Role of negative regulators of SOCS1, SOCS3, and SOCS5 gene transcription in the negative cell signaling regulation system in asthma

Full Text

АБА — аллергический вариант бронхиальной астмы БА — бронхиальная астма НАБА — неаллергический вариант БА IFN-γ — интерферон-γ IL — интерлейкин SOCS (suppressors of cytokine signaling) — супрессор сигнализации цитокинов В последнее время активно исследуется система белков SOCS (от англ.: suppressorsofcytokinesignaling — супрессоры сигнализации цитокинов), которая обеспечивает функционирование различных сигнальных систем. В нестимулированных клетках SOCS, как предполагается, имеют низкий уровень экспрессии. Одной из таких сигнальных систем, регуляцию которых осуществляет семейство белков SOCS, является сигнальная система JAK-STAT. Эта система состоит из Янускиназы и сигнального трансдуктора и активатора транскрипции и обеспечивает клеточную пролиферацию, дифференцировку, миграцию и апоптоз. Она преобразует множество цитокиновых сигналов и факторов роста. Ранее в ряде публикаций подробно рассматривались строение и функции этой системы, возможные ее нарушения при некоторых заболеваниях [1]. Что касается бронхиальной астмы (БА), то наиболее важная роль в патогенезе заболевания принадлежит, по мнению ряда исследователей, трем негативным регуляторам клеточной сигнализации из семейства белков SOCS, а именно, SOCS1, SOCS3 и SOCS5 [2]. Предполагается, что SOCS1 может ингибировать сигнализацию интерлейкина (IL)4 при активации пути ин-терферона-γ (IFN-γ), что препятствует активности таких альтернативно функционирующих цитокиновых систем, как IFN-γ и IL-4 [2]. Высокий уровень экспрессии SOCS1, вероятно, способствует угнетению сигнализации IL-13 в бронхолегочной системе [3]. В то же время IL-4 и IL-13, индуцируя экспрессию белка STAT6, приводят к активации SOCS1 и SOCS3, вызывая ингибирование сигнальных систем α-фактора некроза опухоли и IFN-γ [4]. При этом SOCS3 может являться основным регулятором нескольких цитокинов, в частности IL-6 и IL-10. Этот SOCS в основном представлен в лимфоцитах Th2 и ингибирует дифференциацию клеток Th1 [5]. Известно, что SOCS5 вовлечен в регулирование клеточной Th-дифференцировки через торможение сигнального пути IL-4, обеспечивающего дифференцировку в фенотип Th2 [4, 6]. В настоящее время считается, что SOCS1, SOCS3 и SOCS5 участвуют в Th-клеточной дифференцировке и влияют на баланс клеток Th1/Th2 [5, 7]. Основываясь на результатах предыдущих исследований [1], мы полагаем, что комплексное изучение компонентов негативной регуляции клеточной сигнализации позволит определить их роль в патогенезе БА и, по-видимому, позволит прогнозировать клинические особенности БА и возможные варианты терапии. Материалы и методы Нами обследован 171 человек: 140 больных БА и 31 практически здоровый. В 1-ю группу вошли 80 пациентов с аллергическим вариантом БА (АБА). Во 2-ю группу включены 60 больных с неаллергическим вариантом болезни (НАБА). Все обследованные больные БА находились на лечении в клинике госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого Первого Санкт-Петер-бургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (ПСПбГМУ им. И.П. Павлова). Всем больным проводили комплексное клинико-лабораторное обследование, а также аллергологическое и гормональное исследования. В каждой группе проводили исследование функции внешнего дыхания. Диагноз Б.А. устанавливали в соответствии с классификацией и критериями Международного консенсуса по вопросам диагностики и лечения БА (GlobalInitiativeofAsthma — GINA, 2013). Выделение мононуклеарных клеток периферической крови и исследование экспрессии мРНК SOCS5 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR) подробно описано ранее [1]. Работа выполнена на базе лаборатории Научно-методического центра по молекулярной медицине на базе ПСПбГМУ им. И.