The importance of detection of autoantibodies to podocytes in primary podocytopathies

全文:

Первичные подоцитопатии, болезнь минимальных изменений (БМИ) и фокальный сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) – заболевания почек, при которых повреждение подоцитов приводит к нефротическому синдрому (НС) [1, 2]. В большинстве случаев причина подоцитопатий остается неизвестной, для описания таких форм применяют термин «первичные подоцитопатии». Одна из преобладающих гипотез патогенеза первичных подоцитопатий – существование циркулирующих факторов проницаемости, которые повреждают гломерулярный барьер и приводят к массивной протеинурии и НС [3–5]. Если в начале 1990-х годов преобладающей являлась гипотеза о существовании дисфункции Т-клеток с продукцией цитокинов, то в настоящее время все больший интерес вызывает выявление ряда анти-подоцитарных антител и активация В-клеток при этих заболеваниях почек [6, 7]. В частности, аутоантитела к аннексину А2 обнаружены у 17,8% детей с БМИ или ФСГС, антитела к актину и АТФ-синтазе – у 16,7% детей с идиопатическим НС [8, 9]. Также обнаружены антитела к убиквитин-C-терминальной гидролазе L1 и антитела к CD40 у детей и взрослых [10, 11]. В 2022 г. A. Watts и соавт. обнаружили циркулирующие аутоантитела к нефрину у 1/3 детей и взрослых в когорте NEPTUNE [12]. Эти результаты предполагают возможную аутоиммунную природу БМИ и ФСГС. Однако требуется дальнейшая оценка антинефриновых антител как специфических факторов повреждения подоцитов, поскольку их роль показана при БМИ главным образом у детей.

Цель исследования – оценить уровень антител к подоцитам (нефрину и синаптоподину) у взрослых с БМИ и ФСГС, а также оценить значение определения антиподоцитарных антител в диагностике подоцитопатий.

Материалы и методы

В исследование включены 75 пациентов с подоцитопатиями: 34 женщины (45,3%) и 41 мужчина (54,7%) в возрасте от 18 до 75 лет (медиана 43 [30, 5–48] лет). Контрольную группу составили 11 здоровых лиц: 6 (55%) женщин и 5 (45%) мужчин в возрасте от 20 до 51 года (медиана 32 [23–48] лет).

По результатам морфологического исследования ФСГС диагностирован у 38 пациентов, БМИ – у 12, мембранозная нефропатия (МН) с положительными антителами к рецептору фосфолипазы А2 (PLA2R) – у 25 пациентов. Пациенты с МН рассматривались в этом исследовании в качестве группы сравнения. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет), протокол №29-24. Характеристики обследованных пациентов представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Характеристика пациентов Table 1. Patient characteristics
Параметры	ФСГС (n=38)	БМИ (n=12)	МН (n=25)
Возраст, лет	36 [27–56]	36,5 [25, 8–47, 8]	51 [40, 5–66, 8]
Мужчины, абс. (%)	19 (50)	4 (33,3)	18 (72)
Протеинурия, г/сут	4,1 [2, 56–8, 12]	4,47 [3, 36–6, 75]	6,25 [3, 45–7, 46]
Альбумин сыворотки, г/л	24,2 [18, 3–33, 1]	20,7 [19, 1–22, 7]	27,9 [21, 4–31, 0]
Креатинин сыворотки, мкмоль/л	98,0 [80, 3–151]	76,5 [70–95]	108,5 [94, 5–129, 3]
рСКФ, мл/мин/1,73 м2	67,2 [41, 1–96, 3]	95 [69–104, 3]	61,5 [50, 3–76, 0]
Примечание: рСКФ – расчетная скорость клубочковой фильтрации; здесь и далее в табл. 2 представлены медианы и интерквартильный размах [25–75%].

 

Определение антител к нефрину и синаптоподину в сыворотке

Для выявления антител сыворотку получали центрифугированием цельной крови при комнатной температуре в течение 20 мин при 3000 об/мин и замораживали при температуре до -80ºС. После размораживания сыворотки крови непосредственно перед исследованием антитела к нефрину (AEA937Hu, Cloud-Clone Corp., BlueGene, Elabscience Biotechnology, США) и синаптоподину (AEС885Hu, Cloud-Clone Corp., BlueGene, Elabscience Biotechnology, США) определяли с помощью иммуноферментного анализа.

Статистический анализ

Результаты анализировались с использованием методов вариационной статистики из программных пакетов Medcalc Version 22.009 и Jamovi. Были представлены медиана и межквартильный размах (IQR), включая 25 и 75-й процентили. Применялись непараметрические тесты для парных и множественных сравнений (тест Манна–Уитни, дисперсионный анализ Краскела–Уоллиса с поправкой Дуасса–Стила–Крихлоу–Флингера для парных сравнений). Для выявления и оценки взаимосвязей между изучаемыми показателями использовался непараметрический метод ранговой корреляции Спирмена. Различия считались значимыми при p<0,05.

