Изменение каталитических свойств эпоксиалкогольсинтазы CYP443D1 (NvEAS) роющей литоральной актинии Nematostella vectensis в результате единичной аминокислотной замены

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Цитохромы суперсемейства Р450 широко распространены в природе; они обнаружены во всех изученных аэробных организмах. Несмотря на то что степень сходства цитохромов Р450 разных семейств невысокая, все ферменты этого суперсемейства имеют сходную третичную структуру. Кроме того, у всех цитохромов Р450, в том числе у ферментов клана CYP74, в последовательностях содержатся субстрат-распознающие сайты, формирующие каталитический центр. Изначально ферменты CYP74 были обнаружены у растений, у которых они широко распространены и играют важную роль в липоксигеназном каскаде. Позже CYP74-подобные ферменты других семейств были выявлены у представителей разных таксонов, в том числе у животных. На основании результатов филогенетических исследований, структуры и механизмов каталитического действия они были объединены наряду с семейством CYP74 в клан CYP74. Одним из представителей клана CYP74 является эпоксиалкогольсинтаза NvEAS (CYP443D1) роющей литоральной актинии Nematostella vectensis. Методом сайт-направленного мутагенеза была получена мутантная форма NvEAS с заменой P93G, которая приобрела дополнительную гидропероксидлиазную активность. До настоящей работы были описаны только результаты сайт-направленного мутагенеза ферментов семейства, но не клана CYP74. Более того, в настоящей работе впервые описано превращение эпоксиалкогольсинтазы в гидропероксидлиазу. Эти результаты подтверждают высказанное ранее предположение об эволюции ферментов CYP74 по пути эпоксиалкогольсинтаза – гидропероксидлиаза – алленоксидсинтаза – дивинилэфирсинтаза.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

С. С. Горина

Федеральный исследовательский центр “Казанский научный центр Российской академии наук”

Email: kibmail@kibb.knc.ru

Казанский институт биохимии и биофизики

Россия, Казань

Н. В. Ланцова

Федеральный исследовательский центр “Казанский научный центр Российской академии наук”

Email: kibmail@kibb.knc.ru

Казанский институт биохимии и биофизики

Россия, Казань

Я. Ю. Топоркова

Федеральный исследовательский центр “Казанский научный центр Российской академии наук”

Автор, ответственный за переписку.
Email: kibmail@kibb.knc.ru

Казанский институт биохимии и биофизики

Россия, Казань

А. Н. Гречкин

Федеральный исследовательский центр “Казанский научный центр Российской академии наук”

