A GENETIC ANALYSIS OF A H1N1 PANDEMIC INFLUENZA VIRUS IN THE COURSE OF THE EPIDEMIC

Full Text

ВГ А H1N1 "пан" — вирус гриппа A H1N1 "пандемический" ОРДС — острый респираторный дистресс-синдром ОРВИ — острая респираторная вирусная инфекция ПЦР — полимеразная цепная реакция Первые сообщения о вспышке инфекции, вызванной новым вирусом, в дальнейшем идентифицированным как вирус гриппа A H1N1 "пандемический" (ВГА H1N1 "пан"), появились в апреле 2009 г. [1, 2]. Он представлял собой вариант сезонного вируса гриппа A H1N1 и характеризовался высокой контагиозностью. Это привело к объявлению пандемии вируса гриппа ВОЗ и Центром по контролю и профилактике заболеваний США в июне 2009 г. [3]. Механизм действия ВГ А H1N1 " пан" на организм человека аналогичен таковому при поражении другими штаммами вируса гриппа [4, 5]. Главным звеном в патогенезе является поражение сосудистой системы, приводящее к нарушениям микроциркуляции и застойному полнокровию внутренних органов. В свою очередь это ведет к развитию отека легочной ткани с множественными кровоизлияниями в альвеолы и интерстиций [6]. Отличительной особенностью развития инфекции стало формирование вирусной пневмонии и отека легких на 3—6-е сутки после появления первичной симптоматики [7]. Широко применяемые противовирусные препараты группы адамантов (амантадин и римантадин) оказались неэффективными против ВГ А НIN1 "пан" за счет накопления специфических мутаций в вирусном геноме. Согласно рекомендациям ВОЗ препаратами выбора для лечения ВГ А НIN1 "пан" являются осель-тамивир (тамифлю) и занамивир (реленза), устойчивость к которым в популяции еще не сформировалась. Целью настоящей работы явились оценка генетической изменчивости ВГ А НIN1 "пан" в условиях эпидемии и обнаружение набора нуклеотидных полиморфизмов человека, предопределяющих тяжелую форму течения заболевания. Контактная информация: Кострюкова Елена Сергеевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. постгеномных исследований в биологии ФГУ НИИ ФХМ ФМБА России, тел. 8-499-246-44-38; e-mail: el-es@yandex.ru — 49 — Е. С. Кострюкова и соавт. Таблица 1 Праймеры и флюоресцентные зонды, рекомендованные ВОЗ, для выявления вирусов гриппа H1N1 типов «сезонный» и «пандемический» Название Последовательность 5'—3' Тип вируса InfA Forward gaccratcctgtcacctctgac «Сезонный» InfA Reverse agggcattytggacaaakcgtcta InfA Probe tgcagtcctcgctcactgggcacg — FAM SW InfA gcacggtcagcacttatyctrag «ПандемичеForward скии» SW InfA Reverse gtgrgctgggttttcatttggtc SW InfA cyactgcaagcccatacacacaagcaggca — Probe HEX В ходе исследования предложена оригинальная методика забора и транспортировки вирусного материала от пациентов, позволившая достичь высокой эффективности выделения геномной РНК вируса для последующей генетической характеристики. На основании реакций минисеквенирования с последующей детекцией продуктов МАЛДИ-времяпролетной масс-спектрометрией созданы системы быстрого обнаружения генетических детерминант устойчивости возбудителя к противовирусным препаратам. Аналогичный принцип использован для выявления генетической предрасположенности пациентов к развитию тромбозов, бронхолегочных заболеваний и гипертонических состояний. Материалы и методы Клинический материал от пациентов с тяжелыми формами острой респираторной вирусной инфекции (ОРВИ) поступал из медицинских центров Москвы, Московской и Свердловской областей. Назофарингеальные мазки брали одноразовыми синтетическими зондами ("Deltalab", Испания), которые сразу же замораживали в 1 мл 4 М раствора гуанидина тиоцианата ("Amresco", США). Образцы венозной крови брали в пробирки с ЭДТА, хранили и транспортировали при температуре 4°С. От пациентов, умерших от осложнений тяжело протекавшего ОРВИ, брали образцы легочной ткани, которые также сразу замораживали в 1 мл 4 М раствора гуанидина тиоцианата. Геномную РНК вируса гриппа выделяли с использованием микроколонок с сорбирующим фильтром (ООО "Техноклон", Россия) согласно рекомендации производителя. Геномную ДНК из лейкоцитарной фракции венозной крови пациентов выделяли с использованием набора "Wizard Genomic DNA Purification Kit" ("Promega", США) согласно инструкции производителя. Синтез кДНК вируса гриппа осуществляли с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы "RevertAid Reverse Transcriptase" (200 ед/мкл) ("Fermentas", Литва) по рекомендуемому производителем протоколу с использованием праймера