Plasma low-molecular-weight DNA in patients with chronic obstructive pulmonary disease

Full Text

внмДНК — внеклеточная низкомолекулярная ДНК ОФВ1 — объем форсированного выдоха за 1-ю секунду РЛ — рак легкого РПЛР — родственники первой линии родства ФР — фактор риска ХНБ — хронический необструктивный бронхит ХОБЛ — хроническая обструктивная болезнь легких Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) — заболевание, характеризующееся нарушением вентиляционной функции легких по обструктивному типу, которое обычно прогрессирует и связано с хроническим воспалительным ответом легких на действие патогенных факторов. По данным ВОЗ, в мире в настоящее время около 200 млн людей страдают ХОБЛ, данная патология занимает четвертое место среди причин смерти, заболеваемость ХОБЛ растет глобально и в большинстве стран; прогнозируется, что в 2030 г. ХОБЛ может занять третье место среди причин смерти [1]. В связи с этим разработка новых методов профилактики, диагностики и лечения ХОБЛ является крайне актуальной. ХОБЛ является фактором риска (ФР) развития рака легкого (РЛ). Преобладание ХОБЛ и РЛ у курильщиков старшего и пожилого возраста с длительным периодом курения свидетельствует о связи между этими заболеваниями. Однако вне связи с курением ХОБЛ считают независимым ФР развития РЛ. В ряде проспективных эпидемиологических исследований доказан высокий риск развития РЛ у больных ХОБЛ: в данных исследованиях в когортах пациентов с ХОБЛ смертность от РЛ составляла от 4 до 33% [2]. Механизмами, повышающими риск развития РЛ, у больных ХОБЛ являются задержка вдыхаемых канцерогенов в легких, стимуляция канцерогенеза в результате хронического воспаления, вовлечение стволовых клеток [2]. ХОБЛ развивается в результате сложного взаимодействия генетических факторов и факторов окружающей среды. В настоящее время доказана роль наследственности в развитии ХОБЛ — вероятно, наследуется предрасположенность к ХОБЛ. Идентифицирован ряд генов, нарушения работы которых ассоциированы с ХОБЛ. Наиболее изучен при ХОБЛ ген SERPINA 1, нарушения которого вызывают дефицит α1-антитрипсина, влияющего на эластазу легких; идентифицированы локусы генов, имеющих отношение к снижению функции внешнего дыхания при ХОБЛ, такие как TNS1, GSTSD, AGEF, HTR4, TNSD4; ХОБЛ ассоциирована с нарушениями локуса гена KANSL1, вызывающего ацетилирование и связанного с эпигенетической регуляцией генома; выявляются и другие генетические дефекты, повышающие риск развития ХОБЛ [3]. Среди экзогенных причин наиболее важным фактором в развитии и прогрессировании ХОБЛ считается курение. В многочисленных исследованиях удельный вес курения как ФР развития ХОБЛ составлял от 9,7 до 97,9% [4]. Показана прямая зависимость влияния курения на усугубление ХОБЛ: например, в группах пациентов с ХОБЛ у курящих частота обострений составила 71,8%, у некурящих — 32,1% [5]. К важным ФР развития ХОБЛ относят воздействие на легкие воздушных поллютантов на производстве, на улице, в быту, таких как угольная пыль, дым, корма для животных, выбросы автотранспорта и тепловых электростанций, кремний, кадмий, диоксид азота, монооксид углерода, сера, формальдегид, летучие органические соединения, биологические аллергены и др. [4, 6]. Риновирусная инфекция и другие респираторные инфекции, бронхиальная астма, пневмонии, особенно в детском возрасте, рассматриваются как ФР и причины обострения ХОБЛ [4, 6, 7]. Возраст также считают важным фактором риска развития ХОБЛ, так как данное заболевание развивается в основном у людей старше 40 лет; по оценкам возрастного состава пациентов с ХОБЛ примерно 40% приходится на возраст от 40 до 60 лет и 60% — старше 60 лет [6]. Патогенез ХОБЛ — сложный процесс, в основе которого лежат протеазный/антипротеазный дисбаланс, иммунные нарушения, окислительный стресс, хроническое воспаление дыхательных путей, поражение эндотелия сосудов легких, дисрегуляция апоптоза [4]. Апоптоз играет особую роль в патогенезе ХОБЛ, так как именно в результате активации апоптоза происходит гибель эпителиальных и мезенхимальных клеток легких, в итоге приводящее к деструкции легочной ткани