Overexpression of DNA-methyltransferases in persistency of cccDNA pool in chronic hepatitis B

全文:

ВГВ — вирусный гепатит В ДНМТ — ДНК-метилтрансфераза ккзДНК — кольцевая ковалентно замкнутая ДНК ПЦР — полимеразная цепная реакция ХГВ — хронический гепатит В кчдДНК — кольцевая частично двухцепочечная ДНК HBV — вирус гепатита В pgRNA — прегеномная РНК Вирус гепатита В (HBV) является высоко контагиозным вирусом, способным инфицировать человека и вызывать острый или хронический гепатит В (ХГВ). Случаи заражения вирусным гепатитом В (ВГВ) отмечаются по всему миру, с наибольшей распространенностью в странах Среднего и Ближнего Востока, Азии, странах Карибского Бассейна, Африки и Южной Америки. По данным ВОЗ, ежегодно регистрируются 350 млн новых случаев заражения ВГВ и около 1 млн человек ежегодно умирают от его последствий, цирроза печени или гепатоцеллюлярной карциномы [1]. В Российской Федерации, как и в странах Западной Европы, США, Канаде, Австралии, мероприятия по вакцинации против HBV значительно снизили заболеваемость острым гепатитом В, однако ежегодно в нашей стране регистрируется более 40 тыс. новых случаев хронической инфекции HBV, основной причины цирроза и рака печени (гепатоцеллюлярной карциномы), причем 90% заболевших ВГВ — молодое трудоспособное население. Распространенность ВГВ в Российской Федерации составляет 2% от общего населения страны, т. е. около 3 млн человек. Заболеваемость ВГВ — одна из самых серьезных проблем Российского здравоохранения [2]. Главная причина перехода ВГВ в хроническую форму заключается в активности особой стабильной формы ДНК вируса — кольцевой ковалентно замкнутой ДНК (ккзДНК), которая, годами персистируя в гепатоцитах человека, вызывает их гибель или злокачественную трансформацию. Число копий ккзДНК в ядре клетки колеблется от 2 до 50, при этом молекулы ккзДНК не способны к репликации по полуконсервативному механизму, и каждая молекула ккзДНК образуется только из соответствующего предшественника — кольцевой частично двухцепочечной ДНК (кчдДНК). Главная сложность в эрадикации HBV при ХГВ — это стабильность молекулы ккзДНК и ее внутриядерная локализация [3]. В отличие от всех прочих короткоживущих транскриптов HBV и репликативных интермедиатов (двухцепочечной линейной и кольцевой чдДНК) ккзДНК в покоящихся гепатоцитах может находиться в течение длительного времени, недосягаемая для действия любых современных противовирусных средств даже в ходе продолжительных (от нескольких лет до десятилетий) курсов терапии [4]. Данные по наличию ккзДНК HBV у пациентов с ХГВ in vivo демонстрируют, что число копий ккзДНК коррелирует со статусом HBeAg и вирусной активностью. Большое число копий ккзДНК (1—40 на 1 клетку) определяется у позитивных по HBeAg пациентов на фоне высоких уровней общей внутриклеточной ДНК HBV (95—9,890 копии на 1 клетку) и ДНК HBV в сыворотке крови (107—109 копий/мл). При этом средние уровни ккзДНК примерно в 10 раз ниже у негативных по HBeAg пациентов [5, 6]. Уровни внутрипеченочной ккзДНК варьируют в широких пределах (0,003—6,8 копии на 1 клетку) в зависимости от активности заболевания, репликации и генетических особенностей вируса и объясняются значительной гетерогенностью данной группы пациентов. Тем не менее число копий ккзДНК оказывается меньше 0,1 копии на клетку у негативных по HBeAg пациентов с низкой виремией [7]. Кроме того, более чем на 84% отмечено уменьшение числа копий ккзДНК у пациентов, находящихся на длительном (48 нед) лечении аналогами нуклеоз (т)идов [8]. Методом математического моделирования с использованием данных по ккзДНК от пациентов, находящихся на длительном лечении аналогами нуклеоз (т)ов, показано, что на полную элиминацию ккзДНК у пациентов с ХГВ может потребоваться до 14,5 года [9]. Таким образом, высокая персистенция ккзДНК — основной барьер на пути элиминации HBV и излечения от ХГВ. Персистенцию HBV традиционно объясняют персистенцией ккзДНК. Она существует в ядре гепатоцитов в виде мини-хромосомы, транскрибирует все типы вирусных РНК, включая прегеномную РНК (pgRNA), и может регулироваться эпигенетически, в том числе с помощью метилирования ДНК [10—13]. Недавно показано, что метилирование ДНК HBV играет роль в регуляции транскрипционной активности ккзДНК. Три принципиальных локуса генома HBV (островки CpG) могут метилироваться под действием ДНК-метилтрансфераз (ДНМТ) клетки [14, 15]. Метилированные матрицы ДНК HBV выявляется в сыворотке крови и биоптатах печени пациентов с ХГВ [16]. Кроме того, в гепатоцитах таких пациентов по сравнению со здоровыми людьми уровни экспрессии ДНМТ (ДНМТ1, ДНМТ3А, ДНМТ3В) повышены [17]. Полагают, что экспрессия ДНМТ клеткой может быть частью неспецифического внутриклеточного анти-HBV-ответа, призванного снизить транскрипцию вируса [13]. Экспериментальные методы лечения ХГВ, нацеленные на расщепление матриц ккзДНК, т. е. на устранение основной причины заболевания, не в состоянии полностью элиминировать ккзДНК. Среди наиболее перспективных стоит перечислить системы нуклеаз CRISPR/Cas, TALENs и активацию ферментов APOBECs. К причинам их неэффективности относят разнородность ккзДНК, т. е. подразумевается существование транзиторных (транскрипционно-активных) и стабильных (высокоперсистентных) форм ккзДНК. Последние резистентны к любого рода воздействиям [18—21]. Следует отметить, что у негативных по HBeAg пациентов уровни метилирования ккзДНК выше, а репликативная активность значительно ниже, чем у позитивных по HBeAg [22]. Предположительно оставшиеся, немногочисленные, метилированные матрицы ккзДНК у негативных по HBeAg пациентов могут относиться к высокоперсистентной популяции, представляющей наибольшую трудность для элиминации. Понимание механизмов образования популяций ккзДНК и их особенностей необходимо для создания подходов к полной элиминации HBV и излечения ХГВ. Более того, использование подходов по эпигенетическому ремоделированию матриц ккзДНК может стать одним из методов комплексной терапии, направленной на полное выздоровление пациентов с ХГВ. В данной работе мы использовали модель трансфекции клеток гепатомы человека HepG2 с активным циклом HBV и векторами, экспрессирующими ДНМТ 1-го и 3А типов, для изучения их влияния на показатели цикла HBV, особенно на количество ккзДНК. Материалы и методы Культура клеток и трансфекция. Клетки HepG2 с трансгеном 1.1-merHBV под индуцибельным промотором tet-on культивировали в среде DMEM high glucose (4,5 г/л глюкозы) («Thermo Fisher Scientific», США), 1% L-глутамина, 1% пен/стреп, 10% фетальной бычьей сыворотки, в 6-луночных планшетах. Трансфекцию плазмид pcDNA3/Myc-DNMT3A (предоставлена доктором Arthur Riggs (Addgene plasmid # 35521) и pcDNA3/Myc-DNMT1 (предоставлена доктором Arthur Riggs (Addgene plasmid # 36939) или ко-трансфекция обеими плазмидами проводили с помощью агента Lipofetamine 2000 («Sigma», США) по протоколу производителя за сутки до активации доксициклином по стандартному протоколу. Активация доксициклином цикла HBV продолжалась 24 ч. Первые сутки эксперимента — момент времени после изъятия доксициклина, 3-и сутки — 48 ч после изъятия доксициклина. Выделение нуклеиновых кислот, обратная транскрипция, полимеразная цепная реакция (ПЦР). Нуклеиновые кислоты выделяли с помощью набора АмплиСенс «РИБО-преп», затем использовали для трех видов обработки: 1) обработка ДНКазой 1-го типа без РНКазной активности («Sigma»), повторное выделение с помощью набора АмплиСенс «РИБО-преп», обратная транскрипция при помощи набора АмплиСенс «Реверта L-100» и выявление с помощью ПЦР в реальном времени S-RNA и pgRNA с помощью специфических праймеров и зондов TaqMan, нормализация на мРНК GAPDH; 2) обработка ферментом Plasmid-safe ATP-dependent DNase, выявление ккзДНК с помощью специфических праймеров и зондов TaqMan, нормализация на β-глобин генома; 3) количественное определение ДНК HBV с помощью набора АмплиСенс «HBV-monitor-FRT», нормализация на число клеток. Статистическая обработка данных. Результаты представлены как средние ± стандартное отклонение трипликатов экспериментов. Использовали однофакторный дисперсионный анализ односторонний ANOVA, статистическую значимость различий определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа, попарное апостериорное сравнение проводили с помощью критерия HSD Тьюки. Различия при p<0,05 считали статистически значимыми. Обработку данных проводили в программе SPSS 18.0. Результаты Трансфекция ДНМТ1, ДНМТ3А и ДНМТ1/ДНМТ3А ингибирует репликацию ДНК HBV и экспрессию S-RNA к 3-м суткам исследования. Важно отметить, что в 1-е сутки продукция ДНК HBV и транскрипция вирусного генома практически не изменяется. К 3-м суткам исследования общее число копий ДНК HBV относительно