CULTIVATION OF MYCELIUM AND THE STUDY OF THE PHYTOPATHOGENICITY OF CERTAIN XYLOTROPHIC BASIDIOMYCETES UNDER IN VITRO CONDITIONS

Abstract


The paper discusses the cultivation of the mycelium of some economically significant xylotrophic basidiomycetes using methods of clonal micropropagation. For cultivation, Chapek, Murashige-Skoog synthetic synthetic media are used, a comparative analysis of mycelium growth in these media is carried out. Particular attention is paid to the study of the phytopathogenic properties of mycelium obtained in vitro. Two variants of phytopathogenicity are being studied: the cultural one, which is associated with the nature and intensity of mycelium growth on a nutrient medium, and phytopathogenicity for anatomical structures during the joint cultivation of xylotrophic basidiomycetes mycelium with parts of shoots from B. pendula and P. tremula . Significant variability was shown both in the expansivity of mycelial growth and in the manifestation of the degree of phytopathogenicity in different types of xylotrophs. Microscopy of the in vitro mycelium obtained was also carried out in order to more accurately identify the organism under study and to study the anatomical and morphological features. In general, this study will make it possible to better understand the ecology of these organisms in vivo, to model the interaction of the host parasite, and to more quickly and accurately conduct a specific determination of the phytopathogen, which can be used when conducting sanitary-protective and other economic activities in the forest industry.