и развитию эмфиземы; однако ингибирование апоптоза является защитной реакцией против деструкции легких [8]. Вероятно, поэтому результаты оценки апоптоза у больных ХОБЛ являются противоречивыми; сообщается как об активации, так и об ингибировании апоптоза. Интегральным показателем апоптоза, который применяется для диагностики, оценки прогноза и эффективности лечения больных, служит внеклеточная низкомолекулярная ДНК (внмДНК), которая обычно определяется в виде нуклеосомной фракции ДНК плазмы крови [9]. Содержание нуклеосомной фракции внмДНК в плазме крови увеличивается при усилении процессов апоптоза и уменьшается при их ингибировании [10]. Определение внмДНК является малоинвазивным методом и становится все более применяемым в различных областях медицины. Например, определение внмДНК используется в качестве маркера действия на организм вредных физических факторов, таких как ионизирующее излучение и низкочастотный шум [11]; изучения механизмов действия лекарственных препаратов [12]; дифференциальной диагностики ишемического и геморрагического инсульта [13], диагностики и оценки эффективности лечения злокачественных опухолей [14]. Цель исследования: определение внмДНК в плазме крови как показателя апоптоза у больных ХОБЛ в состоянии ремиссии по сравнению со здоровыми донорами, больными хроническим необструктивным бронхитом (ХНБ) и родственниками первой линии родства (РПЛР) пациентов ХОБЛ и ХНБ. Материалы и методы В исследование набрали 110 участников: 17 здоровых доноров, 31 больной ХОБЛ, 20 больных ХНБ, 19 здоровых родственников первой линии больных ХОБЛ, 23 здоровых РПЛР больных ХНБ. Характеристика участников исследования представлена в табл. 1. В группах здоровых доноров, больных ХОБЛ и больных ХНБ были только мужчины. В группе родственников больных ХОБЛ было 37% мужчин и 63% женщин, родственников больных ХНБ — 48 и 52% соответственно. Кровные родственники больных обеих групп не имели признаков легочной патологии. Средний возраст здоровых доноров, больных ХНБ, родственников больных ХОБЛ и ХНБ был сопоставим и составлял от 53 до 58 лет, больных ХОБЛ — несколько старше: 64,5 года. Во всех группах было значительное число курильщиков: больше всего в группе больных ХОБЛ — 98%, меньше всего в группе родственников больных ХНБ — 35%. Средняя длительность курения в группах и подгруппах (по полу) участников оказался примерно одинаковым и составлял от 23,4 до 26,4 пачек/лет (см. табл. 1). Пациенты и здоровые люди во всех сравниваемых группах были сопоставимы по условиям трудовой деятельности и социально-экономическому статусу. Продолжительность заболевания пациентов в группах больных ХОБЛ и ХНБ составляла от 7 до 20 лет. Среди 31 больного ХОБЛ у 22 (71%) имелась III (тяжелая) стадия заболевания с объемом форсированного выдоха за 1-ю секунду (ОФВ1) <49% от должного, у 7 (23%) — II (среднетяжелая) с ОФВ1 69—50% от должного, у 2 (6%) — I (легкая) с ОФВ1 >70% от должного. У всех больных ХНБ ОФВ1 находился в пределах нормы. У всех больных ХОБЛ и ХНБ во время забора крови для определения внмДНК определялась клиническая ремиссия. До начала исследования от всех больных и здоровых лиц получено информированное согласие на участие в исследования и заборе крови для анализа внмДНК. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России. Таблица 1. Характеристика пациентов Примечание. М — мужчины, Ж — женщины, пачек/лет — число выкуриваемых в день сигарет, деленное на 20 (условная пачка) и умноженное на число лет курения, в скобках процент. Кровь у участников исследования в количестве 3 мл брали путем венепункции в пробирки, содержащие 0,5 М ЭДТА (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). Плазму отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 810 g и температуре 4 °C в бакет-роторе. Для удаления остатков форменных элементов крови плазму центрифугировали дважды при 2200 g. Выделение и определение содержания внмДНК осуществляли согласно описанной ранее методике [13, 14]. Нуклеиновые кислоты выделяли путем экстракции фенолом/хлороформом и осаждали этанолом. Осадки нуклеиновых кислот растворяли в деионизированной