Methanobrevibacter smithii in irritable bowel syndrome: a clinical and molecular study

全文:

КОЕ - колониеобразующие единицы СИБР - синдром избыточного бактериального роста СРК - cиндром раздраженного кишечника ПЦР - полимеразная цепная реакция Введение Синдром раздраженного кишечника (СРК) - функциональное заболевание с высокой распространенностью (около 11%) среди населения в основном экономически развитых стран [1, 2]. Функциональные заболевания отличает отсутствие отклонений в течении метаболических процессов и структурных аномалий, которые способны объяснить формирование симптомов. Определяющими симптомами СРК являются наличие абдоминальной боли и нарушений дефекации, которые могут усиливаться при эмоциональном стрессе [3]. Нарушениями дефекации могут быть как диарея, так и запор; также выделяют подгруппу пациентов с СРК, у которых периодически запоры могут сменяться диареей. Диарея может сопровождаться ургентными позывами на дефекацию и недержанием стула, а пациенты с запорами часто предъявляют жалобы на вздутие живота, натуживание и чувство неполного опорожнения кишечника. Большая часть пациентов с СРК демонстрируют гиперчувствительность при растяжении ректосигмоидной части толстой кишки, и этот феномен гиперчувствительности может распространяться на другие отделы пищеварительного тракта (например, пищевод) [3]. По данным литературы, ведущую роль в появлении симптомов СРК играют нарушения двигательной активности кишечника, формирование феномена висцеральной гиперчувствительности, наличие психологического дистресса, сопровождающиеся нарушением баланса нейротрансмиттеров и развитием минимального воспаления (инфекционного или неинфекционного генеза) в слизистой оболочке кишечника [4-6]. Полагают, что причиной таких воспалительных изменений слизистой оболочки кишки может являться разрешившаяся кишечная инфекция у лиц, имеющих относительный дефицит противовоспалительных цитокинов, либо аномальная реакция иммунных механизмов на наличие нормальной флоры, их реакция на количественные или качественные ее изменения [7]. Так, изменение состава кишечной микрофлоры, первичное или вторичное, относительно нормального соотношения гнилостных и бродильных микроорганизмов может привести к уменьшению деконъюгации желчных кислот и увеличению газообразования [8], что может оказаться патогенетически значимым при возникновении СРК. Доказано, что метан - побочный продукт жизнедеятельности измененной флоры кишки - способен замедлять кишечный транзит в связи с увеличением тонуса кишечной стенки [9]. И хотя данные о роли в патогенезе СРК синдрома избыточного бактериального роста (СИБР) в тонкой кишке довольно противоречивы [10], теоретически, восполнение флоры кишки дефицитными видами или устранение избыточных штаммов способно восстановить кишечный гомеостаз. СИБР в тонкой кишке выявляется у 69-84% больных СРК [11]. К настоящему времени дилемма о том, приводит ли СРК к СИРБ, или же СИБР вызывает симптомы СРК, остается нерешенной. Конкретными патофизиологическими звеньями в случае функциональных заболеваний могут служить нарушения транзита содержимого по кишке, изменения кишечной проницаемости, избыточное высвобождение провоспалительных цитокинов и транслокация эндотоксинов и липополисахаридов в кровоток [12]. «Золотым стандартом» диагностики СИБР принято считать культуральное исследование аспирата тонкой кишки. Если в норме содержание бактерий в грамме кишечного содержимого не превышает 103 колониеобразующих единиц (КОЕ), то диагностическим порогом СИБР принято считать уровень обсеменения >105 КОЕ [11]. Однако эта методика имеет серьезные ограничения: если учитывать, что миграция бактерий толстой кишки происходит от дистальной части к проксимальной, то ранние формы СИБР этим методом не будут диагностированы; также следует принимать во внимание, что значительная часть бактерий кишечника не способны давать рост на искусственных питательных средах и эти микроорганизмы останутся неучтенными. Водородный дыхательный тест с лактулозой - наиболее распространенный в клинической практике метод определения СИРБ. Растворенная в воде порция лактулозы при прохождении по тонкой кишке метаболизируется бактериями с выделением водорода, метана и т. д. Эти газы из просвета кишки всасываются в кровь, попадают в легкие, где смешиваются с выдыхаемым воздухом и могут быть количественно оценены анализатором прибора. Концентрация водорода >20 ppm в течение первых 120 мин теста считается диагностически значимой для диагностики СИБР. Однако этот тест может дать ложноотрицательный результат в случае, когда доминирующая флора выделяет не водород, а метан. Для расширения возможностей метода в клинической практике появились приборы, позволяющие регистрировать количество как водорода, так и метана в выдыхаемом воздухе. Наиболее типичным представителем метаногенов в микрофлоре человека является Methanobrevibacter smithii, причем 10% прокариот в кишечнике человека принадлежит к этому виду [13]. Выявление когорты пациентов с избыточным ростом метаногенной флоры важно ввиду того, что продукция метана ассоциирована с изменением тонуса нижнего пищеводного сфинктера [14], увеличением времени транзита содержимого по кишке, увеличением рН