The study of abdominal and parietal enteric microbiota in patients with non-alcoholic fatty liver disease

Full Text

Список сокращений

ЛПС – липополисахарид

НАЖБП – неалкогольная жировая болезнь печени

СИБР – синдром избыточного бактериального роста

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является одним из самых распространенных хронических диффузных заболеваний печени [1, 2]. По последним литературным данным, 25% населения Земли страдают НАЖБП, при этом имеется тенденция к неуклонному росту заболеваемости [3–6].

В настоящее время в патогенезе НАЖБП определенная роль придается качественному и количественному нарушению состава кишечной микрофлоры. Любые изменения кишечного микробиоценоза сопровождаются увеличением проницаемости кишечной стенки и повышением уровня эндотоксемии (липополисахарида – ЛПС, липотейхоевой кислоты, флагеллина) в портальной системе. В этом случае главным эндотоксиновым барьером становится печень, естественно, при этом возникают эндотоксиновые эффекты на печень. Хроническая эндотоксемия оказывает негативное влияние на гепатоциты, звездчатые клетки Ито, ямочные клетки и клетки Купфера, способствуя развитию стеатоза и воспаления печени [5, 7].

Между тем вопрос о патологических взаимосвязях печени и интестинальной микробиоты остается недостаточно изученным, не описаны особенности изменений полостной и пристеночной микробиоты при НАЖБП.

Цель исследования – характеристика особенностей изменений полостной и пристеночной микробиоты тонкой кишки у пациентов с НАЖБП.

Материалы и методы

Критериями включения пациентов в исследование стали возраст 18–60 лет, НАЖБП на стадии стеатоза печени и стеатогепатита. Верификация диагноза осуществлялась при использовании ультразвукового исследования гепатобилиарной системы на анализаторе SONIX OP (Канада). Исключение фиброза печени проводилось с помощью теста FibroMax (FM) и эластографии печени на аппарате AIXPLORER (Франция). Степень активности стеатогепатита определялась по биохимическим анализам крови на аланинаминотрансферазу и аспартатаминотрансферазу на анализаторе Huma Star 600 (Германия). Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Критериями исключения из исследования стали заболевания печени другой этиологии (алиментарной, вирусной, аутоиммунной, лекарственной), гепатиты, фиброз и цирроз печени, воспалительные заболевания кишечника, беременность и лактация, эндокринные заболевания (сахарный диабет, болезни щитовидной железы), наличие опухолей любой локализации, психических расстройств, хронических заболеваний внутренних органов в стадии декомпенсации, прием антибактериальных и слабительных препаратов в последние 4 нед до исследования.

Полостную микробиоту у пациентов с НАЖБП оценивали с помощью анализатора «ЛактофаН2» компании «Ассоциация медицины и аналитики» (Россия) посредством водородных дыхательных тестов с лактулозой. Методика данного исследования состояла в том, что сначала определялось натощак содержание водорода в выдыхаемом воздухе, далее пациент принимал внутрь 20 г лактулозы, растворенной в 200 мл воды, после чего содержание водорода оценивалось вновь с интервалом в 20 мин в течение 100 мин, полученные результаты изображались графически. Увеличение концентрации водорода более чем на 10 ppm по сравнению с исходным значением ранее 60 мин исследования расценивалось как синдром избыточного бактериального роста (СИБР) в тонкой кишке [8]. Степень тяжести СИБР установлена на основании прироста концентрации водорода: прирост 10–50 ppm соответствовал 1-й степени, 50–100 ppm – 2-й степени, более 100 ppm – 3-й степени [2].

Состояние пристеночной микробиоты тонкой кишки изучали с помощью газового хроматографа Agilent 7890 с масс-селективным и плазменно-ионизационным детекторами (Agilent Technologies, США). Данный метод газовой хроматографии масс-спектрометрии позволяет получить уникальную информацию о составе особых мономерных химических компонентов микробной клетки, поступающих в плазму крови, характерных для тех или иных таксонов [9]. В ходе исследования определяется 58 различных микроорганизмов, результат представляет собой список исследуемых микроорганизмов, допустимых значений нормы и отклонений от нормы. На основании полученных результатов рассчитаны объединенные статистические показатели пристеночной энтеральной микробиоты – общая бактериальная нагрузка, полезная микробиота, условно-патогенная микробиота, анаэробы, аэробы, грибы, вирусы. Чувствительность метода – 10⁴–10⁵ клеток в пробе; селективность – до вида при наличии маркера.