П. Павлова. Праймеры для SOCS1, SOCS3, SOCS5 и β-актина разработаны на основе известных последовательностей (GenBank). SOCS1 5′: 5′- CTGGGATGCCGTGTTATTTT -3′ и SOCS1 3′: 5’- TAGGAGGTGCGAGTTCAGGT -3′. SOCS3 5′: 5′- GCCACCTACTGAACCCTCCT -3′ и SOCS3 3′: 5’- GGTCTTCCGACAGAGATG -3′. SOCS5 5′: 5′- TGTGAGCCCACATTCAACAT-3′ и SOCS5 3′: 5’- ATGGGTATGGCTGTCTCCAG -3′. β-актин -5′: 5′-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3′ и β-актин -3′: 5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′. Уровень экспрессии мРНК SOCS оценивали относительно уровня β-актина. Экспрессию белков SOCS1 и SOCS3 исследовали методом иммуноблоттинга в соответствии с методикой ECLWesternblottingprotocols (Amersham). Концентрацию общего IgE сыворотки определяли методом иммуноферментного анализа с применением стандартной методики при использовании коммерческих наборов (DRG, Германия), уровень цитокинов — по стандартному протоколу на проточном флюориметре Biо-Plex. Анализ концентраций цитокинов выполнялся по определенному, установленному инструкцией, протоколу Bio-Rad-Plexc использованием проточного флюориметра Bio-Rad-Plex с применением 3 наборов: Bio-PlexHumanSerumDiluentKit, 96 well; Bio-PlexCytokineReagentKit, 96 well; Bio-PlexHumanCytokineTh1/Th2 PanelKit, 96 well. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью стандартного пакета прикладного статистического анализа SPSS для Windows (русифицированная версия 13.0). Различия считали значимыми при р<0,05. Результаты Разработанный ранее в нашей научной группе методологический подход дал возможность применить многоуровневый принцип оценки механизмов негативной регуляции клеточной сигнализации в лимфоцитах периферической крови больных Б.А. Для обобщения полученных нами результатов экспрессии негативных регуляторов клеточной сигнализации SOCS1, SOCS3 и SOCS5 мы составили обобщающую таблицу, позволяющую систематизировать сформированные представления (табл. 1). Согласно представленным данным больные АБА характеризуются более выраженными изменениями экспрессии всех трех исследованных нами SOCS (SOCS1, SOCS3 и SOCS5) как исходно, так и в условиях действия IL-4. При НАБА отмечаются выраженные изменения экспрессии только SOCS3 и в меньшей степени SOCS5. Таблица 1. Динамика уровней экспрессии SOCS1, SOCS3 и SOCS5 в обследованных группах Примечание. ↓ и ↓↓ — снижение экспрессии по сравнению с контрольной группой; ↑ и ↑↑ — повышение экспрессии по сравнению с контрольной группой; N — нормальные значения экспрессии, соответствующие контрольной группе; * — статистически значимое изменение экспрессии под действием IL-4; ↑N — экспрессия статистически значимо не отличатся от N. При анализе изменения экспрессии указанных негативных регуляторов транскрипции генов у больных БА нас, несомненно, интересовали уровни цитокинов, вызывающих активацию и повышение экспрессии соответствующих SOCS, в обследованных группах, а именно: IL- 4, который может индуцировать SOCS5 и SOCS1; IL-10, который может индуцировать SOCS3; IFN-γ, который может индуцировать экспрессию SOCS1. Результаты исследования концентраций IL-4, IL-10, IFN-γ представлены в табл. 2, 3, 4. Таблица 2. Уровни IL-4 в обследованных группах Примечание. Здесь и в табл. 3, 4: * — распределение отличается от нормального (по критерию Колмогорова—Смирнова p<0,05), поэтому используется непараметрическая статистика: медиана (25-й процентиль; 75-й процентиль); ** — распределение отличается от нормального, поэтому использован критерий Н независимых выборок Крускала—Уоллеса, *** — медианный тест, # — уровень значимости при сравнении двух независимых выборок; применен критерий U Вилкоксона—Манна—Уитни. Таблица 3. Уровни IL-10 в обследованных группах Примечание. *** — критерий Джонкхира—Терпстры для парного сравнения между собой более двух групп, # — медианный тест, ## — уровень значимости при сравнении двух независимых выборок; применен критерий