Full Text

Введение Ксилотрофные базидиомицеты играют важную роль, поскольку являются фитопатогенами хозяйственно ценных лесных культур [2; 12]. Деструкция древесины, которую вызывают эти организмы, приводит к снижению ее качества, что отрицательно сказывается на объеме лесозаготовок [6]. При разрушении древесины наблюдаются изменения как ее физических, так и химических свойств, что в свою очередь приводит к серьезным экономическим потерям [3; 10]. Поэтому требуется серьезный подход в изучении особенностей ростовых процессов и фитопатогенности данной группы базидиомицетов, что позволяют сделать методы, применяемые при культивировании в условиях in vitro. Развитие биотехнологии как прикладной отрасли биологии позволяет выращивать мицелий ксилотрофных базидиомицетов в чистой культуре. Для этой группы организмов отмечено достаточно легкое выделение чистой культуры из природных объектов, быстрый рост на синтетических питательных средах, они не требовательны к богатству элементарного состава питательных сред [4]. Кроме того, методы, применяемые в биотехнологии, позволят изучить фитопатогенность как экологическое явление взаимодействия ксилотрофных базидиомицетов с организмом-хозяином, а именно мелколиственными хозяйственно ценными породами деревьев. Цель работы - изучить особенности культивирования и фитопатогенность мицелия некоторых ксилотрофных базидиомицетов на разных синтетических питательных средах. Материалы и методы исследования В качестве объектов исследования нами были выбраны следующие ксилотрофные базидиомицеты: Fomes fomentarius (L.) Fr., Phellinus igniarius (L.) Quel., Piptoporus betulinus (Bull.) P. Karst., Inonotus obliquus (Ach. ex Pers.) Pil. [1]. Для этой группы организмов характерны макроскопические плодовые тела, которые примыкают одной из сторон к дереву с плотной консистенцией ткани. Для изучения особенностей ростовых процессов мицелия ксилотрофов были использованы методы, которые широко используются в биотехнологии растительных объектов. Плодовые тела были отобраны в березняке и осиннике Костромского, Красносельского и Кологривского районов Костромской области. Для изучения была отобрана центральная мицелиальная часть у молодых плодовых тел F. fomentarius, P. igniarius, P. betulinus, I. obliquus [8; 13]. Проведена дробная стерилизация отобранного материала при следующем режиме: 1) погружение в 70%-ный этанол с экспозицией 1 мин; 2) выдерживание в 3%-ном гипохлорите натрия в течение 15 мин; 3) промывание материала в стерильной дистиллированной воде; 4) экспозиция в стерильной дистиллированной воде в течение 5 мин для окончательного удаления стерилизующего агента. Затем производилась инокуляция мицелия в условиях ламинарного укрытия [7]. Культивирование мицелия ксилотрофных базидиомицетов проводили на специализированной для микобионтов питательной среде Чапека и на среде Мурасиге-Скуга (MS), которая применяется для культивирования растительных объектов (табл. 1) [11; 14]. Таблица 1 Состав питательных сред для культивирования ксилотрофных базидиомицетов Компоненты среды Концентрация веществ, мг/л Компоненты среды Концентрация веществ, мг/л MS Чапека MS Чапека NH4NO3 1 650 - FeSO4·7H2O 27,8 - KNO3 1 900 - Na2ЭДТА·2H2O 37,2 - KH2PO4 170 1 000 Инозитол 100 - CaCl2·2Н2О 340 - Кальция пантотенат 0,5 - MnSO4·4H2O 22,3 - Никотиновая кислота 0,5 - MgSO4 ·H2O 370 500 Тиамин 0,5 1 Н3ВО3 6,2 - Пиридоксин 0,5 - ZnSO4·7H2O 8,6 0,5 Глицин 2 - KI 0,83 - Сахароза 25 000 6 000 CuSO4·5H2O 0,025 - Мальтоза - 4 000 Na2MoO4·2H2O 0,25 Агар «Биолот» 5 000 6 000 CoCl2·6H2O 0,025 pH 5,7 5,7 Также использовались питательные среды MS и Чапека с частями стерильной древесины Betula pendula Roth. и Populus tremula L. для оценки фитопатогенности мицелия [5]. Древесину стерилизовали в сухожаровом шкафу при 160°С 2,5 ч. Культивирование осуществляли на световых стеллажах при интенсивности освещенности 2 500 люкс и температуре 25°С [9]. Результаты культивирования проверялись на 15-20-е сутки. При этом была проведена оценка морфологии и микроскопической структуры мицелия. Стерильный мицелий ксилотрофов был изучен с использованием световой микроскопии (микроскоп «Биомед-3»), увеличение - х600 [15]. Результаты и их обсуждение Наиболее активный рост мицелия наблюдался на питательной среде MS: мицелий от белого до почти черного цвета распространялся как по поверхности питательной среды (P. betulinus), так и проникал вглубь (I. obliquus, F. fomentarius, P. igniarius). Стоит отметить, что рост мицелия P. betulinus на питательной среде начался более интенсивно и в более ранние сроки, чем у других изучаемых ксилотрофов, это можно объяснить более мягкой структурой плодового тела березовой губки. При дальнейшем изучении мицелия отмечался сильный грибной запах, характерный для ксилотрофных базидиомицетов. При этом не было замечено спороношения мицелия (табл. 2). Эти признаки говорят о том, что на питательной среде отмечался именно рост мицелия ксилотрофов, что позволяет исключить контаминацию и идентифицировать культивируемые объекты. Питательная среда Чапека по многим показателям уступала среде MS. В первую очередь отмечался более медленный рост мицелия, а прирост по биомассе на 30-й день культивирования при средних значениях для всех культур также оказался менее продуктивным именно на данной питательной среде (рис. 1). Это, конечно, связано с достаточно бедным содержанием в среде Чапека макро- и микроэлементов, а также некоторых органических веществ, необходимых для развития живых организмов и, в частности, мицелия ксилотрофов. Но это также является и преимуществом при выращивании мицелия в промышленных масштабах (например, для нужд фармацевтической промышленности), так как значительно удешевляет получаемую биомассу вследствие малого расхода компонентов для питательной среды [16]. Рис. 1. Влияние типа питательной среды на прирост биомассы мицелия (среднее значение для всех культур) Проводилась серия опытов по совместному культивированию выделенного мицелия с частями древесины деревьев, к которым данные ксилотрофы проявляли тропность. В дальнейшем с использованием микроскопии изучали морфологию мицелия и проводили оценку его прорастания в древесину. Такое исследование необходимо для определения степени фитопатогенности объекта. Оценку результатов производили через 35-40 суток. Результаты роста, морфологии и микроскопии мицелия были сведены в таблицу (табл. 2). Таблица 2 Сравнительная анатомо-морфологическая характеристика мицелия разных видов ксилотрофных базидиомицетов Оцениваемый признак Анатомо-морфологическая характеристика мицелия Piptoporus betulinus (Bull.) P.Karst., 1881 Особенности роста на питательных средах Мицелий белого цвета распространялся исключительно по поверхности питательной среды, отмечался сильный грибной запах, характерный для данного вида. Спороношения нет Культуральная фитопатогенность Выраженная ксилотропность по отношению к B. pendula. Быстрый экспансивный рост нитей мицелия и ориентация их к древесине Морфология мицелия Мицелий по морфологии слабоветвящийся, септированный, имеет единичные молодые зачатки гиф. Спороношения нет Окончание таблицы 2 Оцениваемый признак Анатомо-морфологическая характеристика мицелия Фитопатогенность для анатомических структур Был выявлен рост мицелия в пробковую и коровую части стебля березы с незначительным проникновением в ксилему. Умеренно выраженная фитопатогенность Inonotus obliquus (Ach. ex Pers.) Pilát (1942) Особенности роста на питательных средах Мицелий темно-коричневого цвета, проникает вглубь питательной среды, характерен медленный рост. Спороношения нет Культуральная фитопатогенность Фитопатогенность выражена слабо, мицелий прорастает в среду медленно, ксилотропность по отношению к B. pendula не выявлена Морфология мицелия Тонкие, умеренно септированные гифы Фитопатогенность для анатомических структур Малопатогенный ксилотроф, за коровую часть стебля гифы гриба не проникают, разрушение древесины не отмечено Fomes fomentarius (L.) Fr., 1849 Особенности роста на питательных средах Мицелий полиморфен от белого до почти черного цвета, гифы располагаются плотно и фрагментарно на поверхности питательной среды. Спороношения нет Культуральная фитопатогенность Ксилотропный рост мицелия выражен умеренно, тенденция к общей экспансии гиф гриба по поверхности питательной среды со слабым