Результаты исследования сопоставляли с данными контрольной группы, которая включала 25 человек в возрасте 18–60 лет без заболеваний пищеварительной системы.

Статистическая обработка проводилась с использованием программного обеспечения StatSoft Statistica версии 10.0.1011. Проверка нормальности распределения проводилась с использованием критериев Колмогорова–Смирнова и Шапиро–Уилка, распределение отличалось от нормального. В связи с наличием распределения, отличным от нормального, для подсчетов выбраны непараметрические методы. Данные исследования представлены в виде медианы (Me) и межквартильного размаха (25 и 75-й процентили). Статистическая значимость различий (р) количественных величин между независимыми группами оценивалась с помощью критерия Манна–Уитни. Различия между группами принимались за статистически значимые при вероятности справедливости нулевой гипотезы об отсутствии различия между группами (p<0,05).

Результаты

В исследование включены 54 пациента с НАЖБП, среди них стеатоз печени установлен у 38 (70,4%), стеатогепатит 1-й степени активности – у 16 (29,6%). Медиана возраста составила 50 лет (45; 55). Обследованы 39 (72,2%) женщин, 15 (27,8%) мужчин.

Помимо жалоб со стороны гепатобилиарной системы пациенты предъявляли жалобы, характерные для поражения тонкой кишки: боли в околопупочной области – 16 (29,6%), метеоризм – 22 (40,7%), запоры – 13 (24,1%), поносы – 11 (20,4%), сочетание диареи и запоров – 6 (11,1%) пациентов соответственно. Многие (55,6%) пациенты жаловались на общую слабость, выпадение волос, ломкость ногтей, сухость кожи и слизистых оболочек, кровоточивость десен, судороги в мышцах, парестезии, частые стоматиты, что может свидетельствовать о гиповитаминозе и расстройствах трофики. При объективном исследовании выявлен налет на языке у 42 (77,8%), метеоризм – у 19 (35,2%), болезненность при пальпации живота в околопупочной области – у 19 (35,2%), в точке Поргеса – у 15 (27,8%) пациентов. При копрологическом исследовании отмечена стеаторея у 37 (68,5%), креаторея – у 14 (25,9%), амилорея – у 22 (40,7%) пациентов. Таким образом, у пациентов с НАЖБП присутствовали клинические проявления энтеральной дисфункции.

При исследовании полостной энтеральной микробиоты у пациентов с НАЖБП выявлен СИБР в 37 (68,5%) случаях. На 40-й минуте исследования медиана концентрации водорода в выдыхаемом воздухе у пациентов с НАЖБП составила 19 ppm против 4 ppm у контрольной группы (р=0,0019), на 60-й минуте исследования – 35 ppm против 13 ppm (р=0,048). При графическом изображении СИБР отмечен непрерывный рост концентрации водорода в выдыхаемом воздухе (рис. 1) у 18 (48,6%) пациентов (нарушена функция илеоцекального клапана). Двухволновый рост концентрации водорода (рис. 2) установлен у 11 (29,7%) пациентов (сохранена функция илеоцекального клапана). Плоская кривая без роста концентрации водорода (рис. 3) отмечена у 8 (21,7%) пациентов (дефицит расщепляющих лактулозу микроорганизмов и/или замедление моторики пищеварительного тракта). Водородный дыхательный тест у контрольной группы представлен на рис. 4. При оценке степени тяжести СИБР 1-й степени установлен у 19 (65,5%), 2-й степени – у 7 (24,1%), 3-й степени – у 3 (10,4%) пациентов соответственно.

 

Рис. 1. СИБР с нарушением функции илеоцекального клапана.

 

Рис. 2. СИБР с сохранением функции илеоцекального клапана.

 

Рис. 3. Дефицит расщепляющих лактулозу микроорганизмов и/или замедленная моторика пищеварительного тракта.