Email: kibmail@kibb.knc.ru

Казанский институт биохимии и биофизики; академик РАН

Россия, Казань

Список литературы

  1. Blee, E. Phytooxylipins and plant defense reactions // Рrog. Lipid Res. 1998. Vol. 37. Р. 33–72.
  2. Savchenko, T.V., Zastrijnaja, O.M., and Klimov, V.V. Oxylipins and plant abiotic stress resistance // Biochemistry. 2014. Vol. 79. Р. 362–375.
  3. Howe, G.A. and Schilmiller, A.L. Oxylipin metabolism in response to stress // Curr. Opin. Plant Biol. 2002. Vol. 5. Р. 230–236.
  4. Deboever, E., Deleu, M., Mongrand, S., Lins, L., and Fauconnier, M.-L. Plant-pathogen interactions: underestimated roles of phyto-oxylipins // Trends Plant Sci. 2020. Vol. 25. Р. 22–34.
  5. Wasternack, C. and Feussner, I. The oxylipin pathways: biochemistry and function // Annu. Rev. Plant Biol. 2018. Vol. 69. Р. 363–386.
  6. Liavonchanka, A. and Feussner, I. Lipoxygenases: occurrence, functions and catalysis // J. Plant Physiol. 2006. Vol. 163. Р. 348–357.
  7. Feussner, I. and Wasternack, C. The lipoxygenase pathway // Annu Rev. Plant Biol. 2002. Vol. 53. Р. 275–297. https://doi.org/10.1146/annurev.arplant.53.100301.135248
  8. Werck-Reichhart, D. and Feyereisen, R. Cytochromes P450: a success story // Genome Biol. 2000. Vol. 6. Р. 1–7.
  9. Toporkova, Y.Y., Gorina, S.S., Bessolitsyna, E.K., Smirnova, E.O., Fatykhova, V.S., Brühlmann, F., Ilyina, T.M., Mukhtarova, L.S., and Grechkin, A.N. Double function hydroperoxide lyases/epoxyalcohol synthases (CYP74C) of higher plants: identification and conversion into allene oxide synthases by sitedirected mutagenesis // Biochim. Biophys. Acta. 2018. Vol. 1863(4). Р. 369–378.
  10. Nelson, D.R. Cytochrome P450 nomenclature, 2004 // Methods Mol. Biol. 2006. Vol. 320. Р. 1–10.
  11. Lee D.S., Nioche P., Hamberg M., and Raman C.S. Structural insights into the evolutionary paths of oxylipin biosynthetic enzymes // Nature. 2008. Vol. 455. Р. 363–370.
  12. Toporkova, Y.Y., Fatykhova, V.S., Gogolev, Y.V., Khairutdinov, B.I., Mukhtarova, L.S., and Grechkin, A.N. Epoxyalcohol synthase of Ectocarpus siliculosus. First CYP74-related enzyme of oxylipin biosynthesis in brown algae // Biochim. Biophys. Acta. 2017. Vol. 1862. Р. 167–175.
  13. Toporkova, Y.Y., Gorina, S.S., Mukhitova, F.K., Hamberg, M., Ilyina, T.M., Mukhtarova, L.S., and Grechkin, A.N. Identification of CYP443D1 (CYP74 clan) of Nematostella vectensis as a first cnidarian epoxyalcohol synthase and insights into its catalytic mechanism // Biochim. Biophys. Acta. 2017. Vol. 1862(10). Р. 1099–1109.
  14. Горина, С.С., Топоркова, Я.Ю., Мухтарова, Л.Ш., Гречкин, А.Н. Цитохром CYP443C1 (клан CYP74) актинии Nematostella vectensis – первый фермент Metazoa, проявляющий двойную активность гидропероксидлиазы/ эпоксиалкогольсинтазы // Доклады Академии наук. 2019. Т. 486(3). С. 384–388.
  15. Gotoh, O. Substrate recognition sites in cytochrome P450 family 2 (CYP2) proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding nucleotide sequences // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. Р. 83–90.
  16. Toporkova, Y.Y., Gogolev, Y.V., Mukhtarova, L.S., and Grechkin, A.N. Determinants governing the CYP74 catalysis: conversion of allene oxide synthase into hydroperoxide lyase by site-directed mutagenesis // FEBS lett. 2008. Vol. 582(23-24). Р. 3423–3428.
  17. Toporkova, Y.Y., Smirnova, E.O., and Gorina, S.S. Epoxyalcohol synthase branch of lipoxygenase Cascade // Curr. Issues Mol. Biol. 2024. Vol. 46. Р. 821–841.
  18. Wilson, R.A., Gardner, H.W., and Keller, N.P. Cultivar-dependent expression of a maize lipoxygenase responsive to seed infesting fungi // Mol. Plant Microbe Iinteract. 2001. Vol. 14. Р. 980–987.
  19. Rzhetsky, A. and Nei, M. A simple method for estimating and testing minimum evolution trees // Mol. Biol. EVol. 1992. Vol. 9. Р. 945–967.
  20. Nei, M. and Kumar, S. Molecular Evolution and Phylogenetics, New York: Oxford University Press, 2000.
  21. Saitou, N. and Nei, M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic Trees // Mol. Biol. EVol. 1987. Vol. 4. Р. 406–425.
  22. Kumar, S., Stecher, G., and Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets // Mol. Biol. EVol. 2016. Vol. 33. Р. 1870–1874.
  23. Felsenstein, J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap // Evolution. 1985. Vol. 39. Р. 783–791.
  24. Meng, E.C., Goddard, T.D., Pettersen, E.F., Couch, G.S., Pearson, Z.J., Morris, J.H., and Ferrin, T.E. UCSF ChimeraX: Tools for structure building and analysis // Protein Sci. 2023. 32(11):e4792.
  25. Zoller, M.J. and Smith, M. Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA // Nucleic Acids Res. 1982. Vol. 10(20). Р. 6487–6500.
  26. Schenkman, J.B. and Jansson, I. Spectral analyses of cytochromes P450, Cytochrome P450 protocols. Humana Press, Totowa, NJ. 2006. Р. 11–18.
