Точечные мутации в М-домене PCID2 нарушают его функции в экспорте мРНК у Drosophila melanogaster

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Белок PCID2 входит в состав комплекса TREX-2 эукариот, отвечающего за экспорт мРНК из ядра в цитоплазму. Ранее, мы показали, что PCID2 D. melanogaster участвует в специфичном распознавании мРНК и выявили ключевые аминокислоты, отвечающие за взаимодействие с РНК гена ras2. В данной работе мы показываем, что точечные мутации данных аминокислот нарушают взаимодействие белка с РНК клетки и экспорт полиА- содержащей мРНК из ядра в цитоплазму в клетках D. melanogaster.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Ю. А. Вдовина

Федеральное государственное учреждение науки Институт Молекулярной Биологии Российской академии наук

Email: d_dmitrieva@mail.ru
Россия, Москва

С. Г. Георгиева

Федеральное государственное учреждение науки Институт Молекулярной Биологии Российской академии наук

Email: d_dmitrieva@mail.ru

академик РАН

Россия, Москва

Д. В. Копытова

Федеральное государственное учреждение науки Институт Молекулярной Биологии Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: d_dmitrieva@mail.ru
Россия, Москва

Список литературы

  1. Kramer S. Nuclear mRNA maturation and mRNA export control: from trypanosomes to opisthokonts. // Parasitology. England, 2021. Vol. 148, № 10. P. 1196–1218.
  2. Wilmes G.M. et al. A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing. // Molecular cell. United States, 2008. Vol. 32, № 5. P. 735–746.
  3. Santos-Pereira J.M. et al. A genome-wide function of THSC/TREX-2 at active genes prevents transcription-replication collisions. // Nucleic acids research. England, 2014. Vol. 42, № 19. P. 12000–12014.
  4. Kurshakova M.M. et al. SAGA and a novel Drosophila export complex anchor efficient transcription and mRNA export to NPC // EMBO Journal. 2007. Vol. 26, № 24.
  5. Lu Q. et al. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. // The Plant journal : for cell and molecular biology. England, 2010. Vol. 61, № 2. P. 259–270.
  6. Fischer T. et al. The mRNA export machinery requires the novel Sac3p-Thp1p complex to dock at the nucleoplasmic entrance of the nuclear pores. // The EMBO journal. England, 2002. Vol. 21, № 21. P. 5843–5852.
  7. Rodríguez-Navarro S. et al. Sus1, a functional component of the SAGA histone acetylase complex and the nuclear pore-associated mRNA export machinery. // Cell. United States, 2004. Vol. 116, № 1. P. 75–86.
  8. Chekanova J.A. et al. Sus1, Sac3, and Thp1 mediate post-transcriptional tethering of active genes to the nuclear rim as well as to non-nascent mRNP. // RNA (New York, NY). 2008. Vol. 14, № 1. P. 66–77.
  9. Ellisdon A.M. et al. Structural basis for the assembly and nucleic acid binding of the TREX-2 transcription-export complex. // Nature structural & molecular biology. United States, 2012. Vol. 19, № 3. P. 328–336.
  10. Fischer T. et al. Yeast centrin Cdc31 is linked to the nuclear mRNA export machinery. // Nature cell biology. England, 2004. Vol. 6, № 9. P. 840–848.
  11. Jani D. et al. Functional and structural characterization of the mammalian TREX-2 complex that links transcription with nuclear messenger RNA export. // Nucleic acids research. England, 2012. Vol. 40, № 10. P. 4562–4573.
  12. Glukhova A.A. et al. PCID2, a subunit of the Drosophila TREX-2 nuclear export complex, is essential for both mRNA nuclear export and its subsequent cytoplasmic trafficking // RNA Biology. United States, 2021. Vol. 18, № 11. P. 1969–1980.
  13. Kopytova D. et al. ORC interacts with THSC/TREX-2 and its subunits promote Nxf1 association with mRNP and mRNA export in Drosophila // Nucleic Acids Research. 2016. Vol. 44, № 10.
  14. Vdovina Y.A. et al. PCID2 Subunit of the Drosophila TREX-2 Complex Has Two RNA-Binding Regions. // Current issues in molecular biology. Switzerland, 2023. Vol. 45, № 7. P. 5662–5676.
  15. Vdovina Y.A., Georgieva S.G., Kopytova D.V. Interaction of mRNA with the C-Terminal Domain of PCID2, a Subunit of the TREX-2 Complex, Is Required for Its Export from the Nucleus to the Cytoplasm in Drosophila melanogaster. // Doklady Biochemistry and biophysics. United States, 2023. Vol. 513, № 1. P. 328–331.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Предсказанные сайты связывания с РНК на молекуле PCID2. (а) Эволюционное выравнивание последовательности М-домена PCID2 у некоторых видов эукариот. Аминокислоты, замененные в мутантных белках PCID2R191A и PCID2R216A, выделены и обведены в рамку. (б) Предсказанная структура PCID2 D. melanogaster из базы данных AlphaFold Protein Structure Database. Аминокислоты в М-домене белка, замененные в мутантных белках PCID2R191A и PCID2R216A, указаны на предсказанной структуре PCID2.

Скачать (209KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Нарушение ассоциации PCID2 с точечными мутациями в М-домене с новосинтезированной РНК. Меченную биотином EU-РНК инкубировали с лизатами клеток, содержащих PCID2, или PCID2R191A, или PCID2R216A, экспрессированными в (а) бактериальной системе и (б) в S2 клетках D. melanogaster. Меченная биотином EU-РНК со связавшимися белками была иммобилизована на стрептавидин-агарозе. Ассоциированные с РНК белки детектировали вестерн-блот анализом.

Скачать (131KB)
Метаданные
4. Рис. 3. PCID2 с точечными мутациями в М-домене не способен выполнять свои функции в экспорте мРНК. (а) Распределение мРНК в S2 клетках в контрольных клетках (wt) и при нокдауне PCID2 (контроль). В экспериментах клетки, в которых проводился нокдаун PCID2, были трансфецированы полноразмерным PCID2 или PCID2R191A, или PCID2R216A. Примеры распределения мРНК (красное окрашивание) и клеточных ядер (зеленое окрашивание) и соответствующие слитые изображения показаны для контрольных клеток и клеток после нокдауна PCID2 и трансфекции с PCID2wt, PCID2R191A, PCID2R216A (увеличение, x1000). Для выявления поли(A) РНК проводили РНК FISH с использованием меченного Cy3-олиго-dT праймера. Ядра окрашивали DAPI. Изображения были перекрашены в программе Photoshop для лучшей визуализации. (б) Процент клеток, в которых мРНК оставалась в ядре. На гистограмме представлены результаты эксперимента, описанного на Рисунке 3а. Каждый эксперимент был проведен в четырех повторах. В каждой реплике вслепую подсчитывали около 200 клеток и вычисляли среднее значение. Сравнение между экспериментальными группами проводилось с помощью t-критерия Стьюдента. Все данные представлены как средние ± SD (столбцы ошибок) не менее чем для четырех независимых экспериментов. Звездочки указывают на то, что данные статистически значимы при *P < 0,05 или **P < 0,01.

Скачать (147KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024