Independent risk factors for severe cardiovascular events in male patients with gout: Results of a 7-year prospective study

Full Text

АГ — артериальная гипертония АД — артериальное давление вч-СРБ — высокочувствительный C-реактивный белок ДИ — доверительный интервал ИБС — ишемическая болезнь сердца ИМ — инфаркт миокарда ИМТ — индекс массы тела МК — мочевая кислота МКБ-10— Международная классификация болезней 10-го пересмотра МС — метаболический синдром ОР — относительный риск ОШ — отношение шансов СД-2— сахарный диабет 2-го типа СЖ — синовиальная жидкость СКФ — скорость клубочковой фильтрации ССЗ — сердечно-сосудистые заболевания ССО — сердечно-сосудистые осложнения ФР — фактор риска ХБП — хроническая болезнь почек ХСН — хроническая сердечная недостаточность NCEP — Национальная образовательная программа по холестерину Подагра — самая частая причина воспалительного артрита у взрослых мужчин; ее распространенность увеличивается, достигая 3,97% среди мужчин в Великобритании и 5,9% — в США [1—3]. Кроме того, подагра может быть ассоциирована с риском смерти как от всех причин, так и от сердечно-сосудистых осложнений (ССО) [4—7]. Подагра увеличивает риск развития острого инфаркта миокарда (ИМ), острого нарушения мозгового кровообращения, систолической дисфункции, почечной недостаточности [8—11]. Наличие подагры и гиперурикемии может быть независимым предиктором неблагоприятного исхода у больных острым ИМ, сердечной недостаточностью и острым нарушением мозгового коровообращения (ОНМК) [12—15]. Однако распространенность у пациентов с подагрой традиционных факторов риска (ФР) развития тяжелых ССО, таких как артериальная гипертония (АГ), ожирение, гиперхолестеринемия, сахарный диабет 2-го типа (СД-2), а также метаболического синдрома (МС), не может в полной мере служить объяснением этого [4, 6]. Многие исследования позволяют считать гиперурикемию у пациентов с подагрой независимым ФР развития тяжелых ССО [12, 15, 16], но не все исследования подтверждают эту гипотезу [5, 6]. Возможным ФР развития тяжелых ССО может быть воспаление, которое сопровождает острый подагрический артрит [17], но может сохраняться и в межприступном периоде [18]. Предполагается, что иммунный ответ стимулируется кристаллами моноурата натрия, посредством активации Толл-подобных рецепторов, предполагая аутовоспалительный механизм развития [19]. Кроме того, повышенные концентрации уратов при подагре ведут к высвобождению миелопероксидазы из нейтрофилов [20], что может играть роль в развитии атеросклеротического повреждения и риске смерти от ССО, особенно при наличии хронического воспаления [21, 22]. Кроме того, гиперурикемия является посредником дисфункции эндотелия и воспаления, индуктором окислительного стресса, вызванного активацией ксантиноксидазы [23—25]. В настоящее время есть только одно исследование, в котором проверена гипотеза о влиянии неконтролируемой гиперурикемии у больных подагрой и тяжести подагры на риск смерти [7], и нет данных о том, что контроль урикемии и подагрического воспаления может снижать риск развития смертельных ССО. Цель настоящего исследования — определение ФР развития тяжелых ССО, включая традиционные факторы, клинические проявления подагры, гиперурикемию и уровень высокочувствительного С-реактивного белка (вч-СРБ) в сыворотке крови. Материалы и методы Структура исследования. В проспективное одноцентровое когортное исследование включили 301 пациента мужского пола с кристалловерифицированной подагрой из 407, прошедших обследование в ревматологическом отделении лаборатории микрокристаллических артритов ФГБНУ «НИИР им. В.