AGCAAAAGCAGG. Генетическое тестирование вируса гриппа. Разновидность вируса гриппа определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией результатов в режиме реального времени. В качестве матрицы использовали кДНК вируса, амплификацию проводили с праймерами и зондами, рекомендованными ВОЗ (табл. 1), на приборе "IQ-5" ("BioRad", США) по рекомендованному протоколу [8]. Таблица 2 Последовательности олигонуклеотидов для определения устойчивости ВГ А НIN1 «пан» к противовирусным препаратам Сег мент Последовательность праймеров для ПЦР (5'—3') Мутация Последовательность праймеров для минисеквенирования (5’—3’), масса (Да) аминокислота нуклеотид NA acgttggatggcctcatacaagatcttcag ggagcattcctcatagt, 5185 acgttggatgggataacaggagcattcc H275Y CAC ^ tAC M2 agctccagtgctggtctgaaag S31N AGT ^ AaT tgcaagatcccaatgata, 5492 gactcaggcactccttccgtagaa L26F CTC ^ Ttc cagcgattcaagtgatcct, 5788 A30V/T GCA ^ aCA/GtA tgatcctctcgtcattgca, 5730 G34E GGG ^ GaG cacaatatcaggtgcaagatc, 6424 Амплификацию фрагментов вирусного генома, несущих маркеры устойчивости к противовирусным препаратам, проводили в мультиплексном формате с использованием праймеров, указанных в табл. 2. Полученные ампликоны анализировали на наличие мутаций, обусловливающих устойчивость к адамантам и осельтамивиру, в реакции минисеквенирования с последующей масс-спектрометрической детекцией по схеме, описанной ранее [9]. Последовательности праймеров и расчетные массы продуктов реакции приведены в табл. 2. Для полноразмерного геномного секвенирования сегменты вирусного генома амплифицировали в два этапа с использованием универсальных праймеров agtcaggcagcaaaagcagg и agaaagggagtagaaacaagg на первом и парами специфических праймеров, рекомендованных ВОЗ [10], на втором. Продукты реакции разделяли горизонтальным электрофорезом в 2% агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Полосы, соответствующие целевым ампликонам, вырезали из геля, и элюировали ДНК с помощью центрифугирования при 6000 об./мин 5 мин с использованием стекловолоконных фильтров. Нуклеотидную последовательность ампликонов определяли с помощью набора "Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing" ("Applied Biosystem", США) согласно инструкции производителя с использованием праймеров M13Forvard и M13Reverse. Продукты реакции анализировали на автоматическом секвенаторе "ABI Prism Genetic Analyzer 3730XL" ("Applied Biosystem", США, "Hitachi", Япония). Полученные нуклеотидные последовательности выравнивали против референсной и депонировали в базе данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Генетическое исследование у пациентов с тяжелыми формами ОРВИ. Генотипирование отобранной группы больных для оценки предрасположенности к тяжелому течению респираторного заболевания осуществляли на основании регистрации однонуклеотидных полиморфизмов по схеме, описанной ранее [9]. Праймерные системы приведены в табл. 3. Результаты В ходе исследования был сформирован лабораторный банк клинических образцов от больных тяжелыми формами ОРВИ — назальные смывы либо мазок зева (n = 225), венозная кровь (n = 225), аутопсийный материал (n = 5). Образцы сопровождали письмами с указанием лечебного учреждения, номера истории болезни, фамилии, имени и отчества, возраста, пола пациента. Клинический диагноз указывали исходя из данных физического исследования и результатов лабораторно-инструментального исследования. У всех умерших больных при тяжелом течении пандемического гриппа A/H1N1/2009 выявлены массивная двусторонняя пневмония, синдром острого поражения легких или острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), быстро прогрессирующая острая дыхательная недостаточность, приводящая к значительному снижению уровня насыщения артериальной крови кислородом. Генетический материал, эстрагированный из 230 назофарингеальных мазков и аутопсий, подвергали тестированию, позволяющему обнаруживать вирус гриппа А H1N1 и одновременно разграничивать его по типам "сезонный" и "пандемический". Штамм вируса гриппа A H1N1 удалось идентифицировать в 77 (34%) случаях. При этом ВГ А НIN1 "пан" выявлен в 46 (20%) случаях, штамм вируса гриппа А H1N1 "сезонный" — в 31 (14%). Резистентность ВГ А НIN1 "пан" к противовирусным препаратам оценивали на основании обнаружения мутации H275Y в сегменте 6 (NA), определяющей его устойчивость к осельтамивиру [11—13], а также мутаций L26F, S31N, A30V., A30T, G34E в сегменте 7 (М2), ассоциированных с устойчивостью к аманта-дину и римантадину [14—16]. Мутация S31N в сегменте 7 (M2) (рис. 1) обнаружена во всех 46 образцах, в остальных исследованных кодонах сегмента 7 (M2) мутаций не найдено. Устойчивый к осельтамивиру штамм с мутацией H275Y сегмента 6 (NA) (рис. 2) выявлен у одного пациента. — 50 — Генетический анализ вируса гриппа A НIN1 "пандемический" в условиях эпидемии Последовательность олигонуклеотидов для Таблица 3 выявления генетических полиморфизмов, предопределяющих тяжелое течение вирусной инфекции Ген Последовательность праймеров для ПЦР (5 ' 3') Мутация Последовательность праймеров для Смесь Масса продуктов реакции минисеквенирования (Да) аминокислота нуклеотид минисеквенирования (5'—3'), масса (Да) дНТФ/ддНТФ норма мутация ACE gccctgcaggtgtctgcagcatgt ggatggctctccccgc cttgtctc 16 интрон 250nHDEL/INS IVS16 + 2123 cctcagcctcccaagtag, 5301 ddC 5574-DD 5678-II AGT ggctgtgacaggatggaagac caggtatgtccgcaggctg M235T T1311C ctgtccacactggctccc, 5372 ddA, dG, ddT 5669-TT 5989-CC NOS ccacagctctgcattcagca atttaggaggcaaccctggac E298D T7965G tgcaggccccagatga, 4892 ddG, dT, ddC 5205-GG 5469-TT ADRB2 agtgcgctcacctgccaga aactcgcaccagaagttgcca G16R G285A ggtccggcgcatggcttc, 5508 ddA, dC, ddT 5781-GG 6109-AA MMP1 tgccacttagatgaggaaattgt atggattcctgttttctttctgc промотор IVS1-1607delG gatttgagataagtcatatc, 6155 ddC, dT 6428-GG 7350-del SFTPC ctcccgtgcccaaccta gctggcagccaatgagg N138T A1854C cccagtcttgaggctctca, 5740 ddC, ddT, dA 6341-AA 6013-CC SFTPC сacagcccctctttactgatga tggatgaccccgcttca N186S A2334G gggcatggccgtga, 4345 ddC, ddA, dG 4642-AA 4947-GG F2 gaagaagtggatacagaaggtca agctgcccatgaatagcact E622K G20210A cactgggagcattgaggct, 5869 ddC, ddG, dT 6142-GG 6486-AA FGB_b agctattcagcacaaaaaaaggg cacaaggcaaccactaaaatcg промотор IVS1-455G > A ttctatttcaaaaggggc, 5514 ddC, dT, ddA 5787-GG 6115-AA Примечание. ACE — ген, кодирующий ангиотензинпревращающий фермент; AGT — ген, кодирующий ангиотензиноген; NOS — ген, кодирующий синтазу оксида азота; ADRB2 — ген, кодирующий адренорецептор ß2; MMP1 — ген, кодирующий матриксную металлопротеиназу-1; SFTPC — ген, кодирующий сурфактантный белок С; F2 — ген, кодирующий коагуляционный фактор F2; FGB_b — ген, кодирующий фибриноген. Исходя из накопленных знаний о механизмах взаимодействия ВГ А НIN1 "пан" и организма человека мы провели совокупный анализ полиморфизмов в генах человека, относящихся к системам регуляции свертывания крови, сурфактантного звена и сосудистого тонуса (табл. 3), продукты которых играют ведущую роль в патогенезе ОРДС и могут предопределять тяжелое течение вирусной инфекции. Из 46 образцов от пациентов с идентифицированным штаммом ВГ А НIN1 "пан" были отобраны 25 от пациентов со среднетяжелыми и тяжелыми формами гриппа; 14 из этих пациентов находились на лечении в ИКБ № 1 Москвы. Среди наблюдаемых больных было 11 женщин, 2 мужчин в возрасте от 19 до 55 лет (средний 30,1 ± 2,2 года) и один новорожденный мальчик, умерший на 2-е сутки после рождения. Среди женщин было 8 беременных на разных сроках беременности (I триместр — одна, II триместр — 4, III триместр — 3). У всех пациентов диагноз гриппа был подтвержден обнаружением РНК вируса гриппа А H1/N1 в носоглоточном смыве методом ПЦР, совместимой с обратной транскрипцией, в режиме реального времени. У 9 больных заболевание имело среднетяжелое течение, из них у 6 сопровождалось развитием диффузного бронхита, у 2 — очагово-сливной пневмонии без развития выраженной дыхательной недостаточности, у 2 пациенток выявлены острый катаральный отит и острый гнойный двусторонний верхнечелюстной синусит. Все случаи среднетяжелого течения гриппа закончились выздоровлением. Тяжелое течение гриппа было диагностировано у 5 пациентов (3 женщины, один мужчина, один ребенок); у всех наступил летальный исход. У 3 (60%) из 5 больных с тяжелым течением гриппа наблюдалось выраженное нарушение жирового обмена (ожирение III степени), у 2 — коронарокардиосклероз, ИБС, у 1 пациентки — гиРис. 