Биоорганическая химия

В обзоре представлен анализ собственных и литературных данных, касающихся различных аспектов использования эритроцитов в качестве модели in vitro в комплексной оценке антиоксидантной активности широкого спектра природных и синтетических соединений, их смесей и растительных экстрактов. Обсуждены особенности воздействия на эритроцит наиболее часто применяемых в подобных исследованиях инициаторов окислительного стресса – 2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорида (ААРН) и Н₂О₂, механизмы, лежащие в основе развития гемолитического процесса. Дан критический анализ методологических подходов к оценке уровня гемолиза, характеризующего выживаемость эритроцитов в условиях окислительного стресса и позволяющего судить о наличии мембранопротекторной активности у исследуемых соединений. Рассмотрены критерии комплексной оценки состояния эритроцитов, используемые при изучении клеточных и молекулярных механизмов антиоксидантной активности субстанций широкого спектра на модели окислительного гемолиза эритроцитов. К числу традиционных методов относится определение интенсивности процессов перекисного окисления мембранных липидов на основании концентрации продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой, а также оценка относительного содержания окисленных форм гемоглобина в эритроцитах. Перспективный подход – использование современных флуоресцентных методов. В частности, чувствительный маркер окислительного стресса в эритроцитах – флуоресценция продуктов деградации гема, по снижению интенсивности которой можно судить о наличии антиоксидантной активности у исследуемых соединений. Актуальный флуоресцентный метод – оценка уровня окислительного стресса путем измерения внутриклеточной концентрации АФК в эритроцитах. Анализ собственных и литературных данных позволяет рекомендовать метод окислительного гемолиза эритроцитов в скрининге вновь разработанных соединений с целью отбора наиболее интересных кандидатов для дальнейшего углубленного изучения. Его использование целесообразно при установлении зависимости структура–активность и выработке стратегии целенаправленного синтеза новых биологически активных соединений, сочетающих высокую гемосовместимость и антиоксидантную активность, перспективных для биомедицинского применения.

Витамин В₁₂ – жизненно необходимое биологически активное соединение для человека, участвующее в широком круге метаболических процессов. Распространенность дефицита витамина В₁₂ и его низкая проникающая способность в клетки обусловливает актуальность разработки систем доставки для создания лекарственных формуляций с улучшенными биофармацевтическими свойствами. В данной работе представлена краткая характеристика основных химических и биохимических свойств витамина В₁₂, а также обсуждаются пероральные, инъекционные и трансдермальные многокомпонентные лекарственные формы витамина В₁₂, которые направлены на решение данной проблемы. Более того, представлен анализ литературы по перспективам использования витамина В₁₂ в качестве вспомогательного компонента для пассивной и активной доставки других лекарственных молекул, например, пептидно-нуклеиновых кислот и противоопухолевых препаратов. В обзоре подробно рассмотрены типы предлагаемых систем доставки биологически активных соединений с использованием витамина В₁₂ в качестве одного из компонентов.

Предложен новый подход к автоматизированному синтезу N-незамещенных амидофосфатных олигодезоксирибонуклеотидов (P-NH₂), основанный на оптимизированном протоколе твердофазного фосфитамидного синтеза с использованием реакции Штаудингера. Показано быстрое и эффективное окисление модельных P^(III)-содержащих фосфиттриэфиров органическим азидом – (9-флуоренил)-метоксикарбонилазидом (FmocN₃) – до соответствующих фосфамидов –(OPO(OR)(NFmoc))–, где R – остатки нуклеозидной или алкильной природы. Удаление щелочелабильной флуоронильной группы с модифицированного межнуклеозидного звена позволяет получать в цепи олигонуклеотида электронейтральные (при физиологических условиях pH ~ 7) N-незамещенные амидофосфатные остатки (–(OPO(O)(NH₂))– или (P-NH₂)) вместо классических отрицательно заряженных фосфодиэфиров (–(OPO(O)(O¯))–) или (P-O)). При оптимизации синтетического протокола продемонстрировано, что для повышения эффективности синтеза P-NH₂-олигонуклеотидов (до ~80% на модифицированное звено) необходимо включение в протокол автоматического синтеза дополнительной стадии отщепления Fmoc-группы после проведения каждой стадии окисления растущей цепи олигомера по реакции Штаудингера. Показано практически полное отсутствие зависимости выхода P-NH₂-олигонуклеотидов как от локализации P-NH₂-звена в цепи, так и от типа модифицируемого динуклеотидного фрагмента. Получен набор моно- и бис-модифицированных октадезоксирибонуклеотидов и проведено детальное исследование термической стабильности комплементарных ДНК/ДНК-комплексов в различных буферных условиях. Показано, что в условиях высокой ионной силы раствора (1 M NaCl, pH 7.2) введение одного P-NH₂-звена снижает термостабильность комплекса ДНК в среднем на 1.3°С. При уменьшении ионной силы раствора дестабилизирующий эффект P-NH₂-модификации достоверно снижается, что дополнительно подтверждает электронейтральный статус вводимого амидофосфатного звена. Таким образом, нами разработан протокол получения частично модифицированных производных олигонуклеотидов, несущих незаряженные, но изоструктурные к нативным P-O-звеньям амидофосфатные остатки P-NН₂.

