Impact of current approaches to laboratory screening of donated blood and its components on hepatitis B virus infection in patients with blood system diseases

Full Text

анти-HBc — суммарные антитела к ядерному антигену вируса гепатита В aнти-HBc-IgM — иммуноглобулины класса М к ядерному антигену вируса гепатита В анти-HBe — антитела к е-антигену вируса гепатита В анти-НВs — антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения ГНЦ — Гематологический научный центр ЛПЗ — лимфопролиферативные заболевания МДС — миелодиспластический синдром ОЛ — острый лейкоз ПЦР — полимеразная цепная реакция ХМЛ — хронический миелолейкоз HBsAg — поверхностный антиген вируса гепатита В HBeAg — е-антиген вируса гепатита В HBV — вирусгепатитаВ NAT — Nucleic amplification techniques Больные с заболеваниями системы крови относятся к группе высокого риска заражения вирусными инфекциями с парентеральным механизмом передачи, в частности вирусным гепатитом В (HBV). В работе Т.Ц. Гармаевой [1] показано, что частота обнаружения положительных тестов на маркеры HBV у больных при госпитализации в гематологическое отделение составляла 16,6%, это в 2 раза и более выше, чем в популяции. По данным исследования, выполненного с 2004 по 2006 г., ведущим фактором инфицирования HBV больных гемобластозами и депрессиями кроветворения являлись гемотрансфузии [2]. Инфекционная безопасность гемокомпонентной терапии зависит, в частности, от качества лабораторного тестирования донорской крови [3]. Наиболее диагностически значимым маркером HBV является поверхностный антиген — HBsAg. Существенно повышает возможность выявления потенциально инфицированных доз крови применение генамплификационных методов диагностики — Nucleic amplification techniques (NAT) [4]. С 1997 г. дополнительно к тестированию на HBsAg в план обязательного обследования донорской крови многих стран начали вводить полимеразную цепную реакцию (ПЦР) как один из самых простых и удобных форматов NAT-анализа: в 1997 г. в Германии, в 1999 г. Японии, в 1998—2000 гг. США, Канаде, Австралии, в 2004 г. Испании, в 2007 г. Швейцарии, Тайланде и др. [5—7]. Определение у доноров ДНК HBV с 1999 г. стало обязательным в странах Евросоюза, а с 2005 г. рекомендовано Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) [8]. Высокая аналитическая чувствительность ПЦР позволяет тестировать как индивидуальный образец, так и несколько образцов крови (от 6 до 24), объединенных в один мини-пул [9]. В государствах, где NAT-скрининг донорской крови является сложившейся практикой, вирусная безопасность гемотрансфузий достигла высокого уровня [10, 11]. После введения тестирования крови доноров на вирусные нуклеиновые кислоты остаточный риск инфицирования HBV снизился в США с 1 на 830 тыс. до 1 на 2 млн, в Швейцарии с 1 на 95 тыс. до 1 на 296 тыс., в Австралии с 1 на 483 тыс. до 1 на 1 млн донаций [12, 13]. В то же время в развивающихся странах Африканского континента этот показатель остается высоким — 1 на 19 608 донаций [13]. По данным отечественных авторов, остаточный риск инфицирования HBV в Российской Федерации составляет 1 на 19 637 донаций [14]. Лабораторная диагностика инфекции HBV у доноров крови в Российской Федерации осуществляется в соответствии с приказом № 364 от 14.09.2001 г. «Об утверждении Порядка медицинского обследования донора крови и ее компонентов». Декретированным маркером при скрининговых исследованиях сывороток крови доноров является HBsAg и с 2008 г. введено обязательное исследование NAT-методом на наличие ДНК HBV в мини-пулах образцов HBsAg-негативной плазмы для фракционирования [15]. Однако исключение HВsAg-позитивных доз крови не дает полной гарантии вирусной безопасности в отношении HBV. Анализ данных литературы указывает на недостаточность тестирования только на этот маркер для обеспечения безопасности компонентов донорской крови, поскольку в этом случае остаются не выявленными пять категорий лиц: в ранней фазе инфекции HBV (фаза «серонегативного окна»); в ранней фазе выздоровления (фаза «core-окна»); хронические носители HBV с низким титром HBsAg (более того, чувствительность метода может снижаться в присутствии aнти-HBs); с латентной инфекцией HBV (наличие ДНК HBV в ткани печени в отсутствие HBsAg, в крови обнаруживаются только «изолированные» анти-HBc); носители