Polymorphism in the regulatory regions –С2578A and +C936T of the vascular endothelial growth factor (VEGF-A) gene in Russian women with rheumatoid arthritis

Full Text

Ревматоидный артрит (РА) — системное хроническое аутоиммунное заболевание, затрагивающее граждан трудоспособного возраста, которым страдает от 0,5 до 1% населения планеты. При развитии аутоиммунного процесса на ранней стадии РА достоверно подтверждено состояние постоянной гипоксии в пределах ревматического сустава, способствующее стимулированию ангиогенеза вследствие усиленной экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [1]. Немаловажным фактором развития сосудистых сетей является способность молекулярных продуктов гена VEGF-A стимулировать процессы лимфангиогенеза — капиллярной и сосудистой системы, регулирующей процессы транспорта тканевой жидкости и формирование отечности тканей, в свою очередь индуцирующей тканевую гипоксию. Показано, что при РА концентрация VEGF в сыворотке крови выше, чем у здоровых, и коррелирует со стадией болезни и маркерами воспаления, такими как скорость оседания эритроцитов, С-реактивный белок. Высокий уровень м-РНК VEGF и экспрессия белка определены на границе эндотелиальных клеток в синовиальной ткани у больных РА [2—4]. Значительное увеличение синтеза VEGF при РА описано во многих работах, причем его уровни в сыворотке крови связаны с тяжестью и стадией заболевания [5—7]. Показано, что полиморфизм гена VEGF ассоциирован с уровнем продукции белков. Так, генотип VEGF-2578 СС по сравнению с другими генотипами ассоциирован с более высоким уровнем продукции [8], аллель VEGF+936 Т — с низким уровнем в плазме [9]. Полиморфизм гена VEGF ассоциирован со многими патологическими состояниями, основанными на предполагаемом ангиогенном факторе, однако молекулярные механизмы участия VEGF в патологическом ангиогенезе РА до настоящего времени неясны. Генетические различия VEGF могут быть связаны с риском развития и характером течения РА, но данные анализа полиморфизма регуляторных регионов гена, полученные в разных популяционных группах, не однозначны. Недостаточное исследование сложных генетических механизмов болезни и острая необходимость в маркерах прогрессирования и особенностях течения болезни на основе генетических факторов обосновали цель нашего исследования — анализ полиморфизма гена VEGF у пациенток с РА. Материалы и методы Пациенты. В исследование включили 257 пациенток, больных РА, поскольку половой диморфизм может влиять на степень ассоциированности генетических маркеров с тем или иным признаком [10]. Диагноз Р.А. соответствовал критериям Американской коллегии ревматологов [11]. Серопозитивный и серонегативный РА выделяли в соответствии с рабочей классификацией и номенклатурой РА, принятой на заседании пленума Ассоциации ревматологов России 30 сентября 2007 г. [12]. Клинико-лабораторные характеристики группы пациентов с РА представлены в табл. 1. Исследование одобрено локальным этическим комитетом. Все пациентки давали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Таблица 1. Общая характеристика 257 обследованных больных РА Примечание. Данные представлены в виде абсолютного числа больных (%) или медианы (25-й процентиль; 75-й процентиль). РФ — ревматоидный фактор. Контрольная группа. В группу контроля включили 297 женщин без хронических заболеваний, сопоставимых по возрасту с выборкой больных РА, жительниц Новосибирска. Средний возраст женщин составил 52,4 года (30—84 лет). Генотипирование. Исследовали однонуклеотидный полиморфизм VEGF-A2578С промоторного региона (rs699947) гена и VEGF+C936Т3ʹ нетранслируемого региона (rs3025039). Генотипирование осуществляли методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Участки регуляторных регионов генов амплифицировали с использованием пары специфичных праймеров [13, 14], затем продукты амплификации подвергали гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции («СибЭнзим», Новосибирск). Электрофорез проводили в 2,5% агарозном геле. Статистическая обработка. При статистическом анализе полученных данных использовали такие показатели, как распространенность (частоты) генотипов, OШ с расчетом 95% Д.И. Расчет О.Ш. проводили по методу Вульфа—Холдейна. Распространенность (частоты) отдельных генотипов определяли как процентное отношение индивидуумов, несущих генотип, к общему числу обследованных в группе по формуле: f=n/N, где n — число случаев выявления генотипа, N — число обследованных. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди—Вайнберга. Достоверность различий частот распределения изучаемых признаков в альтернативных группах определяли по критерию χ2 с поправкой Йетса на непрерывность и двустороннему варианту точного метода Фишера для четырехпольных таблиц [15]. Результаты Частоты генотипов VEGF— С2578A и VEGF +C936T в группах пациенток с РА и здоровых соответствует равновесию Харди—Вайнберга. Частоты генотипов VEGF-2578 и VEGF+936 статистически значимо не различаются в группе пациенток с РА и группе здоровых лиц. Для дальнейшего анализа выделены подгруппы пациенток с серонегативным и серопозитивным РА (по уровню РФ). Нами не выявлено достоверных различий частот генотипов в позиции VEGF-2578 промоторного региона гена между пациентками с серопозитивной и серонегативной формами РА, а также по сравнению со здоровыми лицами. При анализе другой полиморфной позиции регуляторного региона гена выявлено повышение частоты VEGF+936 СT и снижение частоты генотипов VEGF+936СС у серонегативных пациенток по сравнению со здоровыми (ОШ2,69; р=0,002 и ОШ 0,45; р=0,017 соответственно). При этом повышена частота генотипа VEGF+936СС и снижен уровень гетерозиготности у пациенток с серопозитивной формой РА по сравнению с подгруппой серонегативных пациенток (ОШ 2,31; р=0,016 и ОШ 0,38; р=0,004 соответственно) (табл. 2). Таблица 2. Распределение частот генотипов VEGFA у пациенток с серопозитивной и серонегативной формами РА Примечание. * — χ2=5,76; р=0,016; ** — χ2=7,92; р=0,004; *** — χ2=5,69; р=0,017; # — χ2=9,10; р=0,002. ОШ — отношение шансов; ДИ — доверительный интервал; н.