URINARY EXCRETION OF PROFIBROTIC AND ANTIFIBROTIC GROWTH FACTORS IN TYPE 1 DIABETIC PATIENTS: THE RELATION WITH DIABETIC NEPHROPATHY

Full Text

Хроническая болезнь почек — одна из основных причин смерти больных сахарным диабетом (СД) [1]. В основе снижения функции почек при СД ле- жит прогрессирующий фиброз клубочков (ФК) и интерстициальной ткани. Главным инициирующим фактором в развитии фиброза почек при СД является гипергликемия. Ее эффект реализуется через активацию синтеза фиброгенных факторов роста (ФР), в числе которых трансформирующий ß1-фактор роста (Тß1-ФР), a-фактор некроза опухоли (a-ФНО) и фактор роста фибробластов 2-го типа (ФРФ2). Данные факторы участвуют в развитии диабетической не- Таблица 1 Характеристика групп больных СД 1-го типа с разными стадиями ДН Показатель Группа больных 1-я (n = 25) 2-я (n = 30) 3-я (n = 9) Возраст, годы 27 (20; 32) 31,5 (25; 39) 35 (23; 45) Длительность СД, годы 3(1; 6) 9,5 (6; 15) 17 (11; 21)* Доза инсулина, ЕД/кг/сут 0,6 (0,46; 0,79) 0,66 (0,5; 0,78) 0,62 (0,45; 0,8) ньа, , % 1с’ 9,1 (8,5; 10,4) 9,5 (8,1; 11,4) 10,9 (9,6; 12,1) Креатинин крови, мкмоль/л 82 (75; 93) 81 (74; 89) 123 (119; 130)* СКФ, мл/мин/1,73 м2 107,1 (81,8; 124,5) 112,4 (91,1; 128,7) 72,0 (59,2; 86,5)* Примечание. * — достоверные (р < 0,05) различия с 1-й и 2-й группами больных. Здесь и в табл. 2 данные представлены в виде медианы (25-й; 75-й процентили). фропатии (ДН), изменяя обмен коллагена и других компонентов внеклеточного матрикса, пролиферацию и дифференцировку почечных клеток [2—5]. В последние годы идентифицированы ФР, оказывающие антифиброгенное действие в почках. К их числу отнесены фактор роста гепатоцитов (ФРГ) и костный морфогенетический протеин 7—го типа (КМП7). В экспериментах показано, что снижение синтеза этих факторов может способствовать развитию ДН [3, 6—9]. Изменение баланса между фиброгенными и антифиброгенными ФР у больных с ДН не изучено. Цель исследования — изучить взаимосвязь между экскрецией с мочой фиброгенных и антифиброгенных ФР, альбуминурией и ФК у больных СД 1-го типа. Материалы и методы Обследовали 64 больных СД 1-го типа (32 мужчины и 32 женщины, возраст от 16 до 50 лет, медиана 29 лет) с длительностью заболевания от 1 мес до 43 лет (медиана 7 лет). Большинство (n = 53) больных обследованы в состоянии декомпенсации углеводного обмена. В исследование не включали больных с кетоацидозом, патологией почек недиабетической природы, хронической болезнью почек IV—V стадии, инфекцией мочевыводящих путей, с обострением сопутствующих заболеваний. В зависимости от величины экскреции альбумина с мочой (ЭАМ) больные были распределены на 3 группы: с нормальной альбуминурией (25 пациентов, 1-я группа), с микроальбуминурией — МАУ (30 человек, 2-я группа), с макроальбуминурией (9 больных, 3-я группа). Клинико-лабораторная характеристика групп приведена в табл. 1. Пациенты с макроальбуминурией ожидаемо отличались от других групп больных большей длительностью СД, более высоким уровнем креатинина и меньшей скоростью клубочковой фильтрации (СКФ). У 3 пациентов с макроальбуминурией выявлен нефротический синдром, у 6 — снижение СКФ менее 60 мл/мин/1,73 м2. Содержание ФР исследовали в утренней порции мочи методом иммуноферментного анализа с использованием планше-точного ридера BioRad 680 ("BioRad", США) и программного обеспечения "Zemfira". Для определения ТР1-ФР использовали наборы "Bender Medsystems GmbH" (Австрия), α-ФНО — "Вектор-Бест" (Россия), ФРФ2 — "RD Systems" (США), ФРГ — "Invitrogen" (США), КМП7 — "RayBiotech" (США). В качестве маркера ФК определяли содержание коллагена IV типа в утренней моче с помощью наборов фирмы "Argutus Medical Ltd" (Ирландия). Результаты приводили к величине экскретиру-емого креатинина и сравнивали со значениями в контрольной группе, состоявшей из 10 здоровых лиц (3 мужчины, 7 женщин в возрасте от 21 года до 50 лет, без отягощенной наследственности по СД). У 21 пациента (7 с нормальной ЭАМ, 14 с МАУ) проведено морфологическое исследование биоптатов почек. Пункци-онную нефробиопсию выполняли по клиническим показаниям для определения характера и выраженности поражения почек при наличии МАУ и/или факторов риска развития ДН (диабетическая ретинопатия, артериальная гипертония, длительность СД более 15 лет). Выраженность изменений в биоптатах оценивали с помощью световой и электронной микроскопии. Для оценки ФК, помимо общепринятых исследований, выполняли иммуногистохимическое типирование депозитов коллагена IV типа с помощью моноклональных антител фирмы "Novocastra Laboratories Ltd" (Великобритания). Проведение исследования одобрено локальным Комитетом по этике. Пациенты давали письменное информированное согласие на участие в исследовании. Статистическая обработка данных проведена с использованием пакета "Statistica 6.0". Учитывая, что распределение большинства изученных признаков было отличным от нормального, применяли методы непараметрической статистики. Межгруппо-вые различия оценивали с помощью критерия Манна—Уитни и ANOVA Краскела—Уоллиса. Взаимосвязь признаков изучали с помощью рангового корреляционного анализа Спирмена, многофакторного регрессионного пошагового анализа. Для выполнения регрессионного анализа проводили логарифмирование значений признаков с распределением, отличным от нормального. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05. Данные представлены как медианы, 25-й и 75-й процентили. Результаты Содержание фиброгенных ФР в моче увеличивалось с ростом ЭАМ (табл. 2). У пациентов с МАУ зафиксировано достоверное повышение экскреции Тß1-ФР и α-ФНО по сравнению с контролем (р = Таблица 2 Экскреция с мочой ФР и коллагена IV типа у больных СД 1-го типа с разными стадиями ДН Показатель Контроль(я = 10) Группа больных 1-я (n = 25) 2-я (n = 30) 3-я (n = 9) ТР1-ФР, нг/мкмоль 23,3 (13,3; 36,1) 31,4 (21,6; 47,6) 41,8 (28,3; 68,3)* 64,8 (44,1; 97,8)** а-ФНО, пг/мкмоль 0,64 (0,54; 1,12) 0,84 (0,56; 1,33) 1,50 (0,98; 2,12)** 3,33 (0,90; 3,65)* ФРФ2, пг/мкмоль 6,1 (3,3; 8,6) 4,7 (3,2; 6,9) 7,9 (4,3; 20,1) 13,1 (10,0; 22,3)** ФРГ, пг/мкмоль 22,7 (7,6; 31,2) 29,7 (16,4; 43,2) 34,8 (19,2; 55,0) 55,1 (42,5; 84,2) КМП7, пг/мкмоль 0,75 (0,42; 0,98) 0,40 (0,24; 0,94) 0,82 (0,38; 1,25) 0,98 (0,51; 1,82) Коллаген IV типа, нг/мкмоль 2,9 (2,2; 4,3) 3,6 (3,1; 5,3) 5,1 (2,8; 7,8)* 15,2 (9,6; 17,0)*** Примечание. Различия показателей достоверны (р < 0,05); * — с контролем, ** — с контролем и 1-й группой больных, *** — с контролем, 1-й и 2-й группами. — 38 — Экскреция с мочой фиброгенных и антифиброгенных факторов роста у больных сахарным диабетом 1-го типа 100-, 80 со X S X S 60 CO. Q. ÜL * Э ^ 40 н о І 20 3 - 2 - 0 1 © 25-, 20- 15с\Г Ю - I © 5 А В Мочевая экскреция фиброгенных факторов роста у больных СД 1-го типа в отсутствие (1) и при наличии (2) фиброза клубочков. Экскреция Tβj-ФР выражена в нг/мкмоль креатинина, экскреция α-ФНО и ФРФ2 — в пг/мкмоль. Представлены медианы, 25-е и 75-е процентили. 