А. Насоновой» с 2003 по 2006 г. Исключены из исследования 106 пациентов: 45 не соответствовали критериям включения/исключения, 61 отказался от участия и не подписал информированное согласие. Пациентов повторно обследовали в 2010—2012 гг. При этом 50 больных потеряны для наблюдения в процессе исследования. В окончательный анализ включен 251 пациент с подагрой. Средний период наблюдения 6,9±2 года (1727 человеко-лет). Критерии включения: кристалловерифицированная подагра, мужской пол, возраст ≥18 лет, проживание в Москве и Московской области, отсутствие других ревматических заболеваний, псориаза и кристаллов пирофосфата кальция в синовиальной жидкости (СЖ), подписанное согласие для участия в исследовании. Критерии исключения: гематологические злокачественные новообразования или другие злокачественные заболевания (в прошлом или на момент включения), гематологические заболевания, тяжелые иммунодефицитные состояния, острый туберкулез, позитивность по ВИЧ, трансплантация органов, хронические вирусные гепатиты, цирроз печени, терминальная стадия почечной недостаточности, диализ, операция шунтирования коронарных артерий или коронарная ангиопластика. Этика. Исследование проведено после предварительного утверждения региональным комитетом по этике исследований. Все пациенты подписали информированное согласие. Сбор данных. Данные, собранные исходно и при последующем визите, включали возраст, пол, антропометрические данные, семейный анамнез подагры и ранние сердечно-сосудистые заболевания — ССЗ (в возрасте моложе 55 лет); курение, употребление алкоголя (в условных единицах); наличие сочетанных заболеваний, таких как артериальная гипертония — АГ (систолическое артериальное давление — АД >140 мм рт.ст. или диастолическое АД >90 мм рт.ст. или использование антигипертензивных препаратов), сахарный диабет 2-го типа — СД-2 (диагностические критерии СД-2, рекомендованные ВОЗ), ССЗ, ожирение (индекс массы тела — ИМТ >30 кг/м2), гиперхолестеринемия (общий холестерин >190 мг/дл), метаболический синдром — МС (критерии Третьего доклада национальной образовательной программы по холестерину — NCEP). Функцию почек оценивали по клиренсу креатинина с использованием 24-часового сбора мочи. Клинически значимую почечная недостаточность определяли при снижении скорости клубочковой фильтрации (СКФ) <60 мл/мин/1,73 м2. Кроме того, проанализированы следующие специфические симптомы и признаки подагры: время от момента появления первого приступа артрита, число воспаленных суставов на момент исследования, наличие подкожных тофусов, продолжительность последнего приступа артрита и количество обострений подагры за предшествующий год. Учитывали все лекарственные препараты, употребляемые пациентом (уратснижающие, нестероидные противовоспалительные, колхицин, глюкокортикостероиды, диуретики, гиполипидемические, антигипертензивные, антикоагулянты). В начале исследования и при последующих визитах проконтролированы уровень мочевой кислоты (МК) в сыворотке крови, рентгенограммы кистей и стоп, данные электро- и эхокардиографии. Все указанные переменные в начале исследования и при последующих визитах включены в анализ. Определение неблагоприятных исходов. Смертность, независимо от причины, фиксировали на протяжении всего периода наблюдения. Причины смерти устанавливали на основании свидетельств о смерти пациентов, а затем классифицировали в соответствии с Международной классификацией болезней десятого пересмотра (МКБ-10) как раковые заболевания (С00—В48), заболевания сердечно-сосудистой системы (I00—I99), заболевания дыхательной системы (J00—J98), болезни крови и кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм (D50—D89), и внешние причины смерти (V01—Y89). Смерть связывали с ССЗ в случае, если причины смерти по МКБ-10 содержали коды I21 (острый ИМ), I50 (сердечная недостаточность), I61 (нетравматическое внутримозговое кровоизлияние), I63 (инфаркт мозга), I71 (аневризма аорты и рассечение), I74 (эмболия и тромбоз артерий) [26, 27]. Все вновь развившиеся случаи нефатальных ССО (ИМ, инсульт), которые определены при последующих посещениях кардиолога на основании медицинской документации, результатов медицинского обследования и диагностических процедур. Всем пациентам проводили электро- и эхокардиограммы. Статистический анализ. В логистической регрессионной модели зависимая интересующая переменная была дихотомичной переменной, обозначающей случай возникновения или отсутствия развития всех (фатальных и нефатальных) ССО и фатальных тяжелых ССО. Переменные, обнаруживающие возможную