мутантного штамма HBV (который может возникать как естественным путем, так и после противовирусной терапии) [16—18]. Несмотря на высокую чувствительность и 100% специфичность ПЦР, анализ современных данных литературы позволяет заключить, что NAT-тестирование на ДНК HBV и ИФА-тестирование на HBsAg не обеспечивают в полной мере вирусную безопасность гемокомпонентов [18, 19]. Риск инфицирования HBV реципиента сохраняется. Для повышения безопасности необходимо выявление и других маркеров HBV. Наличие в крови любого из них, кроме изолированных aнти-HBs, указывает на инфицированность этим вирусом. Выявление aнти-HBs может свидетельствовать о ранее проведенной вакцинации. В последние годы активно обсуждается понятие скрытого вирусного гепатита В, при котором, по данным литературы, анти-НВs может являться единственным маркером HBV в крови в 35% случаев [20]. Для выявления инфицированных лиц и реконвалесцентов инфекции HBV может служить тестирование на антитела к ядерному антигену HBV (core-антигену) — aнти-НВс, так как эти антитела сохраняются в крови практически на протяжении всей жизни [16, 21]. Исследование донорской крови на этот маркер HBV применяют в США и в некоторых европейских странах (Германия, Франция) для дополнительного отбора доноров [22—24]. Однако нет рекомендаций ВОЗ для проведения тестирования на aнти-HBc в повседневной практике учреждений, заготавливающих донорскую кровь. Необходимость применения этого теста обусловлена распространенностью HBV в конкретном регионе и частотой новых случаев HBV-инфекции [25]. Некоторые исследователи считают, что положительный результат на aнти-HBc в отсутствие других маркеров HBV может быть следствием неспецифической реакции [26], поэтому для решения вопроса об использовании aнти-HBc-положительных доз крови в клинической практике проводят дополнительно тестирование на уровень анти-HBs. В настоящее время в качестве минимального протективного уровня этих антител у пациентов определена концентрация равная 10 мМЕ/мл [25]. Для доноров крови ситуация отличается. В Великобритании aнти-HBc-положительные дозы крови с титром aнти-HBs более 100 мМЕ/мл считают безопасными для клинического и производственного применения, а в Японии и Голландии, странах с умеренным и низким уровнем распространенности инфекции HBV, для тех же целей используют aнти-HBc-положительные дозы с титром aнти-HBs равным или превышающим 200 мМЕ/мл [27—29]. Цель работы — оценить частоту выявления маркеров HBV в образцах крови больных с заболеваниями системы крови с использованием современных подходов к обследованию доноров крови и ее компонентов на маркеры вирусных инфекций. Материалы и методы Пациенты. В исследование включили образцы крови 364 пациентов, проходивших лечение в клиниках ФГБУ «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации (далее ГНЦ) в период с июля 2013 г. по октябрь 2014 г. Продолжительность 15 мес. Характеристика пациентов приведена в табл. 1. Таблица 1. Характеристика пациентов, включенных в исследование Примечание. ОЛ — острые лейкозы, ЛПЗ — лимфопролиферативные заболевания, МДС — миелодиспластический синдром, АА — апластическая анемия, прочие заболевания — болезнь Гоше, неуточненное накопление липидов, ИБС и др., ХМЛ — хронический миелолейкоз. Образцы крови тестировали на молекулярные (ДНК) и серологические (HBsAg, HBeAg, анти-НВс, анти-HBc-IgM, анти-HBe) маркеры HBV. Исследование проводили при госпитализации и во время проведения плановой терапии по клиническим показаниям. Доноры крови и ее компонентов. Проанализированы результаты лабораторного скрининга образцов крови доноров (n=13081) отделения заготовки крови и ее компонентов ГНЦ в период с января 2012 г. по декабрь 2013 г. (2 года). Результаты тестирования на HBsAg получены с помощью наборов реагентов HBsAg-ИФА-БЕСТ (комплект № 1) производства ООО «Вектор-Бест». На ДНК HBV дополнительно исследованы HBsAg-отрицательные образцы донорской крови (4736 из 13 047, или 36,3%) с использованием мультиплексной тест-системы Cobas Taqscreen MPX Test в мини-пулах из 6 образцов. В проспективное исследование, проведенное с марта 2014 г. по август 2014 г. (5 мес), включили 5011 образцов крови доноров. Все образцы донорской крови тестировали на HBsAg и суммарные анти-HBc. Негативные по HBsAg образцы анализировали