1. Пример масс-спектра мультиплексной реакции минисеквенирования. а — пики соответствуют массам продуктов минисеквенирования для кодонов 26, 31, 30, 34 сегмента 7 (М2) и кодона 275 сегмента 6 (NA). Выявлены следующие генотипы; L26, SN31 (мутантный), А30, G34 в сегменте 7 (М2) и Н275 в сегменте 6 (NA); б — на приведенном масс-спектре отрицательного контроля все пики соответствуют массам зондов, внесенных в реакцию. — 51 — Е. С. Кострюкова и соавт. Рис 2. Пример масс-спектров типирования мутации H275Y в сегменте 6 (NA) в одноплексном формате. а — отрицательный контроль; б — образец, содержащий штамм без мутации; в — образец со смесью мутантного и дикого штаммов. пертоническая болезнь, у 1 больного — хроническая аневризма верхушки левого желудочка, слипчивый перикардит, состояние после аортокоронарного шунтирования, у 3 — хронический пиелонефрит, у 1 — хронический гепатит В, у 1 — сахарный диабет, у одного — пневмосклероз, эмфизема легких. Заболевание гриппом у этих больных сопровождалось развитием массивной двусторонней пневмонии и интерстициального и альвеолярного отека легких, быстро прогрессирующей острой дыхательной недостаточностью, что требовало проведения респираторной поддержки (всем больным этой группы проводилась искусственная вентиляция легких), у 4 из 5 пациентов с тяжелым течением гриппа наблюдался выраженный геморрагический синдром. Среди умерших были одна беременная (смерть наступила после оперативного родоразрешения при антенатально погибшем плоде на 27-й неделе беременности), а также новорожденный мальчик, родившийся глубоко недоношенным при сроке беременности 28 нед путем операции кесарева сечения от матери, болевшей пандемическим гриппом A/H1N1/2009. Ребенок при рождении имел массу 1500 г, длину 38 см, оценку по шкале Ап-гар 2—4 балла, у него оказалось внутриутробное инфицироваТаблица 4 Распределение пациентов согласно обнаружению мутантных аллелей в группах генов, ответственных за формирование бронхолегочной патологии (MMP1, STFPQ, тромбофилии (F2, FGB) и вазоконстрикции (NOS, ADRB2, AGT, ACE) Число пациентов с выявленными мутантными аллелями Бронхолегочная патология + гипертензия Бронхолегочная патология + тромбофилия гипертония + тромбо-филия Только в 2 профилях В 3 профилях 12 (12/25; 48 %) (2/5; 40%)* 0 13 (13/25; 52 %) (3/5; 60 %)* 0 Примечание. * — пациенты с летальным исходом. ние вирусом пандемического гриппа A/H1N1/2009, сопровождавшееся развитием бронхопневмонии. При обследовании пациентов для выявления предрасположенности к нарушениям в системе регуляции сосудистого тонуса, обусловленных мутациями в генах NOS, ADRB2, AGT и ACE [17—19], в образцах ДНК 14 из 25 пациентов обнаружены как минимум три полиморфизма, и лишь в единственном случае отмечен полиморфизм только в одном гене. Среди умерших у 3 также выявлено наличие сочетанных полиморфизмов генов, приводящих к нарушениям в системе регуляции сосудистого тонуса. Аналогично у 13 из 25 пациентов обнаружены полиморфизмы генов, кодирующих антикоагуляци-онный фактор F2 и фибриноген, предрасполагающие к развитию тромбофилии [20—22]. При этом у 3 из 5 умерших пациентов также обнаружены указанные полиморфизмы. Кроме того, у всех 25 пациентов имелись полиморфизмы генов, кодирующих сурфактантный белок C и матриксную металлопротеиназу-1, ассоциированные с развитием бронхолегочной патологии [23, 24]. При этом у 19 из 25 пациентов одновременно выявлены мутантные аллели по всем трем локусам. Примечательно, что в ходе генетического тестирования нам удалось выявить группу из 12 пациентов, включающую 3 больных с летальным исходом, у которых обнаружены полиморфизмы одновременно в 8 из 9 протестированных генов. При исследовании не выявлено пациентов с мутантным аллелем только в одном из 3 анализируемых профилях (табл. 4). Для 10 образцов ВГ А НIN1 "пан", полученных от пациентов из Москвы и Московской области с тяжелым течением заболевания, либо из аутопсийного материала, а также для 5 образцов от пациентов из Свердловской области были определены полноразмерные нуклеотидные последовательности 8 сегментов вирусного генома, в дальнейшем депонированные в GenBank (табл. 5). Обсуждение Выявление ВГ А НIN1 "пан" лишь в 46 случаях из 230, проанализированных в данной работе, подтверждает, что постановка дифференциального диагноза "пандемический грипп" может быть осуществлена только на основании генотипирования Таблица 5 Перечень геномных последовательностей ВГ А НIN1 "пан", депонированных в GenBank Изолят Место выделения Номера последовательностей (сегменты 1—8) (A/Russia/149/2009(H1N1)) Москва CY053413—CY053420 (A/Russia/165/2009(H1N1)) Свердловская область CY053624—CY053631 (A/Russia/14/2009(H1N1)) Москва CY053678—CY053685 (A/Russia/191/2009(H1N1)) Москва CY053686—CY053693 (A/Russia/74/2009(H1N1)) Москва CY053725—CY053732 (A/Russia/178/2009(H1N1)) Свердловская область CY053733—CY053740 (A/Russia/190/2009(H1N1)) Свердловская область CY053741—CY053748 (A/Russia/200/2009(H1N1)) Москва CY053749—CY053756 (A/Russia/4/2009(H1N1)) Москва CY054627—CY054634 (A/Russia/12/2009(H1N1)) Москва CY054635—CY054642 (A/Russia/19/2009(H1N1)) Москва CY054643—CY054650 (A/Russia/61/2009(H1N1)) Москва CY054651—CY054658 (A/Russia/100/2009(H1N1)) Москва CY054659—CY054666 (A/Russia/171/2009(H1N1)) Свердловская область CY054667—CY054674 (A/Russia/180/2009(H1N1)) Свердловская область CY054675—CY054682 — 52 — Генетический анализ вируса гриппа A НIN1 "пандемический" в условиях эпидемии IIIIIIIIIIIIIIII.......