статистическую связь с тяжелыми ССО в одномерном анализе (р<0,2), выбраны для многомерного анализа логистической регрессии. Отношение шансов (ОШ) и 95% доверительные интервалы (ДИ от) развития всех тяжелых ССО и фатальных тяжелых ССО для этих переменных представлены в одно- и многомерном анализах. Для определения различий оцениваемых показателей на момент начала исследования и при динамическом наблюдении использованы критерии χ2, t Стьюдента и U Манна—Уитни. Все значения р были двусторонними, значения р<0,05 считали статистически значимыми. Выживаемость пациентов по методу Каплана—Мейера определяли исходя из уровня вч-СРБ: ≥5 мг/л (у 193 пациентов) или <5 мг/л (у 58 пациентов). Кривые Каплана—Мейера по уровню вч-СРБ ≥5 мг/л или <5 мг/л построены для обоих основных оцениваемых исходов («первичных конечных точек» — смерти от всех причин и смерти от ССО и сравнивали с использованием логарифмического рангового тестов. Статистический анализ проводили с использованием статистического пакета Statistica 10,0 («StatSoft Inc.», США). Результаты Окончательная когорта состояла из 251 пациента преимущественно с тяжелым течением подагры. Средний возраст на момент включения 57,7±8,9 года. Исходно всем больным назначены уратснижающие препараты (аллопуринол) в широком диапазоне доз для достижения целевого уровня МК в сыворотке крови. Регулярные визиты между двумя точками наблюдения были не обязательными, что приближает данное исследование к клинической практике. Повторные госпитализации и консультации зафиксированы у 53% больных. Более 50% пациентов сообщили о регулярном или прерывистом приеме уратснижающей терапии за время наблюдения. Целевой уровня МК в сыворотке крови (<360 мкмоль/л) выявлен только у 17% больных, что может отражать низкий уровень соблюдения схем назначенного лечения и недостаточные дозы препаратов вследствие плохого контроля. Характеристики обследованных больных на момент начала исследования и при динамическом наблюдении представлены в табл. 1. Видно, что тяжесть течения подагры в когорте за время наблюдения не увеличилась, однако частота развития сопутствующих заболеваний резко возросла (АГ, СД-2, ИБС, ХСН). Средний период наблюдения составил 6,9±2 года (медиана 7,07 года при 95% ДИ от 0,23 до 9,71 года; 1727 человеко-лет). За это время умерли 32 (13%) пациента. У 22 (69%) из них смерть связана с ССЗ: острый ИМ — у 4 (12%), сердечная недостаточность у 9 (29%), нетравматическое внутримозговое кровоизлияние или инфаркт мозга у 6 (19%), аневризма аорты и ее рассечение у 1 (3%), эмболия и тромбоз артерий у 2 (6%). Таблица 1. Клиническая характеристика больных с подагрой на момент начала исследования и при динамическом наблюдении Примечание. Данные представлены в виде абсолютного числа больных (%), медианы (25-й процентиль; 75-й процентиль) или M±SD. ХСН — хроническая сердечная недостаточность; ХБП — хроническая болезнь почек. Другими причинами смерти были раковое заболевание у 5 (16%) больных, заболевание крови и кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм — у 2 (6%), заболевание дыхательной системы — у 1 (3%) и внешние причины смерти — у 2 (6%). Кроме того, у 36 больных впервые выявлены нефатальные тяжелые ССО. В целом определено 58 случаев тяжелых ССО (фатальных и нефатальных). В одномерном анализе выбраны переменные, которые могли быть ассоциированы с риском развития всех тяжелых ССО и фатальных тяжелых ССО (табл. 2). Таблица 2. ОШ (одномерный анализ) для переменных, ассоциированных с увеличением риска всех тяжелых ССО (фатальных и нефатальных) и фатальных тяжелых ССО Переменные, которые могли быть ассоциированы с риском развития всех тяжелых ССО, выбраны для многомерного анализа логистической регрессии: возраст ≥45 лет, предшествующие тяжелых ССО, семейный анамнез преждевременной ИБС (возраст <55 лет), СД-2, АГ, ожирение, МС, ИБС, ХСН, ХБП ≥III стадии, курение, прием алкоголя (>20 г/сут), прием диуретиков, гиперхолестеринемия, уровень вч-СРБ в сыворотке крови (>5 мг/л); переменные, характеризующие подагру (уровень в сыворотке крови МК >360 мкмоль/л и >552 мкмоль/л (верхний квартиль), хронический подагрический артрит, подкожные тофусы, прием аллопуринола). Логистический регрессионный анализ показал, что только 5 переменных обнаруживали независимую ассоциацию со всеми тяжелыми ССО: повышенный уровень вч-СРБ 5,71 (при 95% ДИ от 1,57 до 20,77), ХБП ≥III стадии 4,76 (95% ДИ от 1,62 до 13,99), прием алкоголя 4,23 (95% ДИ от 1,16 до 15,39), ИБС 3,67 (95% ДИ от 1,35 до 10,00), семейный анамнез преждевременной ИБС 3,09 (95% ДИ от 1,32 до 7,26). Уровень М.