Результаты

Антитела к нефрину в сыворотке крови

У пациентов с подоцитопатиями уровень антител к нефрину достоверно выше, чем у здоровых лиц: 15,3 [12–18, 9] нг/мл. У пациентов с БМИ и ФСГС уровень антител достоверно выше, чем у пациентов с МН: 20,3 [14, 4–38, 4] нг/мл. У пациентов с БМИ и ФСГС уровни антител к нефрину в сыворотке крови достоверно не различались (табл. 2).

 

Таблица 2. Уровень антител к нефрину и синаптоподину в сыворотке крови обследованных больных подоцитопатиями и здоровых лиц Table 2. The serum level of antibodies to nephrin and synaptopodin in examined patients with podocytopathies and healthy individuals
Антитела, нг/мл	БМИ	ФСГС	МН	Контроль
К нефрину	49,5 [27, 5–61, 5]	53,8 [21, 9–68, 4]	20,3 [11, 4–37, 8]	15,3 [13, 2–18, 9]
К синаптоподину	17,8 [13, 3–50, 0]	19,5 [7, 9–27, 9]	6,6 [4, 9–12, 2]	3,9 [2, 9–7, 6]

 

Антитела к синаптоподину в сыворотке крови

Уровни антител к синаптоподину в сыворотке были также выше у пациентов с БМИ и ФСГС по сравнению с МН и здоровыми контрольными лицами (см. табл. 2). При рассмотрении верхней границы референтного интервала для лиц без заболеваний почек следует отметить, что у всех пациентов с БМИ результаты тестов на антитела к синаптоподину оказались положительными.

Информативность антител в диагностике подоцитопатий

Положительные антитела к нефрину (превышающие максимальный показатель антител в группе здоровых лиц) обнаружены у 11 (91,7%) из 12 пациентов с БМИ, у 26 (68,4%) из 38 пациентов с ФСГС (ФСГС vs БМИ, p>0,05), у 10 (40%) из 25 пациентов с МН (ФСГС vs МН, p<0,05). Не обнаружено достоверной статистической разницы между уровнями антител к нефрину при БМИ и ФСГС (p=0,524). У 3 пациентов с aPLA2R-позитивной МН также обнаружены высокие уровни антител к нефрину (77,4, 93,1, 140 нг/мл). Повышение уровня антител к синаптоподину отмечено у 11 (92%) больных БМИ, у 27 (71%) больных ФСГС и у 1 (4%) пациента с МН.

По данным ROC-анализа, уровень антител к нефрину в сыворотке более 41,6 нг/мл обладал высокой специфичностью 80% для диагностики подоцитопатий (БМИ или ФСГС), но низкой чувствительностью – 56,1%, PPV – 76,67%, NPV – 60,87%, индекс Юдена – 0,361, AUC 0,711 (95% доверительный интервал – ДИ 0,643–0,783); рис. 1, а. Пороговое значение для антител к синаптоподину составило 10,2 нг/мл, чувствительность – 78,12%, специфичность – 90,48%, PPV – 92,6%, NPV – 73,1%, индекс Юдена – 0,686, AUC 0,827 (95% ДИ 0,741–0,879); рис. 1, b.

 

Рис. 1. ROC-анализ и площадь под кривой (AUC) при определение антител к нефрину (а), синаптоподину (b) и нефрину и синаптоподину (с) у больных подоцитопатиями.

Fig. 1. ROC analysis and area under the curve (AUC) for the assay of antibodies to nephrin (a), synaptopodin (b), and nephrin and synaptopodin (c) in patients with podocytopathies.

 

Использование модели, которая включала в оценку оба антитела, позволило увеличить показатели диагностической точности: при увеличении в сыворотке крови обоих антител чувствительность составила 85,7%, специфичность – 90,48%, AUC – 0,935 (95% ДИ 0,856–0,984); рис. 1, с.

Обсуждение

В данной работе мы изучили уровень антител к нефрину и синаптоподину в сыворотке крови взрослых пациентов с БМИ, ФСГС в сравнении с пациентами с МН и здоровыми лицами и обнаружили достоверное повышение уровня антител в сыворотке крови пациентов с первичными подоцитопатиями (БМИ и ФСГС).

В последние годы обсуждается аутоиммунный патогенез подоцитопатий – БМИ и ФСГС на основании данных об обнаружении ряда антиподоцитарных антител при этих заболеваниях и эффективности ритуксимаба [13–15]. Некоторые исследования выявляют иной спектр антител у детей с идиопатическим НС [8, 9]. Антитела могут быть направлены на различные антигенные структуры подоцитов, включая нефрин [4]. Нефрин – это трансмембранный белок 180 кДа, экспрессируемый в подоцитах клубочков и формирующий щелевую диафрагму [16]. Синаптоподин – богатый пролином белок, связанный с актиновыми микрофиламентами, обнаруженными в ножках подоцитов. Предыдущие исследования показали, что более высокая экспрессия синаптоподина в подоцитах коррелирует со значительно лучшим ответом на стероидную терапию [17].