0,01). Значительное увеличение экскреции всех фиброгенных факторов обнаружено у больных с макроальбуминурией: медиана экскреции Tβ1-OP в данной группе превышала контроль в 2,8 раза (р = 0,004), α-ФНО — в 5,2 раза (р = 0,04), ФРФ2 — в 2,1 раза (р = 0,003). Напротив, для экскреции антифиброгенных ФР (см. табл. 2) четкая взаимосвязь с развитием ДН не выявлена. Прослеживалась лишь тенденция к увеличению экскреции ФРГ в группе больных СД с макроальбуминурией по сравнению с контролем. Уровень экскреции КМП7 достоверно не различался у больных с разной выраженностью нефропатии (%2 = 0,46; р = 0,5). Содержание коллагена IV типа в моче (см. табл. 2) имело тенденцию к повышению у пациентов с нормальной ЭАМ (р = 0,14). У больных с МАУ медиана экскреции коллагена превышала контроль в 1,8 раза (р = 0,04), у больных с макроальбуминурией — в 5,2 раза (р = 0,0008). При ранговом корреляционном анализе выявлена положительная взаимосвязь между экскрецией с мочой коллагена IV типа и фиброгенных ФР: Tβ1^P (r = 0,34; p = 0,004), α-ФНО (r = 0,37; p = 0,04), ФРФ2 (r = 0,31; p = 0,01). При морфологическом исследовании почек во всех случаях подтвержден диагноз ДН. Признаки формирующегося ФК обнаружены у 8 больных с МАУ. Экскреция с мочой фиброгенных ФР в этой подгруппе больных оказалась достоверно выше, чем у пациентов без признаков ФК (см. рисунок). При ранговом корреляционном анализе выявлены прямые корреляции между уровнем гликозилирован-ного гемоглобина A (HbA1c) и экскрецией Тß1-ФP (r = 0,33;р = 0,01), ФРФ2 (г = 0,27;р = 0,04). В моделях многофакторного анализа уровень НЬА1с оказывал прямое влияние на содержание Tβ-ФР (ß = 0,57; р = 0,04), но значимого влияния НЬА1с на экскрецию других ФР не выявлено. Не обнаружено взаимосвязи между возрастом больных, уровнем артериального давления, суточной дозой инсулина, СКФ и содержанием ФР. О бсужде ние В данной работе мы впервые исследовали изменение баланса между экскрецией с мочой фиброгенных и антифиброгенных факторов роста у больных СД 1-го типа с различными стадиями не фропатии. Отмечено повышение экскреции фиброгенных факторов: Тß1-ФP, α-ФНО и ФРФ2 по мере увеличения выраженности ДН. Это согласуется с данными литературы, свидетельствующими об активации синтеза указанных факторов в почках при СД [3, 4]. Экскреция с мочой фиброгенных ФР оказалась взаимосвязана с альбуминурией и морфологическими признаками ФК. Полученные результаты подтверждают представления о роли ФР в патогенезе ДН. Ключевым медиатором в развитии ФК признан Tβ-ФР — мощный стимулятор синтеза коллагена и других компонентов внеклеточного матрикса в почках [3]. Участие α-ФНО в патогенезе ДН связывают со стимуляцией воспалительных реакций и изменением активности коллагенолитических ферментов в клубочках [4]. ФРФ2 играет существенную роль в развитии тубулоинтерстициального фиброза, способствуя пролиферации фибробластов и эпителиальномезенхимальной трансформации канальцевых клеток [5]. В физиологических условиях действие указанных факторов уравновешивается эффектами антифибро-генных ФР, прежде всего КМП7 и ФРГ. Показано, что КМП7 блокирует пострецепторные механизмы передачи сигнала Tβ-ФР [10]. ФРГ снижает экспрессию Tβ-ФР, коллагена IV типа и тканевого ингибитора металлопротеиназ-1 в клубочках [11]. Мы не обнаружили статистически значимого изменения экскреции КМП7 и ФРГ у пациентов с ДН. Лишь у больных с протеинурией наблюдалась тенденция к повышению экскреции ФРГ, что может объясняться увеличением проницаемости почечного фильтра. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о подавлении продукции КМП7 и ФРГ в почках в условиях гипергликемии [12, 13]. Очевидно, дисбаланс в продукции ФР с преобладанием влияния фиброгенных факторов над антифиброгенными создает благоприятные условия для формирования фиброза почек при СД. Причины изменения продукции ФР в почках при СД неясны. Результаты исследований in vitro позволяют предполагать, что высокий уровень глюкозы может изменять интенсивность синтеза ФР в почечных клетках. В частности, избыток глюкозы повышает продукцию Tβ-ФР в мезангиоцитах [3, 4], стимулирует синтез ФРФ в фибробластах [14], тормо — 39 — И. А. Бондарь и соавт. зит продукцию КМП7 в подоцитах [12]. По нашим данным, выраженность гипергликемии (уровень HbA1c) у больных СД 1-го типа оказывает прямое влияние на экскрецию Тß1-РФ. Влияние гипергликемии на продукцию других ФР, по-видимому, не столь однозначно и, по данным литературы, может меняться во времени. Например, у мышей с СД экспрессия ФРГ временно увеличивается после индукции гипергликемии, однако в дальнейшем, по мере формирования гломерулосклероза, снижается от исходного уровня [13]. Долгосрочный патогенетический эффект гипергликемии может реализоваться через взаимосвязи между различными ФР. Так, Тß-ФР подавляет экспрессию КМП7 и увеличивает продукцию антагониста КМП7 гремлина в канальцевых клетках [15]. Каскадные изменения в обмене внеклеточного матрикса помогают объяснить, почему сосудистые осложнения СД могут прогрессировать и после снижения уровня глюкозы в крови (данный феномен известен как "метаболическая память") [16, 17]. В настоящее время активно изучаются возможности использования определения ФР и других маркеров межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий в моче для ранней диагностики и мониторирования течения фиброза почек различной этиологии [18—20]. В качестве маркера фиброза почек при ДН предложено определение экскреции коллагена IV типа [21]. У больных СД с нор-моальбуминурией и МАУ содержание коллагена IV типа в моче является прогностическим фактором, определяющим скорость снижения СКФ [22, 23]. В данной работе нами показано, что повышение экскреции с мочой фиброгенных ФР (Тß1-ФР, α-ФНО, ФРФ2) у больных СД 1-го типа коррелирует с экскрецией коллагена IV типа и отражает начальные этапы формирования ФК. Для оценки прогностической значимости определения экскреции с мочой ФР при ДН необходимы дальнейшие исследования. Заключе ние Развитие нефропатии у больных СД 1-го типа характеризуется нарастанием экскреции с мочой фиброгенных ФР (Тß1-ФР, α-ФНО, ФРФ2) в отсутствие значимого увеличения экскреции антифиброгенных факторов (ФРГ, КМП7). Экскреция фиброгенных ФР коррелирует с экскрецией коллагена IV типа и отражает развитие ФК. Нарушение баланса между фиброгенными и антифиброгенными ФР может способствовать развитию и прогрессированию ДН.

About the authors

I A Bondar

Novosibirsk State Medical University

Chair of Endocrinology

V V Klimontov

Novosibirsk State Medical University

Email: klimontov@mail.ru
Chair of Endocrinology

E M Parfentieva

Novosibirsk State Medical University

Chair of Endocrinology

V V Romanov

Diagnostic Laboratory «In vitro»

Novosibirsk

A P Nadeev

Novosibirsk State Medical University

Chair of Pathology

References

Supplementary files