К. >360 мкмоль/л и >552 мкмоль/л (верхний квартиль) в сыворотке крови не ассоциировался с риском развития всех тяжелых ССО (рис. 1, а). Рис. 1. OШ (многомерный анализ, логистическая регрессия) для переменных, ассоциированных с увеличением риска развития всех тяжелых ССО (фатальных и нефатальных; а) и фатальных тяжелых ССО (б). ОШ фатальных тяжелых ССО рассчитано отдельно. В логистический регрессионный анализ включили следующие переменные: возраст ≥45 лет, предшествующие тяжелые ССО, семейный анамнез преждевременной ИБС (возраст <55 лет), СД-2, АГ, ожирение, МС, ИБС, ХСН, ХБП ≥III стадии, курение, прием алкоголя (>20 г/сут), прием диуретиков, гиперхолестеринемия, уровень вч-СРБ (>5 мг/л) в сыворотке крови; переменные, характеризующие подагру: уровень МК >360 мкмоль/л и >552 мкмоль/л (верхний квартиль) в сыворотке крови, хронический подагрический артрит, подкожные тофусы, прием аллопуринола. Логистический регрессионный анализ показал, что для фатальных тяжелых ССО обнаруживали ассоциацию следующие переменные: повышенный уровень вч-СРБ 14,26 (95% ДИ от 1,36 до 149,19), ХБП ≥III стадии 8,42 (95% ДИ от 1,63 до 43,38), семейный анамнез преждевременной ИБС7,53 (95% ДИ от 1,42 до 40,01), гиперхолестеринемия 3,72 (95% ДИ от 1,27 до 10,93) и прием аллопуринола 4,47 (95% ДИ от 1,02 до 19,52). Среди клинических показателей подагры только верхний квартиль уровня МК (>552 мкмоль/л) в сыворотке крови ассоциировался с риском развития фатальных тяжелых ССО (см. рис. 1, б). Кривые выживаемости начали различаться в первые несколько лет наблюдения. У больных с высоким уровнем вч-СРБ (≥5 мг/л) имелся повышенный риск смерти от всех причин (логранговый критерий 5,681; р<0,05) и смертности от ССЗ (логранговый критерий 3,905; р<0,05). Кривые выживаемости Каплана—Мейера у пациентов с вч-СРБ выше (n=193) или ниже (n=58) 5 мг/л отражены на рис. 2, а и б соответственно. Рис. 2. Кривая выживаемости Каплана—Мейера пациентов с уровнем вч-СРБ ≥ 5 мг/л (n=193) или < 5 мг/л (n=58). а — общая смертность; б —смертность от ССО. Обсуждение Очевидно, что для создания оптимальной профилактической стратегии для ССО необходимо знать, какие ФР могут при этом иметь решающее значение. В этом отношении подагра — оптимальная модель для изучения, так как помимо гиперурикемии и воспаления связана с СД-2, АГ, МС, почечной недостаточностью, дислипидемией и ССЗ, а высокая смертность от ССЗ у больных подагрой показана в ряде эпидемиологических и экспериментальных исследований [4, 5, 9, 28, 29]. Недавно проведенный метаанализ демонстрирует, что подагра увеличивает риск смерти от ССЗ и развития ИБС независимо от сосудистых ФР [30]. Традиционно причиной этого рассматривают гиперурикемию. Она как важнейшая и, возможно, единственная причина развития подагры может быть, во-первых, связующим звеном между подагрой и сочетанными заболеваниями, во-вторых, независимо влиять на риск развития атеросклероза [31, 32]. Гиперурикемия связана с АГ [33, 34], но, независимо от нее и других факторов, влияет на атерогенез, пагубно воздействуя на функцию эндотелия, индуцируя продукцию провоспалительных и прооксидантных веществ, адгезивность тромбоцитов [35, 36]. Однако исследования, в которых изучалась ассоциация гиперурикемии и риска смерти от ССЗ, дают противоречивые результаты. По данным метаанализа от 2005 г., измерение уровня МК в сыворотке крови едва ли полезно для уточнения прогноза ИБС, и этот фактор вряд ли является определяющим ФР заболевания в общей популяции [37]. Кроме того, чем больше скорректированных ФР включено в исследование, тем меньше была роль М.