воде из расчета 1 мкл на 1 мл плазмы крови и хранили для дальнейших исследований при температуре –70 °С. После размораживания образцы нуклеиновых кислот обрабатывали РНКазой. ДНК анализировали электрофорезом в 2/16% градиенте полиакриламида. Для идентификации фракций мДНК использовали маркеры — рестрикты PBR322/BspR1 и λ/Alu1. Электрофореграммы фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Данные клинических исследований подвергали статистической обработке в программе GraphPad Prism 6 с использованием критерия Стьюдента для несвязанных выборок. Определяли среднее арифметическое и стандартную ошибку (M±m) с расчетом значения p. Результаты и обсуждение Среднее содержание внмДНК в плазме крови в группах участников исследования представлено в табл. 2. У больных ХОБЛ содержание внмДНК составляло 7,8±2,0 нг/мл, что статистически значимо в 3,9 и 3,0 раза меньше, чем соответственно у здоровых доноров и больных ХНБ; причем содержание внмДНК у больных ХНБ не отличалось статистически значимо от такового у здоровых доноров (см. табл. 2). Низкое содержание внмДНК у больных ХОБЛ свидетельствуют о снижении (ингибировании) процессов апоптоза, тогда как у больных ХНБ процессы апоптоза протекают с той же интенсивностью, что у здоровых доноров. Статистически значимое отличие содержания внмДНК плазмы крови у пациентов с ХОБЛ и ХНБ в состоянии ремиссии позволяет использовать определение внмДНК плазмы крови в дифференциальной диагностике ХОБЛ и ХНБ. Таблица 2. Содержание низкомолекулярной ДНК в плазме крови пациентов ХОБЛ и ХНБ в состоянии ремиссии и их здоровых родственников по сравнению с таковым у здоровых доноров Примечание. Различия статистически значимы * — со здоровыми донорами (p=0,0002); с больными ХОБЛ (# — p=0,0081, ## — p=0,0028, ### — p=0,0019). ВнмДНК поступает в циркуляцию от всех внутренних органов, омываемых кровью, в основном в результате апоптоза; основная роль апоптоза в организме связана с поддержанием нормального гомеостаза клеток, поэтому обычно процесс апоптоза находится в равновесии с процессами деления клеток и их дифференцировки [9]. У больных ХОБЛ как активация, так и ингибирование апоптоза и связанное с этим поступление внмДНК в кровь обусловлено первую очередь процессами гибели и регенерации клеток в легких. В большинстве проведенных исследований у больных ХОБЛ выявлено усиление апоптоза клеток альвеолярного эпителия, эндотелиальных и мезенхимальных клеток легких, сопровождающееся активацией каспазы-3 и экспрессией проапоптотических белков Bax и Bad [15, 16]. В упомянутых исследованиях больные находились в состоянии обострения ХОБЛ, и активация апоптоза свидетельствовала о деструкции легочной ткани и прогрессировании эмфиземы, что не уравновешивалось процессами пролиферации клеток легких. В нашем исследовании больные ХОБЛ находились в состоянии ремиссии, и существенное ингибирование процессов апоптоза у них по сравнению со здоровыми донорами и больными ХНБ в состоянии ремиссии может свидетельствовать о включении защитной реакции против деструкции легких или компенсаторной реакции, направленной на восстановление легочной ткани, у больных ХОБЛ в период ремиссии. Определение внмДНК плазмы крови можно применять для диагностики активности ХОБЛ; в период обострения, как свидетельствуют данные литературы, апоптоз активируется и уровень внмДНК будет повышаться; в период ремиссии, как свидетельствуют наши результаты, уровень внмДНК будет снижаться в результате ингибирования апоптоза. Снижение интенсивности апоптоза у больных ХОБЛ в период ремиссии имеет не только положительное значение в плане восстановления легочной ткани, но может служить одним из объяснений повышения риска развития РЛ у данных пациентов, так как подавление апоптоза приводит к накоплению клонов генетически поврежденных клеток и повышает риск развития злокачественных опухолей [14]. Сообщается, что у больных ХОБЛ содержание внмДНК в плазме крови значительно ниже, чем у больных РЛ [17]. Это согласуется с общими представлениями о том, что у людей с высоким риском развития злокачественных опухолей процессы апоптоза и соответственно