В начале 2000-го года появились первые публикации о роли антител к нефрину в экспериментальных моделях с массивной протеинурией, например о существовании антител к нефрину в сыворотке экспериментальной мышиной модели [18]. В 2022 г. A. Watts и соавт. опубликовали исследование о наличии аутоантител к нефрину у 29% детей и взрослых с БМИ из когорты NEPTUNE [12]. Это исследование позволило предположить вероятную аутоиммунную природу БМИ и рассматривать антитела к нефрину как вероятные «факторы проницаемости». В нашем исследовании большинство (91%) пациентов с БМИ и 69% пациентов с ФСГС имели повышенные уровни антител к нефрину в сыворотке крови. Однако мы также наблюдали значительное повышение уровней антител к синаптоподину в этой же когорте больных. Интересно и то, что 40% пациентов с аPLA2R-позитивной МН также имели повышение антител к нефрину. Причиной этого повышения может быть перекрестная реактивность к различным антигенам подоцитов или наличие двух заболеваний у одного пациента.

Заключение

По нашим данным, определение антител к нефрину или только синаптоподину недостаточно информативно в качестве чувствительного диагностического теста. Тем не менее, оценивая увеличение антител к нефрину и синаптоподину, мы можем повысить диагностическую точность метода – чувствительности до 85,7% и специфичности до 90,48% с AUC 0,935 (95% ДИ 0,856–0,984) для диагностики подоцитопатий (БМИ и ФСГС по сравнению с МН).

Таким образом, антитела к нефрину определялись у взрослых пациентов с подоцитопатиями, в частности уровни антител к нефрину и синаптоподину были достоверно выше при БМИ и ФСГС, чем при МН и у здоровых лиц. Повышенные уровни обоих видов антител (к нефрину и синаптоподину) продемонстрировали высокую чувствительность и специфичность для диагностики БМИ или ФСГС, что позволяет обсуждать целесообразность разработки панелей антиподоцитарных антител для более точной диагностики подоцитопатий.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Все авторы в равной степени участвовали в подготовке публикации: разработка концепции статьи, получение и анализ фактических данных, написание и редактирование текста статьи, проверка и утверждение текста статьи. Е.А. Харионовская – исследование, формальный анализ, написание – первоначальный вариант; Н.В. Чеботарева – концептуализация, написание – первоначальный вариант; Е.А. Бирюкова – исследование; И.И. Алентов – исследование; Н.С. Сергеева – исследование, рецензирование и редактирование; С.В. Моисеев – рецензирование и редактирование.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. E.A. Kharionovskaya – research, writing – initial version; N.V. Chebotareva – conceptualization, writing – initial version; E.A. Biryukova – research; I.I. Alentov – research; N.S. Sergeeva – research, review and editing; S.V. Moiseev – research, review and editing.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the exploration and analysis work.

Соответствие принципам этики. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет), протокол №29-24. Одобрение и процедуру проведения протокола получали по принципам Хельсинкской декларации.

Compliance with the principles of ethics. The study protocol was approved by the local ethics committee of Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Minutes No. 29-24. Approval and protocol procedure was obtained according to the principles of the Declaration of Helsinki.

Информированное согласие на публикацию. Пациенты подписали форму добровольного информированного согласия на публикацию медицинской информации.

Consent for publication. Written consent was obtained from the patients for publication of relevant medical information and all of accompanying images within the manuscript.

Список сокращений

БМИ – болезнь минимальных изменений

ДИ – доверительный интервал

МН – мембранозная нефропатия

НС – нефротический синдром

ФСГС – фокальный сегментарный гломерулосклероз

作者简介

Evgenia Kharionovskaya

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: natasha_tcheb@mail.ru
ORCID iD: 0009-0008-8777-5007

аспирант каф. внутренних, профессиональных болезней и ревматологии Института клинической медицины

俄罗斯联邦, Moscow

Natalia Chebotareva

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); Shumakov National Medical Research Center of Transplantology and Artificial Organs

编辑信件的主要联系方式.
Email: natasha_tcheb@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2128-8560

д-р мед. наук, проф. каф. внутренних, профессиональных болезней и ревматологии Института клинической медицины ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет)

俄罗斯联邦, Moscow; Moscow

Evgenia Biryukova

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: natasha_tcheb@mail.ru
ORCID iD: 0009-0005-8284-3136

студентка Клинического института детского здоровья 

俄罗斯联邦, Moscow

Igor Alentov

National Medical Research Radiological Centre

Email: natasha_tcheb@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5920-5823

Hertsen Moscow Oncology Research Institute 

俄罗斯联邦, Moscow

Natalia Sergeeva

National Medical Research Radiological Centre

Email: natasha_tcheb@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7406-9973

Hertsen Moscow Oncology Research Institute 

俄罗斯联邦, Moscow

Sergey Moiseev

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: natasha_tcheb@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7232-4640

чл.-кор. РАН, д-р мед. наук, проф., зав. каф. внутренних, профессиональных болезней и ревматологии Института клинической медицины

俄罗斯联邦, Moscow

参考

补充文件