проникновением вглубь Морфология мицелия Мицелий слабо септирован, гифы хорошо выражены, плотно переплетены между собой, создавая при этом плотные структуры на поверхности среды Фитопатогенность для анатомических структур Мицелий прорастает в коровый слой и частично внедряется в ксилему Phellinus igniarius (L.) Quél. (1886) Особенности роста на питательных средах Мицелий бесцветен, характерна тонкая мицелиальная структура, которая активно внедряется в субстрат. Спороношения нет Культуральная фитопатогенность Очень высокая, мицелий локализован преимущественно на части древесины, отмечено образование примордия Морфология мицелия Сложная структура, мицелий слабо септирован, гифы окрашены в коричневый цвет, образуют петли и структуры с неустановленным функциональным значением Фитопатогенность для анатомических структур Отмечена крайняя степень патогенности, мицелий полностью разрушает все слои древесины до состояния трухи Особое внимание следует уделить морфологии мицелия и фитопатогенности для анатомических структур, поскольку именно эти параметры во многом определяют взаимодействие ксилотрофных базидиомицетов с организмом-хозяином. Так, например, у I. obliquus отмечается тонкий септированный мицелий и слабое фитопатогенное влияние на структуру древесины при совместном культивировании, поэтому в природных условиях данный ксилотроф практически никогда не встречается на мертвых деревьях (рис. 2). Рис. 2. Культивирование I. obliquus на питательной среде MS (слева), морфология мицелия I. obliquus при микроскопировании с увеличением ×600 (справа) Морфология мицелия P. igniarius отличается мощностью гиф, сложной слабо септированной структурой с петлями и неустановленными элементами, при этом данный ксилотроф отличается исключительной агрессивностью по отношению к древесине Populus tremula L. и при совместном культивировании вызывает не только полное ее разрушение, но и образование примордия (рис. 3). В природе P. igniarius также проявляет высоко патогенные свойства и при заражении дерева приводит к развитию сердцевинной гнили и быстрой гибели дерева. Отмечается также значительное образование плодовых тел. Стоит отметить, что только при культивировании данного ксилотрофного базидиомицета в условиях in vitro удалось получить примордий, что говорит и об агрессивном характере распространения данного фитопатогена. Рис. 3. Культивирование P. igniarius на питательной среде MS и образование примордия на части древесины P. tremula (слева), морфология мицелия P. igniarius при микроскопировании с увеличением ×600 (справа) Что касается таких ксилотрофных базидиомицетов как P. betulinus и F. fomentarius, стоит отметить их умеренную фитопатогенность по отношению к организму-хозяину, в природе эти виды предпочитают селиться на уже погибшие или сильно ослабленные мелколиственные породы и преимущественно на Betula pendula Roth. Что, однако, не говорит о том, что они не способны нанести ущерб лесному хозяйству. Заключение Используя методы, применяемые при клональном микроразмножении растений, удалось получить чистые культуры in vitro ксилотрофных базидиомицетов Fomes fomentarius (L.) Fr., Phellinus igniarius (L.) Quél, Piptoporus betulinus (Bull.) P.Karst., Inonotus obliquus (Ach. ex Pers.) Pilát. Проведено детальное изучение морфологии, анатомии и микроскопического строения мицелия этих объектов, также особое внимание было уделено изучению степени фитопатогенности и ее проявлений для анатомических структур организма-хозяина. Наиболее агрессивным ксилотрофным базидиомицетом оказался P. igniarius, который преимущественно поражает Populus tremula L. Фитопатогены Betula pendula Roth. оказались умеренно или слабопатогенными как по ксилотропности, так и по характеру проникновения в коровую часть и разрушению древесины. Полученные данные позволят лучше понимать особенности взаимодействия паразитических базидиомицетов с организмом-хозяином, а также проливают свет на экологию ксилотрофных базидиомицетов, что в свою очередь можно использовать при проведении лесотехнических и санитарных мероприятий по борьбе с фитопатогенами и для повышения качества древесины, получаемой от мелколиственных пород.

