследований, гемодинамический стресс, обусловленный повышением АД, является одним из стимулов повышения продукции и выброса в кровоток провоспалительных цитокинов, в том числе α-ФНО [10, 11].Однако при длительном (более 10 лет) течении АГ наблюдается снижение уровня иммуновоспалительной активности независимо от уровня АД [12]. Исходя из изложенного мы можем предположить, что у рассматриваемой нами категории больных ГБ α-ФНО является одним из факторов повышения активности i-NOS. Однако, учитывая полученный нами результат корреляционного анализа у лиц с АГ 3-й степени и данных таблицы, можно предполагать, что активность i-NOS повышается также за счет увеличения напряжения ОС у лиц данной категории. В последние годы доказана роль иммунного воспаления, опосредованное провоспалительными цитокинами, и ОС в развитии ДЭ [4, 13]. Повышение уровня S-нитрозотиола в плазме крови у обследованных лиц может быть связано с увеличением активности i-NOS [10], с нарушением антиоксидантной защиты [8]. S-нитрозотиолы рассматривают как физиологическое депо NO [14]. Заключение Одной из наиболее ранних фаз в патогенезе ГБ является ДЭ, которая проявляется снижением содержания конечных метаболитов NO (нитритов и нитратов), уменьшением активности е-NOS в сыворотке крови и одновременно повышением активности i-NOS, уровня депонирования свободного NO — S-нитрозотиола. Доказана роль иммуновоспалительной активации, опосредованной провоспалительными цитокинами, в частности α-ФНО и его р-α-ФНО-RI в развитии ДЭ. В пользу последнего утверждения свидетельствует повышение уровней α-ФНО и р-α-ФНО-RI, причем степень увеличения зависит как от повышения АД, так и продолжительности течения Г.Б. Однако исходя из результатов ряда клинических исследований и собственных данных, мы установили, что при более длительной АГ наблюдалось генерализованное снижение выброса биоактивности α-ФНО независимо от уровня АД. Авторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.

About the authors

T V Ashcheulova

O N Kovalyova

N N Gerasimchuk

References

Supplementary files