ІІІІІІІІ AATGAATGCCCCTAATTATTACTATG A G G А А 260 265 270 275 280 285 290 J_I_I_I_I_I_L Рис. 3. Фрагмент электрофореграммы последовательности сегмента 6 (NA) вируса A/Russia/61/2009(H1N1). Стрелкой указаны пики, соответствующие нуклеотидам C и T в положении 823. возбудителя. Причем тестирование должно осуществляться на ранних стадиях болезни, поскольку для данной формы вирусной инфекции характерны бурное течение и высокий риск развития осложнений, в том числе летальных, в первые несколько дней после появления симптоматики. Разработанная система быстрого обнаружения генетических детерминант резистентности ВГ А НIN1 "пан" к противовирусным препаратам подтвердила абсолютную устойчивость данного возбудителя к препаратам группы адамантов. Полученные с использованием описанного подхода данные были полностью подтверждены для 10 образцов, для которых определены полноразмерные последовательности сегментов вирусного генома. Выявление мутации H275Y гена нейраминидазы (NA) лишь в одном образце из 46 свидетельствует о низком риске наличия резистентности к осельтамивиру в российской популяции вируса. При этом у данного пациента вируса выявлены одновременно 2 генотипа, что выражается в появлении характерных пиков на масс-спектре (см. рис. 2, в) и подтверждается формированием в положении 823 п. н. сегмента 6 (NA) вируса A/Russia/61/2009 (H1N1) (CY054656) 2 пиков, соответствующих нуклеотидам Т и С, на электрофоре-грамме (рис. 3). Одновременное присутствие нормального и мутантного генотипов может свидетельствовать о повторном заражении пациента, о возникновении мутации вируса de novo или об исходном инфицировании двумя штаммами вируса. Исход любого инфекционного заболевания зависит от совокупности факторов, определяемых как индивидуальными свойствами инфекционного агента (вирулентность, контагиозность, устойчивость к антибактериальным агентам, иммуногенность), так и индивидуальными особенностями пациента, среди которых генетическая предрасположенность может быть легко определена и интерпретирована благодаря развитию технологий анализа нуклеиновых кислот. С учетом высокого риска развития ОРДС больным с идентифицированным ВГ А НIN1 "пан" было проведено геноти-пирование для оценки предрасположенности к тяжелому течению респираторного заболевания. Мы отдаем себе отчет, что для получения достоверных выводов необходимо проведение крупных эпидемиологических исследований. Однако обнаруженные нами закономерности даже на ограниченной выборке пациентов с тяжелыми формами гриппа, включающей 5 случаев с летальным исходом, дают основание полагать, что выявление генотипов, ассоциированных с нарушениями процессов синтеза сурфактанта, регуляции вазоконстрикции и тромбообразования, свидетельствует о предрасположенности к развитию тяжелых форм течения заболевания. Развитие гриппа, как и многих других острых респираторных инфекций, создает характерную патогенетическую ситуацию, ког да на основные системы пациента добавляется нагрузка, при которой выявляются скрытые генетические дефекты, компенсированные в условиях обычной жизнедеятельности. В ходе данного исследования нам не удалось учесть все факторы, способные влиять на тяжесть гриппозной инфекции. Остается открытым вопрос о вкладе в развитие инфекции сапрофитной микрофлоры дыхательного тракта, хотя существует мнение, что именно в случае ВГ А НIN1 "пан" этот вклад незначителен [25]. Кроме того, остается открытым вопрос о влиянии времени первого приема ингибиторов нейраминидазы и других вспомогательных терапевтических средств на тяжесть течения заболевания. Однако уже сейчас можно констатировать, что проведение своевременной диагностики и типирования вируса с одновременной оценкой генетического статуса пациента может существенно увеличить эффективность лечения тяжелых форм гриппа.