U Вилкоксона—Манна—Уитни. Таблица 4. Уровни IFN-γ в обследованных группах Анализируя данные табл. 2, 3, 4, можно предположить следующее: 1) снижение экспрессии мРНК и белка-регулятора SOCS1 у больных АБА может быть обусловлено увеличение концентрации IFN-γ; 2) повышение концентрации IL-10 при НАБА может приводить к усилению экспрессии белка-регулятора SOCS3; 3) снижение концентрации IL-4 в плазме крови при АБА и НАБА на первый взгляд представляется неожиданным и не совсем типичным; тем не менее, во-первых, будучи активным участником механизмов воспаления при БА, он может локализоваться большей частью в органе-мишени; во-вторых, запуская процессы цитокиновой сигнализации, в дальнейшем он может подавляться активируемыми SOCS (SOCS5, который по нашим данным повышается у больных БА). По данным литературы, обращает особенное внимание наибольшая активность сигнализации IL-4 в бронхах именно при данном варианте заболевания [8]. Обсуждение Нами показано, что для АБА характерно выраженное снижение экспрессии негативного регулятора транскрипции генов мРНК SOCS1 и белка-регулятора SOCS1 в лимфоцитах периферической крови по сравнению с таковым в контрольной группе и группе больных НАБА. Это представляется достаточно закономерным с учетом выявленного нами повышения основного индуктора данного SOCSIFN-γ у больных данной группы. При этом у больных АБА нами выявлена наиболее высокая способность SOCS1 к активации IL-4, проявляющаяся в нарастании экспрессии как мРНК SOCS1, так и белка-регулятора. Это подтверждает многофункциональную роль данного SOCS, участвующего в регуляции различных сигнальных путей. У больных БА с уровнем IgE >120 МЕ/мл (выше лабораторной нормы) отмечаются более высокие уровни экспрессии SOCS1 и мРНК SOCS1, что позволяет предполагать повышение экспрессии данного негативного регулятора в ответ на активацию сигнализации IL-4. При исследовании уровня экспрессии мРНК SOCS1 в динамике у больных НАБА нами выявлено выраженное нарастание экспрессии мРНК SOCS1 в фазе ремиссии БА у данной группы. При этом в условиях действия IL-4 подобных отличий не отмечается. Данный факт, по-видимому, позволяет предполагать, что при обострении БА наблюдаемое снижение мРНК SOCS1 может быть обусловлено повышением активности сигнализации IL-4. Отсутствие изменений при АБА косвенно может свидетельствовать о сохранении нарушений регуляции экспрессии мРНК SOCS1 и в фазе ремиссии. Таким образом, можно предположить, что полученные нами изменения экспрессии негативного регулятора транскрипции генов SOCS1 связаны с клинико-патогенетическими особенностями БА и, вероятно, отражают концепции генетической детерминированности биологических дефектов, а также гетерогенности и комплексности нарушений регуляции сигнальных систем при этом заболевании. При исследовании особенностей экспрессии негативного регулятора транскрипции генов SOCS3 на примере лимфоцитов периферической крови отмечено, что у больных БА (как АБА, так и НАБА) отмечается уменьшение уровня экспрессии мРНК SOCS3 по сравнению с контрольной группой, более выраженное у больных АБА. Противоположную направленность имеет изменение экспрессии белка-регулятора SOCS3: у всех больных БА (как АБА, так и НАБА) отмечается увеличение уровня экспрессии SOCS3 по сравнению с контрольной группой. При этом условиях действия IL-4 отмечается увеличение экспрессии как мРНК SOCS3, так и белка-регулятора SOCS3 во всех обследованных группах, более существенное в группе больных НАБА. Исходя из изложенного повышение экспрессии мРНК SOCS3 может рассматриваться как протективный ответ, направленный против выраженного воспалительного процесса. Данный факт может послужить основой в разработке принципиально новых терапевтических направлений [9]. Следует отметить, что SOCS3 может, по-видимому, участвовать в механизмах утяжеления АБА. Так, нами установлено, что у больных АБА уровни