на наличие ДНК HBV. Положительные по анти-HBc образцы исследовали на наличие анти-HBc-IgM и уровень aнти-HBs. Методы. В качестве клинического материала исследовали периферическую кровь. Для молекулярного анализа кровь отбирали в стерильную пластиковую пробирку с напылением калиевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, для серологического исследования — в стерильную пластиковую пробирку с активатором свертывания крови. Молекулярный скрининг крови больных проводили в формате индивидуальных образцов. Для выделения ДНК HBV из 100 мкл плазмы больных использовали коммерческие наборы ДНК-сорб-В или Рибо-преп («ИнтерЛабСервис», Россия). Для амплификации ДНК HBV использовали наборы АмплиСенс HBV-FL» и АмплиСенс HBV-монитор-FL («ИнтерЛабСервис», Россия). Молекулярный скрининг крови доноров проводили с помощью автоматических анализаторов Cobas Ampliprep и Cobas Taqman («Roche», Швейцария) с использованием мультиплексной тест-системы Cobas Taqscreen MPX Test в мини-пулах из 6 образцов. cерологические маркеры HBV (HBsAg, HBeAg, aнти-HBs, анти-HBc, анти-HBc-IgM, анти-HBe) определяли методом иммунохемилюминесцентного анализа на аппарате Architect с использованием соответствующих тест-систем Architect («Abbott», США) и методом иммуноферментного анализа, используя коммерческие тест-системы отечественных и зарубежных производителей: «ВекторБест» (Россия), «ЭКОлаб» (Россия), «BioRad» (США). Для статистических расчетов критериев Пирсона (χ2) или точного критерия Фишера использовали пакет программ EPI5 версии 5.0. Статистически значимыми считали различия при р=0,05. Результаты Получен следующий состав маркеров HBV у 364 обследованных пациентов: анти-НВs — 195 (53,6%), анти-НВс — 114 (31,3%), анти-HBe — 63 (17,3%), ДНК HBV — 30 (8,2%), HBsAg — 26 (7,1%), анти-HBc-IgM — 23 (6,3%), HBeAg — 4 (1,1%). В некоторых образцах одновременно выявлялись 2 маркера HBV и более (табл. 2). Таблица 2. Состав маркеров HBV в образцах крови пациентов В 46 (12,6%) пробах зарегистрированы маркеры активной инфекции HBV — ДНК HBV, HBsAg, анти-HBc-IgM, HBeAg, но ни один из них не встречался изолированно: в 6 образцах определена ДНК HBV и анти-НВс, в 2 из них с анти-HBs; в двух — HBsAg и анти-НВс, причем в 1 — с анти-HBs. HBeAg наблюдали в сочетании с HBsAg, ДНК HBV, анти-НВс. В одном образце из четырех HBeAg-положительных антитела отсутствовали, что является лабораторным признаком первичного острого процесса. Анти-HBc-IgM в 5 (1,4%) из 23 случаев были единственным свидетельством активной инфекции, в 9 (2,5%) — в присутствии анти-НВs. У 114 (31,3%) из 364 пациентов обнаружены анти-HBc, причем в 27 (7,4%) образцах крови выявлены только анти-НВс, в 42 (11,5%) — в комбинации с анти-НВs. Изолированные анти-НВе у пациентов не отмечены. У 137 (37,6%) пациентов выявлены только анти-НВs. Для анализа сформированы 3 группы: 1-я — пациенты с наличием маркеров HBV в крови, 2-я — пациенты, у которых выявлены изолированные анти-HBs, 3-я — пациенты, в образцах крови которых отсутствовали лабораторные маркеры HBV (табл. 3). Таблица 3. Распределение пациентов по нозологическим формам в группах, сформированных в зависимости от наличия маркеров HBV Доли этих групп оказались сопоставимы (31,6, 37,6 и 30,8%; р>0,05) и между группами пациентов распределение по нозологическим формам не имело статистически значимых различий (р>0,05). Проанализирована трансфузионная терапия в каждой группе пациентов (табл. 4). Таблица 4. Трансфузионное обеспечение пациентов в группах, сформированных в зависимости от наличия маркеров HBV Из представленных данных следует, что пациенты всех 3 групп получали терапию компонентами донорской крови, причем их доли статистически значимо различались (р=0,001; χ2=13,33): около 60% в группе пациентов, в образцах крови которых выявлены любые маркеры HBV, в то время как в 3-й группе (в отсутствие маркеров HBV в крови) — менее 40%. Среднее количество трансфузий в 1-й и 2-й группах пациентов было одинаковым (19,0 и 19,8), а в 3-й — меньше (17,7). Доля лиц с высокой трансфузионной нагрузкой в 1-й группе составила 23,1%, а в 3-й — 9,3% (р=0,021; χ2=7,72). При анализе результатов лабораторного скрининга образцов крови доноров в период с января 2012 по декабрь 2013 г. выявлено 34 (0,26%) из 13 081 с наличием HBsAg. При дополнительном тестировании 36,3% образцов крови HBsAg-негативных доноров на наличие ДНК HBV методом ПЦР в наборах из 6 проб обнаружены 2 позитивных образца с низкой вирусной нагрузкой (<150 МЕ/мл). В проспективном исследовании, включающем тестирование донорской крови на наличие HBsAg, ДНК HBV и анти-НВс, в 4,83% (242 из 5011) образцов выявлены маркеры HBV (табл. 5). Таблица 5. Состав маркеров HBV в образцах крови доноров Декретированный маркер (HBsAg) выявлен в 2 из 5 образцов изолировано, в 3 — в сочетании с другими маркерами: aнти-HBc; ДНК HBV и aнти-HBc; aнти-HBc и aнти-HBc-IgM. Вирусная ДНК обнаружена в 2 (0,04%) случаях, причем в одном из них в сочетании с HBsAg и aнти-HBc, а в другом — только с анти-НВс. Анти-HBc определялся у 240 (4,79%) из 5011, в 22 случаях выявлены aнти-HBc-IgM. В анти-HBc-положительных образцах крови доноров исследовали титр aнти-HBs. Полученные результаты представлены в табл. 6. Таблица 6. Концентрация анти-HBs в анти-НBc-положительных образцах крови 240 доноров Анти-НВs в титре >200 мМЕ/мл выявлены в 124 (51,6%) из 240. Анти-HBc-IgM детектировали в 13 (10,5%) из 124 случаев при титре анти-НВs >200 мМЕ/мл, в 5 (11,1%) из 45 — с титром aнти-HBs <10 мМЕ/мл. Обсуждение Маркеры активной инфекции HBV у больных с заболеваниями системы крови зарегистрированы в 12,6% случаев. В предыдущей работе показано, что этот показатель в образцах крови аналогичной выборки пациентов составлял 19,9%, и это значительно превышает результаты, полученные в данном исследовании (р=0,02) [30]. У 31,3% пациентов были обнаружены анти-HBc, указывающие на инфицированность HBV. Эти антитела могут выявляться при хронической, латентной инфекции HBV или в фазе выздоровления и не могут быть следствием вакцинации. Анти-НВе обнаруживали всегда в комплексе с другими маркерами. Вероятно, для диагностики инфицированности HBV не представляют особого значения, а скорее важны для прогноза течения вирусного гепатита. Сероконверсия НВеAg является благоприятным признаком спонтанного излечения или успешной противовирусной терапии [31]. У 37,6% пациентов выявлены изолированные анти-НВs. Эти антитела могут быть свидетельством как вакцинации, так и скрытого гепатита В, поэтому вопрос о наличии инфекции HBV у таких пациентов в отсутствие данных о вакцинации остается открытым. С учетом того, что с 2001 г. проводили вакцинацию подростков 13 лет согласно новому календарю профилактических прививок, лица моложе 27 лет на момент проведения исследования могли быть вакцинированы, и эта группа составила 44 (12,1%) человека из 364, медиана возраста 21,7 года. Пациентов (n=93, или 25,5%) в возрасте от 27 до 73 лет (медиана 42,7 года) можно условно считать переболевшими вирусным гепатитом В или, согласно данным литературы, скрыто инфицированными HBV [20]. При сравнении частоты выявления изолированных анти-НВs (37,6%) в образцах крови больных с заболеваниями системы крови с результатами, полученными ранее (19,4%), отмечены статистически значимые различия (р<0,05) [30]. Это можно объяснить долей в данной группе, вероятно, вакцинированных пациентов (12,1%), поскольку при исключении этих лиц из анализа и сравнении распространенности изолированных анти-НВs в старшей возрастной группе (25,5%) результаты оказались сопоставимыми (р>0,05). Трансфузионный путь инфицирования HBV считается основным [2, 32], поэтому проанализирована трансфузионная терапия в каждой группе пациентов. Пациенты всех 3 групп получали терапию компонентами донорской крови. Согласно данным литературы, более 20 переливаний компонентов крови одному реципиенту расценивали как высокую трансфузионную нагрузку [33]. Доля лиц с высокой трансфузионной нагрузкой в 1-й группе более чем в 2 раза больше доли таких пациентов в 3-й группе (р=0,021; χ2=7,72). Данный факт подтверждает сложившееся мнение о ведущей роли трансфузионного фактора в передаче HBV. Высокая распространенность маркеров HBV в образцах крови пациентов с заболеваниями системы крови сохраняется в течение многих лет, что показано в проведенном исследовании (31,6%) и в предыдущих работах (37,2%) [30]. По данным литературы, маркеры HBV при использовании современных тест-систем могут быть определены в период от 15 дней до 6 мес в крови инфицированных лиц без патологии иммунной системы [34]. У пациентов с заболеваниями