уровеньвнм ДНК снижены, а при развитии злокачественных опухолей процессы апоптоза и уровень внмДНК растут [14], поэтому определение внмДНК можно использовать при наблюдении за больными ХОБЛ с целью ранней диагностики РЛ. В настоящее время для определения апоптоза в легких у больных ХОБЛ используются инвазивные методы: берется гистологический или цитологический материал во время бронхоскопии, торакоскопии [15, 16]. Преимущество диагностики выраженности апоптоза с помощью определения внмДНК заключается в минимальной инвазивности данной методики, так как у пациентов забирается только периферическая кровь. Как сообщалось выше, наследственность [3] является ФР развития ХОБЛ. Мы предполагали, что снижение процессов апоптоза и низкий уровень внмДНК может иметь наследственную природу. Однако у кровных родственников больных ХОБЛ, как и у кровных родственников больных ХНБ, среднее содержание внмДНК не отличалось достоверно от такового у здоровых доноров (см. табл. 2). Вероятно, изменение процессов апоптоза у больных ХОБЛ в сторону ингибирования при ремиссии и активации при обострении не связаны с врожденными генетическими нарушениями, а являются следствием патогенеза ХОБЛ и/или влияния курения, воздушных загрязнителей и других внешних факторов. Возраст также является ФР развития ХОБЛ [6]. Данные о влиянии возраста на процессы апоптоза противоречивы: в целом с увеличением возраста интенсивность апоптоза в организме человека снижается, стареющие клетки становятся более устойчивыми к запрограммированной гибели, что объясняет повышение онкологического риска у людей старшего и пожилого возраста; однако с возрастом апоптоз может активизироваться как защитная реакция, направленная на сохранение гомеостаза органов и тканей и элиминацию предраковых и раковых клеток [18]. Мы предприняли попытку оценить влияние возраста на уровень внмДНК у больных ХОБЛ по сравнению со здоровыми донорами разного возраста (табл. 3). Выявлено, что среднее содержание внмДНК в плазме крови между группами здоровых доноров 34—59 и 60—74 лет практически не различалось. По сравнению со своими возрастными группами здоровых доноров среднее содержание внмДНК статистически значимо меньше у больных ХОБЛ 45—59 лет в 7,2 раза, а у больных ХОБЛ 60—80 лет — в 3 раза. У больных ХОБЛ 60—80 лет среднее содержание внмДНК в 2,3 раза меньше, чем у больных ХОБЛ 45—59 лет, хотя данные различия проявилась лишь в виде тенденции. Тем не менее можно предположить, что с увеличением возраста у больных ХОБЛ даже в состоянии ремиссии уровень внмДНК и апоптоза растет, что связано с прогрессированием заболевания, а у здоровых людей уровень внмДНК и апоптоза не меняются, и на процессы апоптоза влияют ассоциированные с возрастом заболевания, а не собственно возраст. Таблица 3. Содержание низкомолекулярной ДНК в плазме крови здоровых доноров и больных ХОБЛ в период ремиссии различных возрастных групп Примечание. Различия статистически значимы * — со здоровыми донорами 34—59 лет (p=0,0407); # — со здоровыми донорами 60—74 лет (p=0,0012). Заключение У больных ХОБЛ в состоянии ремиссии содержание внмДНК в плазме крови и соответственно процессы апоптоза в легких снижены, тогда как у больных ХНБ в состоянии ремиссии содержание внмДНК не отличается от такового у здоровых доноров. Ингибирование процессов апоптоза у больных ХОБЛ в период ремиссии по сравнению со здоровыми донорами и больными ХНБ может свидетельствовать о включении защитной реакции против деструкции легких или компенсаторной реакции, направленной на восстановление легочной ткани. Выделение внмДНК в кровь у больных ХОБЛ не связано с наследственностью и мало меняется с возрастом. Определение внмДНК рекомендуется использовать в качестве минимально инвазивного теста у больных ХОБЛ для оценки апоптоза, диагностики ремиссии и обострения, дифференциальной диагностики с ХНБ. Благодарности Часть работы выполнена при государственной финансовой поддержке ведущих университетов Российской Федерации (субсидия 074U01). Конфликт интересов отсутствует.

About the authors

I N Vasilyeva

V G Bespalov

References

Supplementary files