экспрессии мРНК SOCS3 повышены при тяжелом течении заболевания по сравнению с группой больных легким и среднетяжелым течением заболевания. Изучение уровней экспрессии мРНК SOCS5 выявило положительную корреляцию между концентрацией IL-4 в плазме крови и уровнями экспрессии мРНК SOCS5. Закономерно также наличие положительной корреляции между концентрациями IFN-γ и IL-4 и IL-10 в плазме крови, указывающие на взаимодействие и взаимную регуляцию различных сигнальных путей. В группе больных АБА с высоким уровнем общего IgE в сыворотке крови экспрессия мРНК SOCS5 существенно выше, чем у больных с уровнем в сыворотке крови общего IgE <120 МЕ/мл, что подтверждает роль повышения экспрессии SOCS5 в регуляции сигнализации IL-4 и IL-13. Следует отметить, что ряд эффектов IL-4 и IL-13 развивается без участия сигнализации STAT6. В частности, IL-4 и IL-13 участвуют в регуляции сигнальных путей метаболизма арахидоновой кислоты — лейкотриеновом, простагландиновом и липокиновом. Отдельное внимание нами уделено больным аспириновой Б.А. Для больных этой группы характерно более тяжелое течение заболевания; у них выявлялась полная астматическая триада (непереносимость нестероидных противовоспалительных препаратов с развитием приступов экспираторного удушья, наличие БА и полипозного риносинусита). Нами показано повышение экспрессии мРНК SOCS5, что косвенно указывает на повышение сигнализации IL-4 и IL-13 у больных этой группы. Полученные данные позволяют рассматривать сложность нарушений регуляции, возникающих на различных уровнях клеточной сигнализации, с позиций полифункциональности молекул семейства негативных регуляторов транскрипции генов SOCS1, SOCS3 и SOCS5, обеспечивающих комплексный контроль цитокиновой сигнализации одновременно в различных сигнальных путях. Заключение При БА в фазе обострения в лимфоцитах периферической крови выявлены изменения в уровнях экспрессии негативных регуляторов транскрипции генов SOCS1, SOCS3 и SOCS5, соответствующие варианту заболевания и его тяжести. Для АБА характерно снижение уровней экспрессии мРНК SOCS1 и мРНК SOCS3 и повышение мРНК SOCS5 по сравнению с контрольной группой в лимфоцитах периферической крови. Уровни экспрессии SOCS1, SOCS3 и SOCS5 при АБА зависят от тяжести течения, достигая максимальных значений при тяжелом течении, что может играть патогенетическую роль в утяжелении заболевания. При АБА в фазе ремиссии не выявлено изменений уровней экспрессии SOCS1, SOCS3 и SOCS5, что косвенно может свидетельствовать о сохранении нарушений регуляции экспрессии как проявления дефектности негативного контроля и в фазе ремиссии. В группе больных АБА установлено наличие подгруппы с высоким уровнем IgE >120 МЕ/мл, которая характеризуется нарастанием экспрессии SOCS1, мРНК SOCS1, мРНК SOCS5, что позволяет предполагать связь повышения экспрессии этих негативных регуляторов с активацией сигнализации IL-4. Для НАБА характерны снижение мРНК SOCS3 и нарастание мРНК SOCS5 в лимфоцитах периферической крови по сравнению с контрольной группой. Уровни экспрессии мРНК и белка SOCS1, SOCS3 и мРНК SOCS5 при НАБА не изменяются в зависимости от тяжести течения заболевания, что может быть обусловлено более высокой распространенностью тяжелого течения БА у больных НАБА. При НАБА в фазе ремиссии не выявлено изменений уровней экспрессии мРНК и белка SOCS3 и мРНК SOCS5, что косвенно может указывать на сохранение нарушений негативной регуляции и в фазе ремиссии. При исследовании в условиях активации IL-4 установлено, что данный интерлейкин повышает экспрессию мРНК SOCS1 в лимфоцитах больных АБА и экспрессию мРНК SOCS3 в лимфоцитах больных НАБА, а это может свидетельствовать о функциональной роли этих негативных регуляторов при сдвиге баланса Th1/Th2 в сторону Th2. Конфликт интересов отсутствует.

About the authors

L N Sorokina

V N Mineev

V V Lim

References

Supplementary files