просвета кишки [15] и таким образом может влиять на выраженность имеющихся у пациента симптомов. Цель нашего исследования - оценить роль M. smithii в формировании симптомов заболевания у пациентов с СРК и наличием СИБР метаногенной флоры. Материалы и методы Исследование выполнено на базе клиники ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии». Для проведения исследования отобрано 67 человек с СРК согласно Римским критериям 4-го пересмотра. Для контроля использована группа добровольцев (n=32) без нарушения стула и наличия абдоминальной боли/дискомфорта. Всеми участниками исследования подписано информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования утвержден этическим комитетом ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» 20 марта 2018 г. Водородно-метановый тест с лактулозой проводился в утренние часы после 12-часового голода, в ужин накануне исследования исключался прием кисломолочных напитков, блюд из макарон, злаков, картофеля и кондитерских изделий. После получения исходных значений содержания газов в выдыхаемом воздухе пациенты выпивали 15 мл лактулозы, растворенной в 100 мл воды, после чего в течение 2 ч анализировался газовый состав выдыхаемого воздуха с интервалом 20 мин. Анализ газового состава осуществлялся аппаратом GastroCheckGastrolyser (Bedford, Великобритания). Избыточный рост метаногенной флоры диагностировался при превышении в выдыхаемом воздухе уровня метана в 12 ppm, водородпродуцирующей флоры - при превышении уровня содержания водорода 20 ppm. Во время пребывания в клинике пациенты ежедневно регистрировали свои жалобы в специально разработанной анкете, где, согласно 5-балльной шкале Лайкерта динамики симптомов заболевания (наличие и выраженность абдоминальной боли, метеоризма, изжоги, тошноты, чувства тяжести после еды, неполного опорожнения кишечника), отмечали свои ощущения на протяжении всей госпитализации. Для оценки динамики показателей стула использовалась Бристольская шкала стула, которая заполнялась пациентом после каждого опорожнения кишки по специальной форме с отметкой о качестве опорожнения в течение всего срока проведения исследования. Кал на исследование наличия M. smithii отобран у больных в основном в процессе обследования (89,3%), у 10,7% - при поступлении пациента в клинику. Идентификация M. smithii в содержимом кишечника проводилась следующим способом: кал отбирали в стерильные контейнеры непосредственно после дефекации, замораживали при температуре минус 20 °С. Экстракцию ДНК из образцов кала проводили с использованием набора реагентов: «АмплиСенс ДНК-сорб-С» (ФГБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции изготовителя. Размер отбираемой пробы кала для экстракции был постоянным и составлял 0,1 г. Экстракты хранили при температуре минус 20 °С. Реакционная смесь (25 мкл) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) включала в себя 5 мкл готовой смеси для ПЦР «qPCRmix-HS LowROX» («Евроген», Россия), по 1,0 мкл прямого и обратного праймера (разведенных до концентрации 10 пкМ/мкл), 0,4 мкл флюоресцентно меченного зонда (разведенного до концентрации 10 пкМ/мкл), 16,6 мкл NF - воды и 1 мкл ДНК пробы. Проведение ПЦР в режиме реального времени, амплификацию и детекцию осуществляли с использованием амплификатора «7500/7500 FastReal-Time PCR System» (AppliedBiosystems, США). Программа амплификации включала в себя денатурацию при 95 °С в течение 5 мин, 40 циклов амплификации (денатурация при 95 °С - 20 с, отжиг праймеров при 64 °С - 30 с и элонгация при 72 °С - 20 с). Флюоресценция регистрировалась в каждом цикле амплификации на стадии отжига праймеров (64 °С). Значения пороговых циклов (Ct) рассчитывались автоматически программным обеспечением амплификатора. Для проведения исследования отобраны олигонуклеотидные праймеры Mnif202f и Mnif 353r [16], специфичные к виду M. smithii, который является наиболее широко распространенным видом метаногенных архей в составе микробиоты кишечника человека. Также использован флюоресцентно меченный зонд «TaqMan», для разработки которого использованы ДНК M. smithii DSM 861 (ATCC 35061), M. smithii DSM 2374, полученные из немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур «DSMZ» (табл. 1). Для статистической компьютерной обработки данных использовался пакет программ SPSS 13.0 for Windows (SPSS Inc., СШA). С его помощью проводилась оценка показателей выборки методами дескриптивной статистики, данные представлены в виде средних значений и стандартного отклонения, для сравнения результатов между группами использован метод Манна-Уитни. Оценка корреляций представлена коэффициентом корреляции Пирсона. Достоверность результатов устанавливалась при значениях p=0,05. Результаты В рамках исследования методом водородно-метанового дыхательного теста с лактулозой обследовано 67 пациентов с СРК с подозрением на наличие СИБР (12 мужчин и 55 женщин) в возрасте от 23 до 85 лет (средний возраст - 51 год). По результатам теста у 31 пациента выявлен избыточный рост водородпродуцирующей флоры (Н2), у 32 - метаногенной флоры (СН4), у трех человек признаков избыточного роста бактерий не выявлено. Группы пациентов не имели существенных различий по возрасту, индексу массы тела, половому составу. Молекулярным методом наличие M. smithii подтверждено у всех 32 пациентов, продемонстрировавших наличие метана в выдыхаемом воздухе на уровне 12 ppm и выше. Выраженность имеющихся симптомов у пациентов по группам представлена на табл. 2. Как можно видеть из табл. 2, выраженность жалоб в группах СИБР имеет сопоставимую интенсивность, в группе контроля выраженность абдоминальной боли, вздутия живота и чувства неполного опорожнения достоверно ниже. У пациентов с СИБР СН4 при сопоставлении выраженности жалоб с содержанием метана в выдыхаемом воздухе установлена слабая положительная корреляционная связь по отношению к интенсивности чувства тяжести в эпигастрии и неполного опорожнения кишечника (табл. 3). Обсуждение Имеющаяся доказательная база свидетельствует в пользу того, что механизмы развития СРК соответствуют представлениям о роли оси «микробиота - кишка - мозг», которая связывает двунаправленными связями центральную нервную систему, собственную нервную систему кишечника, воспаление, иммунные реакции, количественные и качественные показатели кишечной микрофлоры [17, 18]. В нашем исследовании СИБР выявлен у 94% пациентов с СРК, что сопоставимо с опубликованными результатами ведущих исследователей по этой проблеме [11]. В настоящее время в подавляющем большинстве случаев клинической практики тест на выявление СИБР осуществляется с использованием водородного дыхательного теста с лактулозой, и в случае отрицательного результата диагноз СИБР снимается. Данные нашей работы демонстрируют высокую встречаемость СИБР СН4, который обладает сопоставимой с СИБР Н2 выраженностью основных жалоб, который не будет выявлен стандартным водородным дыхательным тестом. Археи считаются комменсалами, т. е. существуют совместно с другим организмом, не принося ему ни пользы, ни вреда, однако выявление когорты пациентов с избыточным ростом метаногенной флоры важно ввиду того, что продукция метана четко ассоциирована с изменением тонуса нижнего пищеводного сфинктера [14], увеличением времени транзита содержимого по кишке, увеличением рН просвета кишки [15] и таким образом может влиять на выраженность имеющихся у пациента симптомов, и выявленная связь интенсивности тяжести в эпигастрии и чувства неполного опорожнения кишечника с уровнем метана в выдохе может быть обусловлена доказанным влиянием метана на скорость кишечного транзита. Устранение СИБР СН4 может способствовать снижению выраженности клинических проявлений у больных СРК. Исследователи считают, что современная западная диета способствует колонизации толстой кишки M. smithii, но продукция метана и его концентрация в выдыхаемом воздухе могут варьировать 10-кратно: около трети взрослой популяции западных стран ежесуточно выделяют с дыханием от 40 мл до 4 л метана [19]. M. smithii хорошо адаптирована к условиям внутрикишечной среды человека: структура поверхностных гликанов клеточной стенки имеет сходство с гликанами кишечной слизистой оболочки, способна потреблять продукты ферментации сахаролитической флоры, эффективно конкурировать за азотистые соединения, может расти в присутствии желчных кислот [20]. M. smithii окрашиваются по Граму, но существенно отличаются от бактерий в структуре клеточной стенки и мембран, что проявляется устойчивостью к основным антибактериальным препаратам [20], поэтому наличие СИБР СН4 требует особых подходов к терапии. В ранее опубликованной работе мы демонстрировали значимые различия паттерна питания пациентов с СИБР Н2, СИБР СН4 и здоровых лиц [21], которые могут быть использованы для формирования диетологических рекомендаций и режимов лечебного питания в рамках комплексной терапии СИБР. Ограничением данного исследования является относительно небольшая выборка пациентов, выполнивших водородно-метановый дыхательный тест с лактулозой, при увеличении числа наблюдений можно выявить большую значимость выявленных корреляционных связей. Заключение Таким образом, СИБР CH4 наблюдается почти у половины пациентов с СРК, ассоциированным с СИБР; выраженность основных жалоб у них сопоставима с таковыми у пациентов с СИБР Н2, при этом выраженность тяжести в эпигастрии и чувство неполного опорожнения кишечника прямо пропорциональны продукции метана. Учитывая полученные данные, всех пациентов с СРК следует обследовать на наличие не только СИБР Н2, но и СИБР СН4. Данное исследование выполнено в рамках научной темы №0529-2016-0034 «Изучение взаимосвязей между основными группами и популяциями микробиома толстой кишки у людей, больных СРК и ожирением, и возможностей их регуляции различными алиментарными факторами».

作者简介

A Vlasova

Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety

Email: alinliliya@gmail.com
Moscow, Russia

V Isakov

Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety

Moscow, Russia

V Pilipenko

Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety

Moscow, Russia

S Sheveleva

Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety

Moscow, Russia

Yu Markova

Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety

Moscow, Russia

A Polyanina

Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety

Moscow, Russia

I Maev

Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Moscow, Russia

参考

补充文件