About the authors

E S Kostryukova

Research Institute of Physicochemical Medicine

Email: el-es@yandex.ru

N B Zakharzhevskaya

Research Institute of Physicochemical Medicine

P A Kostin

Research Institute of Physicochemical Medicine

E N Ilyina

Research Institute of Physicochemical Medicine

A K Larin

Research Institute of Physicochemical Medicine

O G Gribanov

Research Institute of Physicochemical Medicine

O V Selezneva

Research Institute of Physicochemical Medicine

E A Prikhodko

Research Institute of Physicochemical Medicine

T A Akopian

Research Institute of Physicochemical Medicine

E V Generozov

Research Institute of Physicochemical Medicine

V N Lazarev

Research Institute of Physicochemical Medicine; Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences

S A Levitsky

Research Institute of Physicochemical Medicine; Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences

I G Kondratov

Research Institute of Physicochemical Medicine

D G Alekseev

Research Institute of Physicochemical Medicine

N A Bazaleev

Research Institute of Physicochemical Medicine

E A Klimova

Moscow State Medical Stomatological University

M R Esaulova

Moscow State Medical Stomatological University

N D Yuschuk

Moscow State Medical Stomatological University

V M Govorun

Research Institute of Physicochemical Medicine; Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences; Russian Research Center "Kurchatov Institute"

V I Sergienko

Research Institute of Physicochemical Medicine

References

Supplementary files