К. Исследования в рамках метаанализа, в которых использовались 8—9 факторов, показали, что уровень МК в сыворотке крови не влиял на относительный риск развития ИБС. Если в популяции гиперурикемия не является или является слабым предиктором ССЗ, то она становится прогностически значимым независимым ФР у пациентов с высоким или очень высоким риском развития ССЗ [38]. При этом в условиях локальной ишемии наряду с активацией окислительного стресса и продукцией активных форм кислорода, одновременно с активацией ксантиноксидазы происходит увеличение образования МК, а не только снижение экскреции, которое развивается при ожирении, инсулино- и лептинорезистентности, снижении функции почек, АГ [39]. Возможно, что в этих условиях мощная антиоксидантная активность МК преодолевается прооксидантными и провоспалительными эффектами, обусловленными накоплением активных форм кислорода [38]. Однако неясно, какой степени должны быть активация окислительного стресса и образование свободных радикалов под влиянием повышенного уровня МК в сыворотке крови, и если это в свою очередь вызывает воспалительную реакцию и повреждение сосудистой стенки, то при каком именно уровне МК в сыворотке может уменьшаться риск развития тяжелых ССО. В исследовании F. Perez-Ruiz и соавт. [7] достоверное влияние на риск смерти от ССЗ у больных подагрой оказывал уровень МК только в верхних квартилях (59,5 ммоль/л) и это влияние было очень умеренным по сравнению с другими факторами (относительный риск 1,16 при 95% ДИ от 1,03 до 1,32). Наши результаты оказались сопоставимыми: уровень МК в сыворотке крови так же связан с риском смерти от ССЗ только в верхнем квартиле. Другой результат нашего исследования состоял в том, что мы не выявили благоприятного влияния терапии аллопуринолом на риск развития тяжелых ССО. Более того, прием аллопуринола был связан с небольшим увеличением этого риска. Данный факт можно объяснить тем, что большинство наших пациентов не достигли целевого уровня МК в сыворотке крови, а дозы аллопуринола были низкими. Аллопуринол улучшает функцию эндотелия путем глубокого снижения сосудистого окислительного стресса и уменьшает массу левого желудочка, но это показано только при высоких дозах приема препарата (600 мг ежедневно) [40]. В когортном исследовании с использованием записей из базы данных, проведенном с целью изучения влияния терапии аллопуринолом на риск развития тяжелых ССО и смертность, показано, что более высокие, но не низкие, дозы аллопуринола связаны с лучшим контролем уровня уратов и меньшим риском развития тяжелых ССО и смерти [41]. Влияние аллопуринола на АД может также зависеть от дозы и быть очень умеренным [42]. В крупном популяционном исследовании, спроектированном с целью выявления связи между терапией аллопуринолом и последующим риском развития тяжелых ССО, показано наличие ассоциации между терапией аллопуринолом для больных подагрой и увеличением катастроф, связанных с ССЗ. Авторы высказали гипотезу, что возможно терапия аллопуринолом может служить в качестве прогностического фактора, предполагая худший исход тяжелых ССО. В то же время, по данным M. Dubreuil и соавт. [43], прием аллопуринола пациентами с подагрой снижал на 19% кумулятивную частоту смерти от любой причины. Подобный анализ, проведенный в рамках этого исследования для пациентов, принимающих аллопуринол по любой причине (страдали подагрой только 84%), также показал достоверное снижение риска смерти, но на 11%. Как и в недавнем исследовании F. Perez-Ruiz и соавт. [7], мы включили в анализ параметры тяжести подагры. Однако в отличие от данных F. Perez-Ruiz и др. мы не получили ассоциацию между параметрами, отражающими тяжесть подагры, и риском смерти от ССО и развития тяжелых ССО, но обнаружили таковую между упомянутыми выше рисками и воспалением. В настоящее время исследование гипотезы, согласно которой воспаление может играть главную роль на всех этапах атеротромботического процесса, вышел из рамок лабораторных доказательств в клинические исследования, объединяя воспалительные биомаркеры, такие как вч-СРБ, с