Многие регуляторные нейропептиды содержат большое количество остатков пролина. Уникальная конформация пролиновой пептидной связи защищает пептиды от ферментативной деградации, и поэтому особый интерес представляют ферменты, расщепляющие пролильные связи в нейропептидах. Аномальные активности сериновых пептидаз, расщепляющих пептиды по карбоксильной группе остатков пролина, – пролилэндопептидазы (PEP) и дипептидилпептидазы IV (DPP4) – наблюдались у пациентов с тревожными расстройствами. PEP участвует в созревании и деградации нейропептидов и пептидных гормонов, связана с регуляцией кровяного давления, различными расстройствами центральной нервной системы. DPP4 участвует во многих физиологических процессах, в частности в гомеостазе глюкозы при диабете II типа и иммунном ответе. При изучении метаболизма N-ацильного производного ингибитора PEP аминоацил-2-цианопирролидина мы обнаружили снижение активности DPP4 в начальный момент времени. Этот неожиданный эффект наблюдался для ингибиторов общей формулы X-Y-2-S-цианопирролидин, где X – защитная группа, Y – любая аминокислота, отличная от глицина и пролина. Молекулярно-динамическое моделирование комплексов ингибиторов с протеазами показало возможность связывания ингибитора PEP в активном центре DPP4 посредством водородных связей и гидрофобных взаимодействий, допускающего сшивание нитрильной группы с остатком серина в активном центре DPP4. Проведенное исследование открывает перспективу для создания новых фармакологически активных лигандов PEP и DPP4.

Несмотря на достаточно большое количество работ, посвященных поиску механизмов формирования IgE-продуцирующих В-лимфоцитов, вопрос об относительном вкладе В-лимфоцитов герминальных центров и экстрафолликулярных фокусов в этот процесс еще остается дискуссионным. Особенно актуально изучение механизмов стимуляции аллергического иммунного ответа под действием аэрополлютантов. Целью работы было изучить связь адъювантного воздействия аэрополлютанта бензо(а)пирена (BaP) на продукцию специфического IgE в новой низкодозовой модели аллергии с изменением субпопуляционного состава В-лимфоцитов в ткани места иммунизации и вторичных лимфоидных органах. Мышей линии BALB/c иммунизировали интраназально в течение 9 недель низкой (0.3 мкг) дозой антигена овальбумина. Части животных вместе с антигеном вводили BaP в дозе 4 нг. Животных забивали на разные сроки (3 и 9 недель), проводили забор крови и анализировали субпопуляционный состав В-лимфоцитов и плазматических клеток методом проточной цитометрии. BaP достоверно стимулировал продукцию аллерген-специфического IgG₁ на раннем (3 недели) сроке и аллерген-специфического IgE на позднем (9 недель) сроке, а также повышал содержание В-лимфоцитов фенотипа герминальных центров CD19⁺CD38^–CD95⁺B220⁺ и их предшественников CD19⁺CD38⁺CD95⁺B220⁺ в селезенке на раннем и позднем сроках, но не в легких и не в региональных лимфатических узлах. Под действием BaP также повышалось содержание экстрафолликулярных плазмабластов фенотипов CD19⁺CD38^–CD95⁺B220^– и CD19⁺CD38⁺CD95⁺B220⁺ в селезенке на раннем сроке и в ткани легких на позднем сроке. В селезенке BaP повышал содержание CD138⁺CD19^–B220⁺ и CD138⁺CD19^–B220^– зрелых плазматических клеток, а в региональных лимфоузлах – содержание CD138⁺CD19⁺B220^– незрелых плазматических клеток на позднем сроке. Адъювантное действие BaP на продукцию специфического IgE был в большей степени связан со стимуляцией формирования герминальных центров в селезенке и с экстрафолликулярной активацией В-лимфоцитов в ткани легких.

Стабильность и монодисперсность – важные характеристики наночастиц и нанокомпозитов, обеспечивающие надежность их применения в биологических системах и воспроизводимость результатов. Целью данной работы было получение неагломерированных олигонуклеотид-содержащих нанокомпозитов на основе наночастиц диоксида титана в форме анатаза (Ans~ODN). При иммобилизации олигонуклеотидов на наночастицах в воде образуются монодисперсные частицы небольшого размера, в то время как в присутствии NaCl происходит агломерация наночастиц и нанокомпозитов. Сравнение биологической активности нанокомпозитов, полученных в воде и солевом растворе, проведено на примере ингибирования репликации вируса простого герпеса первого типа в культуре клеток VERO. Исследованный нанокомпозит подавлял репликацию вируса на 4.5 порядка независимо от способа приготовления (в воде или в 0.9% NaCl), если он был использован через сутки после получения. Через 10 суток хранения активность образца, приготовленного в солевом растворе, была на два порядка ниже, чем у сохранившего свою активность образца, приготовленного в воде. Таким образом, показано, что в отличие от нанокомпозитов, приготовленных в присутствии соли и теряющих свою эффективность при хранении, нанокомпозиты, не склонные к агломерации, могут быть получены в воде и храниться в течение длительного времени для будущего использования.