  27. Grechkin, A.N., Bruhlmann, F., Mukhtarova, L.S., Gogolev, Y.V., and Hamberg, M. Hydroperoxide lyases (CYP74C and CYP74B) catalyze the homolytic isomerization of fatty acid hydroperoxides into hemiacetals // Biochim. Biophys. Acta. 2006. Vol. 1761. Р. 1419–1428.
  28. Mukhtarova, L.S., Mukhitova, F.K., Gogolev, Y.V., and Grechkin, A.N. Hydroperoxide lyase cascade in pea seedlings: non-volatile oxylipins and their age and stress dependent alterations // Phytochemistry. 2011. Vol. 72. Р. 356–364.
  29. Mukhtarova, L.S., Bruhlmann, F., Hamberg, M., Khairutdinov, B.I., and Grechkin, A.N. Plant hydroperoxide-cleaving enzymes (CYP74 family) function as hemiacetal synthases: Structural proof of hemiacetals by NMR spectroscopy // Biochim. Biophys. Acta. 2018. Vol. 1863. Р. 1316–1322.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Филогенетическое древо клана CYP74. Подсемейства обведены и обозначены буквами (А, В, С и т.д.). Представители ферментов CYP74 растений: As, Allium sativum; AsDES, CYP74H1, GI:83414021; At, Arabidopsis thaliana; AtAOS, CYP74A1, GI:15239032; AtHPL, CYP74B2, GI:3822403; Ca, Capsicum annuum; CaHPL, CYP74B1, GI:1272340, CaDES, CYP74D4, GI: 107840369; Cm, Cucumis melo; CmHPL/EAS, CYP74C2, GI:14134199; Csa, Cucumis sativus; CsaHPL/EAS, CYP74C1_CS, GI: 101211324; CsaHPL/EAS/AOS, CYP74C31 GI:101211574; CsaHPL, CYP74B6, GI: 101223126; Csi, Camellia sinensis; CsiHPL, CYP74B24, SI: BAU24783.1; Dc, Daucus carota; CYP74B33, GI: 108219710; Hv, Hordeum vulgare; HvAOS2, CYP74A3, SI: AJ251304.1; HvHPL, CYP74F3, CAC82980.1; Kf, Klebsormidium flaccidum (зеленые водоросли); KfAOS, SI: LC032459.1; Le, Lycopersicum esculentum; LeAOS1, CYP74A1, GI:7581989; LeAOS2, CYP74A2, GI:7677376; LeAOS3, CYP74C3, GI:25991603; LeHPL, CYP74B3, GI:7677378 LeDES, CYP74D4, GI: 543675; Lj, Lotus japonicus; LjHPL, CYP74B15, SI: AB600748.1; Lu, Linum usitatissimum; LuAOS, CYP74A1, GI:1352186; LuDES, CYP74B16, GI:379048766; Mp, Marchantia polymorpha; MpAOS1, SI:LC032457.1, MpAOS2, SI:LC032458.1; Mt, Medicago truncatula; MtHPL3, CYP74B5, GI:63081244; MtHPL1/EAS, CYP74C13_MT, GI:33504430; Nt, Nicotiana tabacum; NtDES, CYP74D3; GI: 107799697; Os, Oryza sativa; OsAOS, CYP74A4, GI:115455571; OsHPL1, CYP74E2, GI:115445057; OsHPL2, CYP74E1, GI:125538638; Pa, Parthenium argentatum; PaAOS, CYP74A1, GI:218511958; Pd, Prunus dulcis; PdHPL, CYP74C5, GI:33300600; Pg, Psidium guajava; PgHPL, CYP74B5, GI:13183137; Pp, Physcomitrella patens; PpAOS1, CYP74A1, GI:22217985; PpAOS2, CYP74A8, GI:168014176; PpHPL, CYP74G1, GI:76057841; Ra, Ranunculus acris; RaDES, CYP74Q1, GI:768564485; Rj, Ranunculus japonicus; RjEAS, CYP74A88, SI:MK061531; Sm, Selaginella moellendorffii; SmDES1, CYP74M1, GI:9660714; SmEAS, CYP74M2, GI: 9637471; SmDES2, CYP74M3, GI:9654395; St, Solanum tuberosum; StAOS2, CYP74A6, GI:86769479; StAOS3, CYP74C10, GI:56605358; StHPL/EAS, CYP74C4, GI:102588560; StDES, CYP74D2, GI:12667099; Vv, Vitis vinifera; VvHPL, CYP74B13, FJ861082; Zm, Zea mays; ZmAOS, CYP74A19, GI: 223947589; ZmHPL, CYP74F2, GI:162462890. Представители клана ферментов CYP74: Es, Ectocarpus siliculosus (бурые водоросли); EsEAS, CYP5164B1, GI:1109557544; Mn, Methylobacterium nodulans (протеобактерии); MnHPL, SI:WP_015932840.1; Msp, Methylobacterium sp. 4–46; MspCYP74, SI:WP_012335549.1. Ap, Acropora palmata (Metazoa); ApAOS, GI:187948710; Bf, Branchiostoma floridae (Metazoa); BfEAS, CYP440A1, GI:189312561; Bb, Branchiostoma belcheri, BbEAS/AOS, CYP440A18, XP_019641998.1; Nv, N. vectensis (Metazoa); NvEAS CYP443D1, GI:5516222; NvHPL/EAS CYP443C1. Черными кружочками обозначены ферменты CYP74, для которых проведены эксперименты по сайт-направленному мутагенезу [16]. Звездочкой обозначена NvEAS, мутантная форма которой описана в этой статье.

Скачать (309KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Результат наложения смоделированных in silico третичных структур NvEAS дикого типа (синий цвет) и его мутантной формы NvEAS P93G (голубой цвет) относительно установленной с помощью рентгеноструктурного анализа структуры PaAOS (зеленый цвет). Сайт, выбранный для замены, обведен красным кругом; желтым цветом показаны остатки цистеина (гемовый лиганд) белковых молекул.

Скачать (436KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Хроматограммы разделения продуктов (Ме/ТМС после восстановления с помощью NaBH4) инкубации 9-ГПОД с NvEAS дикого типа (а) и мутантной формой NvEAS P93G (б). 1, 9,10-эпокси-11-гидрокси-12-октадеценовая кислота; 2, 9-гидроксинонановая кислота; 3, 9,10-эпокси-13-гидрокси-11-октадеценовая кислота.

Скачать (107KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Схема переключения механизмов каталитического действия ГПЛ и ЭАС.

Скачать (135KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025