д. —недостоверно. РА обычно сопровождается множеством внесуставных проявлений, одно из которых наличие ревматоидных узелков, рассматриваемых как один из диагностических критериев, ассоциированных с тяжелым течением заболевания. Нами выявлено повышение частоты генотипа VEGF-2578СС у пациенток с РА и наличием ревматоидных узелков по сравнению со здоровыми женщинами (ОШ 2,08; р=0,013) (табл. 3). Таблица 3. Распределение частот генотипов VEGFA у пациенток с РА с наличием и отсутствием ревматоидных узелков Примечание. * — χ2=4,56; р=0,0327 с учетом поправки Йетса. Обсуждение Гиперплазия синовиальной оболочки сопровождается формированием большого количества новых кровеносных сосудов, что может быть связано в том числе с полиморфизмом регуляторных регионов гена, влияющих на уровень его белковой продукции. В ряде исследований показано протективное значение генотипа VEGF-2578 AA в развитии болезни у некурящих, но в группе курящих этот эффект теряется [16]. Кроме того, комбинация курения и носительство VEGF-2578 A аллельного варианта увеличила риск развития ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда у пациенток с РА [17]. При анализе только женской группы пациенток с РА в польской популяции показано, что генотип VEGF-2578 CС ассоциирован с развитием заболевания [18]. Однако преимущественно, по результатам исследований разных групп, не выявлено связи заболевания относительно здоровых с полиморфизмом промоторного региона гена VEGF [19, 20], что подтверждается и полученными нами результатами. В нашей группе показано повышение частоты генотипа VEGF -2578 CC, ответственного за высокий уровень VEGF, только в подгруппе больных РА с наличием ревматоидных узелков. По одной из наиболее распространенных теорий — ревматоидные узелки представляют собой ни что иное, как омертвение тканей вокруг воспаленных мелких кровеносных сосудов с накоплением в них иммунных комплексов и Р.Ф. Это может быть следствием, в том числе высокой транскрипционной активности VEGF, предшествующей формированию узелковых образований [21]. Что касается второй полиморфной позиции, расположенной в 3ʹнетранслируемом регионе гена, то данные по связи РА с полиморфизмом и здесь не однозначны по результатам разных исследовательских групп. Так, при анализе нескольких полиморфных позиций гена VEGF показано, что T-аллельный вариант rs3025039 ассоциирован с увеличенным риском раннего начала заболевания (в возрасте моложе 40 лет). Эта ассоциация не зависит от других факторов риска, таких как пол, курение [22]. В другом крупном исследовании частота CT rs3025039 увеличена, а частота генотипа CC rs3025039 уменьшена у пациентов с РА по сравнению со здоровыми. При этом не выявлено различий частот генотипов при стратификации пациентов по степени осложнений, сывороточным маркерам или возрастом манифестации заболевания [23]. В нашей группе именно такая зависимость выявлена у серонегативных относительно здоровых женщин. По данным ряда исследователей, у пациентов с продолжительностью болезни дольше 12 лет частота генотипа +936СС выше, чем +936СТ и +936ТТ. Предположительно продолжительность жизни у носителей аллеля T может быть меньше из-за возможных осложнений Р.А. Альтернативная гипотеза — неравновесная селекция [19, 22]. В нашей группе частота именно генотипа VEGF+936СС, ответственного за более высокий уровень продукции [9], выше в группе серопозитивных пациенток, чем у серонегативных. Ранее показано, что при серопозитивном РА по сравнению с серонегативным имеется достоверное увеличение VEGF в сыворотке крови. Авторы предполагают, что чем выше активность РА, тем выше уровень цитокинового ответа, более выражены ангиогенез и пролиферирующие изменения [24]. Можно предполагать, что ишемия суставных тканей стимулирует выработку VEGF, повышенная продукция которого индуцирует неоваскулогенез и неоангиогенез, интенсивность которого во многом определяется генотипом пациента с РА, что в свою очередь соотносится с вариантом клинического течения заболевания. Заключение Представленные данные свидетельствуют, что наличие в геноме определенных вариантов гена VEGF, расположенных в регуляторных регионах могут отражать характер иммунопатологических механизмов при Р.А. Это обосновывает их дальнейшее исследование в качестве маркеров характера течения заболевания и свидетельствуют, что развитие идеологии персонализированной медицины должно быть тесно связано с изучением ассоциированности вариантов клинического течения мультифакторных болезней с индивидуальными характеристиками генома пациента, особенно в областях генов, продукты которых непосредственно вовлечены в механизмы развития патологического процесса, контролируя ключевые процессы воспаления, ангиогенеза, тканевой гипоксии, склерогенеза и остеогенеза. Прогрессивное развитие принципов так называемой таргетной терапии также должно быть в русле представлений об уникальном генотипе пациента, кардинальным образом влияющем на «ответ» пациента на проводимую схему лекарственной терапии и будущую терапию биомедицинскими продуктами [25, 26]. Авторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.

About the authors

A V Shevchenko

V F Prokofyev

M A Korolev

N E Banshchikova

V I Konenkov

References

Supplementary files