 

Рис. 4. Водородный дыхательный тест с лактулозой у контрольной группы.

 

Показатели пристеночной энтеральной микробиоты – общая бактериальная нагрузка, полезная микробиота, условно-патогенная микробиота, анаэробы, аэробы, грибы, вирусы – у пациентов с НАЖБП и контрольной группы представлены в табл. 1. Общая бактериальная нагрузка у пациентов с НАЖБП значимо ниже по сравнению с контрольной группой, что обусловлено преимущественно снижением полезной микробиоты в слизистой оболочке тонкой кишки. Содержание полезной микробиоты у пациентов с НАЖБП ниже, чем у здоровых лиц, практически в 2 раза. При этом отмечено уменьшение всех нормальных представителей – Bifidobacterium, Lactobacillus и Lactococcus, Eubacterium и Propionibacterium. Соотношение родов микроорганизмов также различное у здоровых лиц и пациентов с НАЖБП. У здоровых лиц существенно преобладали Eubacterium, содержание Bifidobacterium и Lactobacillus + Lactococcus практически одинаковое, в меньшей степени представлены Propionbacterium. У пациентов с НАЖБП в структуре полезной микробиоты преобладали Lactobacillus + Lactococcus и Eubacterium – их содержание относительно равное, несколько меньше выявлено Propionbacterium, и в минимальной степени представлены Bifidobacterium.

 

Таблица 1. Состояние пристеночной энтеральной микробиоты у пациентов с НАЖБП (кл/г×105) Table 1. State of parietal enteral microbiota in patients with non-alcoholic fatty liver disease (c/g×105)
Микроорганизмы	Пациенты с НАЖБП		Контрольная группа		p
	Ме	25–75-й процентили	Ме	25–75-й процентили
Общая бактериальная нагрузка	12 061	11 063–12 809	17 210	16 013–18 285	0,002
Полезная микробиота	5529	4386–6332	10 435	8910–11 145	0,002
Bifidobacterium	629,5	414–1228	1938	1830–2073	0,001
Lactobacillus + Lactococcus	2191	1761–2438	2569	2123–2716	0,16
Eubacterium	2039,5	1443–3289	4562	3289–4612	0,003
Propionibacterium	866	650–1227	1034	877–1222	0,39
Условно-патогенная микробиота	6184	5627–7682	6740	5765–8560	0,58
A. viscosus	639	556–680	573	554–575	0,46
C. ramosum	2551	2180–4024	4093	2890–4978	0,21
Nocardia	543	462–849	451	430–381	0,14
Ruminococcus	611	360–842	343	279–363	0,12
Staphyllococcus	432	372–480	368	341–391	0,31
Анаэробы	10 747	9746–11 267	16 228	15 167–17 095	0,001
Аэробы	1249	1106–1832	982	851–1190	0,07
Грибы	1218	1087–1849	1237	1078–1299	0,64
Вирусы	601	536–1586	631	630–867	0,75

 

В целом в содержании условно-патогенной микробиоты существенных отклонений у пациентов с НАЖБП в сравнении с контрольной группой не отмечено, хотя в ее структуре определенные различия констатированы. Среди всех представителей условно-патогенной микробиоты чаще всего обнаружены Actinomyces viscosus, Clostridium ramosum, Nocardia, Ruminococcus и Staphyllococcus. В обеих группах существенно преобладали C. ramosum, но у здоровых лиц их содержание практически в 2 раза выше, чем у группы пациентов с НАЖБП. Количество Ruminococcus преобладало практически 2 раза у пациентов с НАЖБП по сравнению с контрольной группой.

Соотношение полезной энтеральной микробиоты к условно-патогенной у здоровых лиц представлено преобладанием практически вдвое резидентной микрофлоры, в то время как у пациентов с НАЖБП содержание условно-патогенной микробиоты превышает количество резидентной. Количество микроскопических грибов и вирусов примерно одинаковое у пациентов с НАЖБП и контрольной группы. При исследовании содержания анаэробов и аэробов в обеих группах существенно преобладали анаэробы. При этом у здоровых лиц количество анаэробов значимо выше, чем у пациентов с НАЖБП, практически в 2 раза. Содержание аэробов несколько преобладало у пациентов с НАЖБП по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, у пациентов с НАЖБП выявлено выраженное снижение полезной микробиоты на фоне СИБР в тонкой кишке за счет преобладания условно-патогенной микробиоты.