системы крови ослаблен иммунологический контроль, что может приводить к более позднему формированию иммунного ответа или его полному отсутствию. В исследовании выявлены 27 пациентов (период наблюдения от 1 мес до 4 лет 9 мес), у которых антитела к HBsAg выявлялись транзиторно. Поэтому с целью прослеживания возможной трансфузионной передачи HBV реципиентам с гематологическим анамнезом целесообразно увеличить временно́й интервал анализа данных обследования образцов крови доноров до 1,5 года. В связи с этим анализировали результаты лабораторного скрининга образцов крови доноров в период с января 2012 г. по декабрь 2013 г. У 36 (0,28%) из 13 081 доноров зафиксированы маркеры активной инфекции HBV, и эти компоненты крови не переливались пациентам ГНЦ. Доноры крови в этот период не обследованы на анти-НВс, наличие которых в образце крови может быть единственным маркером хронической инфекции HBV с низкой репликативной активностью вируса, так называемого скрытого гепатита В [22]. Инициировано проспективное исследование, включающее тестирование донорской крови не только на HBsAg и ДНК HBV, но и на наличие анти-НВс. В 4,83% образцов выявлены маркеры HBV. У доноров крови и ее компонентов aнти-HBc явился наиболее часто выявляемым маркером HBV, как и у пациентов ГНЦ (31,3%), и определялся в 4,79% случаев. В 21 случае маркерами активной инфекции HBV служили только aнти-HBc-IgM, что могло свидетельствовать о наличии процесса в скрытой форме, поскольку, согласно данным литературы, антитела к ядерному антигену HBV могут служить единственным признаком субклинической формы гепатита В [31]. В некоторых странах допускается применение aнти-HBc-положительных компонентов крови при наличии определенного уровня анти-HBs. Учитывая данные литературы, мы оценили распределение образцов крови анти-HBc-положительных доноров по 4 уровням концентрации aнти-HBs: отрицательные (<10 мМЕ/мл), 10—100 мМЕ/мл, 101—200 мМЕ/мл, >200 мМЕ/мл [25, 27—29]. Почти в 50% образцов крови доноров выявлены анти-НВs в титре >200 мМЕ/мл. При этом в 10,5% случаев в этих образцах выявлены и анти-HBc-IgM. Практически идентичная доля (11,1%) анти-HBc-IgM выявлена в образцах с титром aнти-HBs <10 мМЕ/мл. Следовательно, наличие защитного титра анти-HBs не может гарантировать потенциальную вирусную безопасность компонентов крови. Заключение В результате проведенного серологического и молекулярного скрининга маркеры HBV выявлены у 115 (31,6%) из 364 пациентов ГНЦ. В предыдущих работах показано, что частота обнаружения маркеров инфекции HBV в образцах крови аналогичной выборки пациентов составляла 37,2%. Следовательно, этот показатель за последние 5—7 лет не претерпел статистически значимых изменений и сохраняется на высоком уровне. У 1/3 пациентов отмечены изолированные анти-НВs, которые могут быть как свидетельством вакцинации, так и скрытого гепатита В (37,6%). При мониторинге серологических маркеров HBV у пациентов с заболеваниями системы крови в 27 (19,7%) из 137 случаев наблюдали транзиторную детекцию анти-НВs. Нельзя исключить вероятность наличия инфекции HBV и в 3-й группе, поскольку при скрытой форме гепатита маркеры HBV в крови могут отсутствовать. Одной из причин высокого уровня встречаемости маркеров HBV у пациентов гематологического стационара является то, что скрининг на декретированные маркеры, независимо от качества тест-систем и оборудования для лабораторной диагностики, не позволяет выявлять скрыто инфицированных лиц среди доноров. Результаты исследования подтверждают это. Установлено, что частота обнаружения маркеров HBV у доноров крови составила 4,83%, причем в 0,54% случаев выявлены маркеры активной инфекции. Основным маркером HBV у доноров крови служил анти-НВс (4,79%). Маркеры активной инфекции HBV с одинаковой частотой встречались как в aнти-HBs-негативных образцах (11,1%), так в образцах крови доноров с высоким титром антител (10,5%), что может указывать на потенциальный риск трансфузионной передачи HBV реципиенту даже при высокой концентрации защитных антител в крови донора. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

E N Ignatova

T A Tupoleva

E N Ovchinnikova

T Yu Romanova

N G Yaroslavtseva

F P Filatov

V V Troitskaya

L A Kuzmina

E N Parovichnikova

T V Gaponova

V G Savchenko

References

Supplementary files