About the authors

E. V Maramokhin

Kostroma State University


M. V Sirotina

Kostroma State University


Dr.habil.

D. N Zontikov

Kostroma State University


Ph.D.

References

  1. Бондарцева М. А. Определитель грибов России (порядок Афиллофоровые). Л.: Наука, 1998. Вып. 2. 391 с.
  2. Бондарцева М. А. Эколого-биологические закономерности функционирования ксилотрофных базидиомицетов в лесных экосистемах // Грибные сообщества лесных экосистем. Петрозаводск: Карельский НЦ РАН, 2000. С. 9-25.
  3. Змитрович И. В., Фирсов Г. А., Бондарцева М. А., Волобуев С. В., Большаков С. Ю. Базидиомицеты - возбудители хронических гнилей деревьев ботанического сада Петра Великого ботанического института имени В. Л. Комарова РАН: диагностика, биология, распределение по территории // Hortus Botanicus. 2018. № 13(13). С. 182-204. http://hb.karelia.ru/journal/atricle.php?id=5082
  4. Ильина Г. В. Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре. Пенза: ПГАУ, 2013. 222 с.
  5. Ильин Д. Ю., Ильина Г. В., Сашенкова С. А., Шкаев Н. В., Филатов А. Экологические аспекты лабораторного культивирования природных изолятов ксилотрофных базидиомицетов, распространенных в Пензенской области и перспективных в биотехнологии // Нива Поволжья. 2015. № 4(37). С. 44-53.
  6. Камзолкина О. В., Биланенко Е. Н., Штаер О. В., Дольникова Г. А., Мухин В. А.Топология мицелия Fomes fomentarius, Fomitopsis pinicola, Piptoporus betulinus и сопутствующих им грибов и бактерий в древесном субстрате березы // Микология и фитопатология. 2012. Т. 46. № 3. С. 210-216.
  7. Марамохин Э. В., Малахова К. В. Изучение лесных фитопатогенов группы ксилотрофных базидиомицетов на примере Piptoporus betulinus (Bull.) P. Karst. и Phellinus igniarius (L.) Quеl. в культуре in vitro // Инженерные кадры - будущее инновационной экономики России. 2018. № 2. С. 74-77.
  8. Марамохин Э. В. Особенности культивирования ксилотрофного базидиомицета Piptoporus betulinus (Bull.) P. Karst. на синтетических питательных средах в условиях in vitro // Инновационные подходы к развитию науки и производства регионов: Сб. науч. тр. научно-практической конференции (12-14 февраля 2019 г.). Тверь, 2019. С. 97-99.
  9. Марамохин Э. В., Малахова К. В., Зонтиков Д. Н., Сиротина М. В. Перспективы получения биологически активных веществ из культуры ткани некоторых ксилотрофных базидиомицетов // Роль метаболомики в совершенствовании биотехнологических средств производства: Сб. тр. II международной научной конференции (6-7 июня 2019 г.). М., ВИЛАР, 2019. С. 159-162.
  10. Сафонов М. А., Устинова Г. М. Субстратная специализация ксилотрофных грибов, как фактор, определяющий их расселение // Вертикаль: вестник молодой науки Урала. 1997. Т. 2. № 1. С. 128-130.
  11. Сашенкова С. А., Ильина Г. В., Ильин Д. Ю. Изучение влияния обогащения питательных сред и субстратов микроэлементами германием и селеном при культивировании базидиальных грибов // Экологические проблемы и здоровье населения: материалы II Всероссийской научно-практической конференции. Пенза: ПГАУ, 2017. С. 48-51.
  12. Burdon J. J., Thrall P. H. Spatial and temporal patterns in coevolving plant and pathogen associations // The American Naturalist. 1999. V. 153. № S5. P. S15-S33. https://doi.org/10.1086/303209
  13. Krupodorova T. A., Barshteyn V. Y. Alternative substrates for higher mushrooms mycelia cultivation // Journal of BioScience & Biotechnology. 2015. V. 4. № 3. P. 339-347.
  14. Lemieszek M. K., Langner E., Kaczor J., Kandefer-Szerszen M., Sanecka B., Mazurkiewicz W., Rzeski W. Anticancer effect of fraction isolated from medicinal Birch polypore mushroom, Piptoporus betulinus (Bull.: Fr.) P. Karst. (Aphyllophoromycetideae): In vitro studies // International Journal of Medicinal Mushrooms. 2009. V. 11. № 4. P. 351-364. https://doi.org/10.1615/IntJMedMushr.v11.i4.20
  15. Leviu L., Castro M. A. Anatomical study of the decay caused by the white-rot fungus Trametes trogii (Aphyllophorales) in wood of Salix and Populus // IAWA journal. 1998. V. 19. № 2. P. 169-180. https://doi.org/10.1163/22941932-90001519
  16. Pleszczyńska M., Wiater A., Siwulski M., Lemieszek M. K., Kunaszewska J., Kaczor, J., Szczodrak J. Cultivation and utility of Piptoporus betulinus fruiting bodies as a source of anticancer agents // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2016. V. 32. № 9. P. 151. https://doi.org/10.1007/s11274-016-2114-4

Statistics

Views

Abstract - 0

PDF (Russian) - 0

Article Metrics

Metrics Loading ...

Refbacks

  • There are currently no refbacks.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies