Роль аминокислот каталитического домена интегразы ВИЧ-1, I182, R187, K188, в процессах обратной транскрипции и интеграции

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

В основе структурной организации интегразы ВИЧ-1 лежит тетрамер, сформированный двумя димерами белка. В составе этого тетрамера каталитический домен одной из субъединиц первого димера взаимодействует с N-концевым доменом субъединицы из второго димера. Именно тетрамерная структура позволяет правильно позиционировать два конца вирусной ДНК относительно ДНК клетки и осуществлять каталитические функции интегразы – 3′-процессинг и перенос цепи. Однако в ходе репликативного цикла ВИЧ-1 интеграза отвечает не только за этап интеграции: она участвует в обратной транскрипции, а также необходима на стадии формирования капсида вновь образуемых вирионов. Предполагается, что интеграза ВИЧ-1 является структурно-динамичным белком, и от ее структуры зависят ее биологические функции. Соответственно, изучение взаимодействий между доменами интегразы, обеспечивающими ее структуру, важно для понимания ее множественных функций. В настоящей работе исследована роль трех аминокислот каталитического домена, I182, R187 и K188, из области контакта двух димеров интегразы в структуре тетрамера в протекании стадий обратной транскрипции и интеграции. Установлено, что остаток R187 чрезвычайно важен для формирования правильной структуры интегразы, необходимой на всех этапах ее функциональной активности. Остаток I182 необходим для успешной интеграции и не важен для обратной транскрипции, а остаток K188, наоборот, участвует в формировании структуры интегразы, важной для эффективной обратной транскрипции.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Т. Ф. Кихай

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

Ю. Ю. Агапкина

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

Т. А. Приказчикова

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

М. В. Вдовина

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

С. П. Шехтман

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

C. В. Фомичева

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

С. П. Королев

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: kih.t1996@yandex.ru
Россия, Москва

М. Б. Готтих

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: gottikh@belozersky.msu.ru
Россия, Москва

Список литературы

  1. Wiskerchen, M., and Muesing, M. A. (1995) Human immunodeficiency virus type 1 integrase: effects of mutations on viral ability to integrate, direct viral gene expression from unintegrated viral DNA templates, and sustain viral propagation in primary cells, J. Virol., 69, 376-386, https://doi.org/10.1128/JVI.69.1.376-386.1995.
  2. Engelman, A. N., and Kvaratskhelia, M. (2022) Multimodal functionalities of HIV-1 integrase, Viruses, 14, 926, https://doi.org/10.3390/v14050926.
  3. Wu, X., Liu, H., Xiao, H., Conway, J. A., Hehl, E., Kalpana, G. V., Prasad, V., and Kappes, J. C. (1999) Human immunodeficiency virus type 1 integrase protein promotes reverse transcription through specific interactions with the nucleoprotein reverse transcription complex, J. Virol., 73, 2126-2135, https://doi.org/10.1128/JVI.73.3. 2126-2135.1999.
  4. Engelman, A., Englund, G., Orenstein, J. M., Martin, M. A., and Craigie, R. (1995) Multiple effects of mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase on viral replication, J. Virol., 69, 2729-2736, https://doi.org/10.1128/JVI.69.5.2729-2736.1995.
  5. Leavitt, A. D., Robles, G., Alesandro, N., and Varmus, H. E. (1996) Human immunodeficiency virus type 1 integrase mutants retain in vitro integrase activity yet fail to integrate viral DNA efficiently during infection, J. Virol., 70, 721-728, https://doi.org/10.1128/JVI.70.2.721-728.1996.
  6. Elliott, J., Eschbach, J. E., Koneru, P. C., Li, W., Puray-Chavez, M., Townsend, D., Lawson, D. Q., Engelman, A. N., Kvaratskhelia, M., and Kutluay, S. B. (2020) Integrase-RNA interactions underscore the critical role of integrase in HIV-1 virion morphogenesis, Elife, 9, e54311, https://doi.org/10.7554/eLife.54311.
  7. Kessl, J. J., Kutluay, S. B., Townsend, D., Rebensburg, S., Slaughter, A., Larue, R. C., Shkriabai, N., Bakouche, N., Fuchs, J. R., Bieniasz, P. D., and Kvaratskhelia, M. (2016) HIV-1 integrase binds the viral RNA genome and is essential during virion morphogenesis, Cell, 166, 1257-1268.e12, https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.07.044.
  8. Briones, M. S., Dobard, C. W., and Chow, S. A. (2010) Role of human immunodeficiency virus type 1 integrase in uncoating of the viral core, J. Virol., 84, 5181-5190, https://doi.org/10.1128/jvi.02382-09.
  9. Rozina, A., Anisenko, A., Kikhai, T., Silkina, M., and Gottikh, M. (2022) Complex relationships between HIV-1 integrase and its cellular partners, Int. J. Mol. Sci., 23, 12341, https://doi.org/10.3390/ijms232012341.
  10. Knyazhanskaya, E., Anisenko, A., Shadrina, O., Kalinina, A., Zatsepin, T., Zalevsky, A., Mazurov, D., and Gottikh, M. (2019) NHEJ pathway is involved in post-integrational DNA repair due to Ku70 binding to HIV-1 integrase, Retrovirology, 16, 30, https://doi.org/10.1186/s12977-019-0492-z.
  11. Агапкина Ю., Приказчикова Т., Смолов М., Готтих М. (2005) Структура и функции интегразы ВИЧ-1, Успехи биологической химии, 45, 87-112.
  12. Hare, S., Di Nunzio, F., Labeja, A., Wang, J., Engelman, A., and Cherepanov, P. (2009) Structural basis for functional tetramerization of lentiviral integrase, PLoS Pathog., 5, e1000515, https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000515.
  13. Passos, D. O., Li, M., Yang, R., Rebensburg, S. V., Ghirlando, R., Jeon, Y., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Craigie, R., and Lyumkis, D. (2017) Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome, Science, 355, 89-92, https://doi.org/10.1126/science.aah5163.
  14. Ballandras-Colas, A., Maskell, D. P., Serrao, E., Locke, J., Swuec, P., Jónsson, S. R., Kotecha, A., Cook, N. J., Pye, V. E., Taylor, I. A., Andrésdóttir, V., Engelman, A. N., Costa, A., and Cherepanov, P. (2017) A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration, Science, 355, 93-95, https://doi.org/10.1126/science.aah7002.
  15. Berthoux, L., Sebastian, S., Muesing, M. A., and Luban, J. (2007) The role of lysine 186 in HIV-1 integrase multimerization, Virology, 364, 227-236, https://doi.org/10.1016/j.virol.2007.02.029.
  16. Knyazhanskaya, E. S., Smolov, M. A., Kondrashina, O. V., and Gottikh, M. B. (2009) Relative comparison of catalytic characteristics of human foamy virus and HIV-1 integrases, Acta Naturae, 1, 78-80, https://doi.org/ 10.32607/20758251-2009-1-2-78-80.
  17. Mazurov, D., Ilinskaya, A., Heidecker, G., Lloyd, P., and Derse, D. (2010) Quantitative comparison of HTLV-1 and HIV-1 cell-to-cell infection with new replication dependent vectors, PLoS Pathog., 6, e1000788, https://doi.org/ 10.1371/journal.ppat.1000788.
  18. Vandergeeten, C., Fromentin, R., Merlini, E., Lawani, M. B., DaFonseca, S., Bakeman, W., McNulty, A., Ramgopal, M., Michael, N., Kim, J. H., Ananworanich, J., and Chomont, N. (2014) Cross-clade ultrasensitive PCR-based assays to measure HIV persistence in large-cohort studies, J. Virol., 88, 12385-12396, https://doi.org/10.1128/jvi.00609-14.
  19. McKee, C. J., Kessl, J. J., Shkriabai, N., Dar, M. J., Engelman, A., and Kvaratskhelia, M. (2008) Dynamic modulation of HIV-1 integrase structure and function by cellular lens epithelium-derived growth factor (LEDGF) protein, J. Biol. Chem., 283, 31802-31812, https://doi.org/10.1074/jbc.M805843200.
  20. Shadrina, O. A., Zatsepin, T. S., Agapkina, Yu. Yu., Isaguliants, M. G., and Gottikh, M. B. (2015) Influence of drug resistance mutations on the activity of HIV-1 subtypes A and B integrases: a comparative study, Acta Naturae, 7, 78-86, https://doi.org/10.32607/20758251-2015-7-1-78-86.
  21. Takahata, T., Takeda, E., Tobiume, M., Tokunaga, K., Yokoyama, M., Huang, Y.-L., Hasegawa, A., Shioda, T., Sato, H., Kannagi, M., and Masuda, T. (2017) Critical contribution of Tyr15 in the HIV-1 integrase (IN) in facilitating IN assembly and nonenzymatic function through the IN precursor form with reverse transcriptase, J. Virol., https:// doi.org/10.1128/jvi.02003-16.
  22. Lu, R., Limón, A., Devroe, E., Silver, P. A., Cherepanov, P., and Engelman, A. (2004) Class II integrase mutants with changes in putative nuclear localization signals are primarily blocked at a postnuclear entry step of human immunodeficiency virus type 1 replication, J. Virol., 78, 12735-12746, https://doi.org/10.1128/jvi.78.23.12735-12746.2004.
  23. Elliott, J. L., and Kutluay, S. B. (2020) Going beyond integration: the emerging role of HIV-1 integrase in virion morphogenesis, Viruses, 12, 1005, https://doi.org/10.3390/v12091005.
  24. Gallay, P., Hope, T., Chin, D., and Trono, D. (1997) HIV-1 infection of nondividing cells through the recognition of integrase by the importin/karyopherin pathway (nuclear import human immunodeficiency virus), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 9825-9830, https://doi.org/10.1073/pnas.94.18.9825.
  25. Tsurutani, N., Kubo, M., Maeda, Y., Ohashi, T., Yamamoto, N., Kannagi, M., and Masuda, T. (2000) Identification of critical amino acid residues in human immunodeficiency virus type 1 IN required for efficient proviral DNA Formation at steps prior to integration in dividing and nondividing cells the multiple effects of in mutations suggest that, J. Virol., 74, 4795-4806, https://doi.org/10.1128/jvi.74.10.4795-4806.2000.
  26. De Houwer, S., Demeulemeester, J., Thys, W., Taltynov, O., Zmajkovicova, K., Christ, F., and Debyser, Z. (2012) Identification of residues in the C-terminal domain of HIV-1 integrase that mediate binding to the transportin-SR2 protein, J. Biol. Chem., 287, 34059-34068, https://doi.org/10.1074/jbc.M112.387944.
  27. Liat Shimoni, H., and Glusker, J. P. (1995) Hydrogen bonding motifs of protein side chains: descriptions of binding of arginine and amide groups, Protein Sci., 4, 65-74, https://doi.org/10.1002/pro.5560040109.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Относительный уровень люминесценции люциферазы светлячка в клетках, трансдуцированных псевдовирусами с ИН дикого типа (ИН_wt) и ее мутантными вариантами: ИН_I182A, ИН_R187A и ИН_K188A. Сигнал люциферазы измеряли через 24 ч после трансдукции, и результаты нормализовали на экспрессию люциферазы псевдовируса с ИН_wt. Представлены средние значения трех независимых экспериментов. Значимость определялась двусторонним дисперсионным анализом с поправкой Шидака на множественные сравнения; ** p < 0,01; *** p < 0,001

Скачать (93KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Относительное количество общей вирусной кДНК (а) и интегрированной вирусной кДНК (б) после трансдукции клеток HEK 293T псевдовирусами с ИН_wt и мутантными белками. Представлены средние значения трех независимых экспериментов. Значимость определялась двусторонним дисперсионным анализом с поправкой Шидака на множественные сравнения; *** p < 0,001; ns – не значимо

Скачать (164KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Электрофоретический анализ каталитической активности ИН_wt и мутантов ИН_I182A, ИН_R187A, ИН_K188A в реакциях 3′-процессинга (а) и переноса цепи (б). а – Дуплекс U5B/U5A без ИН (дорожка 1); в присутствии ИН_wt (дорожки 2, 3); в присутствии ИН_K188A (дорожки 4, 5); в присутствии ИН_I182A (дорожки 6–9); в присутствии ИН_R187А (дорожки 10–13). Реакцию проводили с 5 нМ ДНК-дуплексом и увеличивающимися концентрациями ИН: 100 нМ (дорожки 2, 4, 6, 10); 200 нМ (дорожки 3, 5, 7, 11); 400 нМ (дорожки 8, 12) и 800 нМ (дорожки 9, 13). б – Дуплекс U5B-2/U5A без ИН (дорожка 1); в присутствии ИН_wt (дорожки 2, 3); в присутствии ИН_K182A (дорожки 4, 5); в присутствии ИН_I187A (дорожки 6, 7); присутствии ИН_R188А (дорожки 8, 9). Реакцию проводили с 10 нМ ДНК-дуплексом и концентрациями ИН: 100 нМ (дорожки 2, 4, 6, 8) и 200 нМ (дорожки 3, 5, 7, 9)

Скачать (155KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Влияние аминокислотных замен I182A, R187A и K188A в ИН на эффективность ее связывания с ДНК-субстратом и с TAR-РНК. a – Кривые связывания ИН с ДНК-дуплексом U5B/U5A, полученные методом торможения в геле. 5 нМ ДНК-субстрат инкубировали с ИН в разных концентрациях: 0, 25, 50, 100, 200 и 500 нМ. б – Кривые связывания ИН с TAR-РНК, полученные методом торможения в геле. 5 нМ TAR-РНК инкубировали с ИН в разных концентрациях: 0, 25, 50, 100, 200, 500 нМ

Скачать (184KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Анализ взаимодействия ОТ с ИН дикого типа (ИН_wt) и с заменами I182A, R187A, K188A, содержащими N-концевой GST-таг, методом соосаждения на глутатион-сефарозе. ОT при отсутствии ИН (дорожка 1); ОT в присутствии ИН_wt (дорожка 2); ОT в присутствии ИН_I182A (дорожка 3); ОT в присутствии ИН_R187A (дорожка 4); ОT в присутствии ИН_K188A (дорожка 5). Инкубация ИН и ОТ в концентрации 250 нM проводилась в течение 30 мин при 4 °С

Скачать (76KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Анализ эффективности обмена субъединицами для ИН_wt и с заменами I182A, R187A и K188A. 100 нМ GST-ИН инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с белками, содержащими His6-таг: ИН_wt (дорожки 1, 2), ИН_K182A (дорожки 3, 4), ИН_I187A (дорожки 5, 6), ИН_R188А (дорожки 7, 8). Концентрации белков с His6-тагом: 100 нМ (дорожки 1, 3, 5, 7) и 200 нМ (дорожки 2, 4, 6, 8). Дорожка 9 – контроль без GST-ИН

Скачать (81KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Расположение аминокислот I182, R187 и K188 в структуре ИН (по данным Passos et al. [13] (PDB 5U1C)). а – Структура тетрамера ИН ВИЧ-1. Разными цветами отмечены отдельные субъединицы ИН. б – Прямоугольником выделено и увеличено место расположения аминокислот I182, R187 и K188 (выделены ярко-желтым) каталитического домена одной субъединицы (выделен зеленым) и N-концевого домена другой субъединицы (выделен бирюзовым). в–д – Окружение аминокислот I182, R187 и K188 соответственно

Скачать (587KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024