контроля снижается примерно на 40% во всех группах после трансфекции ДНМТ, но это снижение не достигает статистической значимости в однофакторном дисперсионном анализе (рис. 1). Рис. 1. Изменение уровней общей ДНК HBV (копии), нормализованные на число клеток (ед.), относительно контроля в 1-е (а) и 3-и (б) сутки после активации цикла HBV в клетках HepG2. Здесь и на рис. 2—4: планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям ДНМТ1_1д/3д, ДНМТ3А_1д/3д, ДНМТ1/3_1д/3д — трансфекция клеток плазмидами, кодирующими ДНМТ1, ДНМТ3А или котрансфекция ДНМТ1 и ДНМТ3А соответственно. Наиболее значительные изменения происходят с S-RNA, экспрессия которой снижается на 40—50% (р<0,01 для ДНМТ1, р<0,005 для ДНМТ3А и ДНМТ1/3А) (рис. 2). Рис. 2. Уровни относительной экспрессии S-RNA: экспрессия S-RNA относительно GAPDH в группах трансфекции на 1-е (а) и 3-и (б) сутки. * — р<0,01; ** — р<0,005. Однако при трансфекции ДНМТ1 уровни pgRNA не меняются столь существенно, а при трансфекции ДНМТ3А демонстрирует высокую вариабельность в результатах (рис. 3). Рис. 3. Изменение относительной экспрессии pgRNA: уровни экспрессии pgRNA относительно GAPDH. Котрансфекция ДНМТ1 и ДНМТ3А снижает уровни детектируемой pgRNA примерно на 25%, но это изменение статистически незначимо. Следовательно, гиперэкспрессия ДНМТ1, ДНМТ3А и ДНМТ1/3А ингибирует транскрипцию и репликацию HBV. Количество ккзДНК не изменяется при трансфекции ДНМТ1 (рис. 4). Рис. 4. Изменение уровней ккзДНК: уровни ккзДНК, нормализованные на относительное количество выявляемого при ПЦР β-глобина генома. * — р<0,005. Однако в группе котрансфекции в клетках с активированным циклом HBV незначительно снижено количество ккзДНК в 1-е сутки исследования. На 3-и сутки в группе котрансфекции количество ккзДНК не отличается от контроля. Наиболее существенно, что гиперэкспрессия ДНМТ3А приводит к значительному увеличению количества ккзДНК. Клетки HepG2 с активированным циклом HBV, которые были трансфицированы векторами, экспрессирующимися ДНМТ3А, демонстрируют увеличение количества ккзДНК в 1-е сутки почти в 2,5 раза. Уровень ккзДНК остается увеличенным почти в 2 раза (р<0,005) на 3-и сутки эксперимента. Результаты наших и других исследований показали, что экспрессия ДНМТ1 и ДНМТ3А значительно увеличена в клетках, экспрессирующих HBV [23]. Считается, что инфицированные клетки могут метилировать ккзДНК HBV в ходе неспецифического внутриклеточного иммунного ответа, приводя к снижению репликации, транскрипции и продукции белков вируса. Пролонгированная активация ДНМТ при ХГВ вызывает гиперметилирование CpG-островков в геноме HBV [15]. Кроме того, гиперметилирование ккзДНК посредством ДНМТ может быть частью многоэтапного пути конверсии ккзДНК в высокоперсистентную форму. Аналогичный процесс установлен для некоторых других латентных вирусов, в том числе вируса Эпштейна—Барр [24]. Обсуждение В соответствии с ранее опубликованными данными трансфекция клеток HepG2 матрицами HBV и векторами, экспрессирующими ДНМТ3А, приводит к снижению продукции вирусных белков и pgRNA [13]. Результаты данной работы значительно расширяют представление о влиянии гиперэкспрессии ДНМТ на ккзДНК. Мы показали, что трансфекция ДНМТ1 и ДНМТ3А не только подавляет экспрессию S-RNA, но также снижает репликацию ДНК HBV и вместе с этим трансфекция ДНМТ3А значительно увеличивает количество ккзДНК. Стоит отметить, что гиперэкспрессия ДНМТ1 не изменяет количество ккзДНК. Ранее высказано предположение, что метилирование островков CpG ккзДНК является одним из механизмов, ответственных за персистенцию HBV. Мы полагаем, что длительная гиперэкспрессия ДНМТ3А может играть роль в генерации персистентной ккзДНК и влиять на переход ВГВ в хроническую форму. Кроме того, изменение статуса метилирования матриц ккзДНК может быть необходимым для полной элиминации матриц ккзДНК и полного излечения от ХГВ при использовании экспериментальных методов лечения, таких как системы нуклеаз CRISPR/Cas, TALENs, или при модуляции ферментов APOBEC. Заключение ДНМТ3А регулирует количество ккзДНК и является важным фактором персистенции HBV. Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ № 16−15−10426. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

作者简介

D Kostyushev

A Zueva

S Brezgin

A Lipatnikov

V Simirskii

D Glebe

E Volchkova

G Shipulin

V Chulanov

参考

补充文件