риском будущих тяжелых ССО, и поиском пользы от терапии, направленной на снижение риска развития тяжелых ССО путем влияния на воспаление [44, 45]. В настоящее время хроническое воспаление рассматривается как ключевой фактор риска развития тяжелых ССО у пациентов с ревматоидных артритом, спондилоартритом и псориатическим артритом, как и традиционные ФР, поскольку адекватный контроль активности заболевания рекомендован для снижения риска развития тяжелых ССО [46]. Острое воспаление считается характерным признаком подагрического воспаления. Существуют данные, что обострение подагры связано с увеличением риска неблагоприятного исхода от сердечной недостаточности и смерти от всех причин [15]. Однако подагра сопровождается хроническим воспалением. У пациентов с нелеченой подагрой в межприступный период повышено количество лейкоцитов в СЖ по сравнению с теми, у кого урикемия хорошо контролируется [18]. J. Carter и соавт. [47] обнаружили хроническое воспаление синовиальной оболочки, подтвержденное выявлением синовиального паннуса на усиленных с помощью контрастирования магнитно-резонансных снимках у 63 (87,5%) из 72 больных с подагрой в межприступный период. Следует отметить, что они не обнаружили корреляции между наличием или тяжестью синовиального паннуса и уровнем МК в сыворотке крови. Вместе с тем отложения кристаллов моноурата натрия и субклиническое воспаление в тканях пациента с подагрой могут быть найдены до первого приступа подагрического артрита [48, 49]. Кроме того, у пациентов с подагрой, обследованных дважды, в период острого приступа артрита и в межприступный период, количество воспаленных суставов по данным ультразвукового исследования не уменьшилось и уровень вч-СРБ был сопоставимым [50]. Возможно, это было типичное для подагры хроническое воспаление, что может быть самым важным фактором, не зависящим от клинических проявлений и, возможно, интенсивности гиперурикемии. Исследование имело некоторые ограничения, основным из которых можно считать небольшое число участников. Это ограничение частично компенсировано длительностью периода наблюдения и, таким образом, высокой частотой развития зарегистрированных тяжелых ССО. Несмотря на то что исследование было проспективным, визиты пациентов были не обязательными. Кроме того, мы не сделали отдельный анализ первичных и вторичных тяжелых ССО. Наконец, поскольку пациенты наблюдались в научном учреждении, мы можем предположить, что они имели более тяжелое течение подагры, чем те, которые наблюдались врачом первичного звена или ревматологом в других медицинских центрах. Преимуществом этого исследования является то, что все больные продиагностированы только после того, как кристаллы моноурата натрия были определены в С.Ж. Таким образом, мы полностью избежали набора в исследование пациентов с ошибочно диагностируемой подагрой. Например, А. Malik и соавт. [51] установлено, что прогностическое значение различных классификационных и диагностических критериев подагры не превышало 70% по сравнению с «золотым стандартом» диагностики подагры путем идентификации в СЖ кристалла. Кроме того, клинические характеристики подагры при динамическом наблюдении включены нами в анализ, в то время как исследования, основанные на анализе обширных национальных баз данных, не имеют такой возможности. В заключение, согласно нашим результатам мы предполагаем, что, помимо традиционных ФР, наличие хронического воспаления и высокого уровня МК в сыворотке крови может объяснить высокую частоту как фатальных, так и нефатальных тяжелых ССО у пациентов с подагрой. Благодарности. Статья посвящена памяти проф. В.Г. Барсковой, заведовавшей лабораторией микрокристаллических артритов ФАНО ФГБНУ «НИИР им. В.А. Насоновой» (Москва, Россия). Авторы выражают благодарность за помощь в проведении исследования И.А. Якуниной, Е.В. Ильиных, Ф.M. Кудаевой, С.А. Владимирову (ФАНО ФГБНУ «НИИР им. В.А. Насоновой» (Москва, Россия). Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

M S Eliseev

I S Denisov

E I Markelova

S I Glukhova

E L Nasonov

References

Supplementary files