Обсуждение

При обследовании пациентов с НАЖБП помимо жалоб со стороны гепатобилиарной системы отмечены клинические симптомы энтеральной дисфункции. Эти проявления могут быть обусловлены существенными нарушениями полостной и пристеночной кишечной микробиоты, выявленными у обследованных пациентов.

Как отмечено выше, при изучении полостной энтеральной микробиоты у пациентов с НАЖБП выявлен СИБР в 68,5% случаев. Полученные нами результаты соответствуют имеющимся в литературе данным, согласно которым у пациентов с НАЖБП СИБР определяется чаще, чем в среднем в популяции, и варьируется в пределах 50–77,8% [2, 5, 10]. В настоящее время имеются сведения, что СИБР противостоят нормальная секреция соляной кислоты в желудке и ферменты желудочного сока, желчные кислоты, пропульсивная моторика тонкой кишки и наличие илеоцекального клапана [11–13]. В литературе описано, что время кишечного транзита снижено у 22% пациентов с НАЖБП [14]. В нашем исследовании по результатам водородного дыхательного теста кишечный транзит замедлен у 21,6% пациентов. Также существенную роль в развитии СИБР играет илеоцекальная недостаточность, так как при этом происходит рефлюкс фекальной флоры в подвздошную кишку [15]. У обследованных нами пациентов илеоцекальная недостаточность выявлена в 48,6% случаев. С другой стороны, СИБР тоже может оказывать воздействие на развитие НАЖБП посредством трех механизмов:

1) увеличение продукции этанола в просвете тонкой кишки;

2) нарушение метаболизма пищевого холина (требуется для синтеза липопротеинов очень низкой плотности и печеночного экспорта липидов);

3) высвобождение ЛПС. И этанол, и ЛПС стимулируют воспалительную продукцию цитокинов через опосредованный транскрипционным фактором NF-κB механизм [5, 16].

Кишечная микробиота способна значительно нарушить энтерогепатическую циркуляцию желчных кислот, являющуюся важным звеном патогенеза НАЖБП. Усиленная деконъюгация связанных желчных кислот с образованием их токсичных солей приводит к нарушению микроциркуляции в стенке кишечника и увеличению всасывания, а также поступления в печень желчных кислот. Нарушенная энтерогепатическая циркуляция желчных кислот приводит к развитию синдрома мальабсорбции, при котором активируются процессы брожения, гниения, нарушается моторика кишечника и билиарной системы, что в конечном итоге способствует усугублению нарушений состава микрофлоры кишечника [17]. Экскреция желчных кислот с фекалиями нарушается, в связи с чем холестерин остается в крови и гепатоцитах, что приводит к усугублению нарушений липидного обмена и жировой дистрофии печени [18].

При исследовании пристеночной энтеральной микробиоты у пациентов с НАЖБП выявлены значительные ее нарушения, характеризующиеся уменьшением общей бактериальной нагрузки за счет снижения всех представителей полезной микробиоты слизистой оболочки тонкой кишки – Bifidobacterium, Lactobacillus и Lactococcus, Eubacterium и Propionibacterium. В структуре полезной микробиоты преобладали Lactobacillus + Lactococcus и Eubacterium, несколько меньше выявлено Propionbacterium, и в минимальной степени представлены Bifidobacterium. Известно, что полезная кишечная микробиота принимает участие в обмене холестерина, нарушение которого является одним из звеньев патогенеза НАЖБП [18]. Bifidobacterium в присутствии солей желчных кислот синтезируют деконъюгазы, превращающие глицин- и тауринсодержащие амиды желчных кислот в труднорастворимые осадки, связывающие холестерин в толстой кишке и способствующие его выделению с каловыми массами. Помимо этого Bifidobacterium могут воздействовать на количество рецепторов для липопротеидов низкой плотности у форменных элементов крови. Подобными свойствами обладают Lactobacillus и некоторые другие кишечные микроорганизмы [19].

В литературе представлены результаты анализа механизмов развития цирроза печени в исходе НАЖБП, согласно которым редукция собственной нормальной кишечной микрофлоры приводит к снижению синтеза короткоцепочечных жирных кислот, не только являющихся питательным субстратом для энтеро- и колоноцитов, но и способных снижать интенсивность воспалительного процесса в кишечнике. При этом уменьшается возможность нормофлоры конкурировать с условно-патогенными бактериями за питательные вещества, продуцировать антибактериальные пептиды и улучшать состояние интестинального барьера [20]. Снижение количества бифидо- и лактобактерий также приводит к уменьшению их ферментативной активности, что проявляется нарушением процессов утилизации организмом человека биологически активных соединений, активизацией гнилостных и бродильных процессов [21].

Условно-патогенная пристеночная микробиота у пациентов с НАЖБП и контрольной группы представлена практически в одинаковом количестве. При этом у пациентов содержание условно-патогенной микробиоты превышало количество полезной, в то время как у здоровых лиц практически вдвое преобладала полезная микробиота. Условно-патогенная микробиота представлена преимущественно C. ramosum, также часто обнаруживались A. viscosus, Ruminococcus, Nocardia и Staphyllococcus. Численность Ruminococcus у пациентов с НАЖБП почти вдвое превышала таковую у здоровых лиц. Относительно представителей, относящихся к Ruminococcus и Roseburia, в литературе имеются противоречивые данные: по результатам одних исследований выявлено незначительное снижение Ruminococcus у пациентов с НАЖБП, по результатам других – повышение [22]. Ruminococcus расщепляют целлюлозу, накапливают в цитоплазме резервный йодофильный полимер глюкозы. Nocardia также ферментируют различные углеводы, в том числе глюкозу [23].

Заключение

В представленном исследовании продемонстрированы особенности изменений полостной и пристеночной энтеральной микробиоты у пациентов с НАЖБП. Полостная микробиота тонкой кишки представлена СИБР в 68,5% случаев. При изучении пристеночной микробиоты тонкой кишки выявлено снижение общей бактериальной нагрузки за счет уменьшения численности всех представителей полезной микробиоты – Bifidobacterium, Lactobacillus и Lactococcus, Eubacterium и Propionibacterium. Содержание условно-патогенной микробиоты у пациентов с НАЖБП превышало содержание полезной, в то время как у контрольной группы вдвое преобладала полезная микробиота. В настоящее время недостаточно изучено формирование пристеночной микробиоты, однако, по результатам наших исследований, существенна роль СИБР в изменении ее структуры при НАЖБП.

Недавно появилась информация, что Bifidobacterium улучшают течение НАЖБП. При применении Bifidobacterium повышается синтез сиртрулина в ткани печени, регулирующего экспрессию рецепторов, активируемых пероксисомными пролифераторами α, и уменьшающего степень связывания регулятора фактора транскрипции SREBP1c, что предотвращает прогрессирование НАЖБП [22]. В этой связи актуальной становится разработка лечебно-профилактических мероприятий при НАЖБП с позиции восстановления кишечной микробиоты.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Все авторы в равной степени участвовали в подготовке публикации: разработка концепции статьи, получение и анализ фактических данных, написание и редактирование текста статьи, проверка и утверждение текста статьи.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the exploration and analysis work.

About the authors

Yakov M. Vakhrushev

Izhevsk State Medical Academy

Email: anna.lukashevich.89@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4634-2658

д-р мед. наук, проф., зав. каф. пропедевтики внутренних болезней с курсом сестринского дела

Russian Federation, Izhevsk

Anna P. Lukashevich

Izhevsk State Medical Academy

Author for correspondence.
Email: anna.lukashevich.89@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9424-6316

канд. мед. наук, ассистент каф. пропедевтики внутренних болезней с курсом сестринского дела

Russian Federation, Izhevsk

Mariia V. Lyapina

Tyumen State Medical University

Email: anna.lukashevich.89@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9608-2746

канд. мед. наук, доц. каф. пропедевтической и факультетской терапии

Russian Federation, Tyumen

References

Supplementary files