Telomere length as a biomarker of the risk of cardiovascular complications in patients with coronary heart disease

Natalia A. Doroshchuk; Дорощук Наталья Александровна; Vadim Z. Lankin; Ланкин Вадим Зиновьевич; Alla K. Tikhaze; Тихазе Алла Карловна; Grigory I. Kheimets; Хеймец Григорий Иосифович; Alexander D. Doroshсhuk; Дорощук Александр Дмитриевич; Maria D. Smirnova; Смирнова Мария Дмитриевна; Irina E. Chazova; Чазова Ирина Евгеньевна

doi:10.26442/00403660.2021.01.200588

Telomere length as a biomarker of the risk of cardiovascular complications in patients with coronary heart disease

Authors: Doroshchuk N.A.¹, Lankin V.Z.¹, Tikhaze A.K.¹, Kheimets G.I.¹, Doroshсhuk A.D.¹, Smirnova M.D.¹, Chazova I.E.¹
Affiliations:
1. National Medical Research Center of Cardiology
Issue: Vol 93, No 1 (2021)
Pages: 20-24
Section: Original articles
URL: https://ter-arkhiv.ru/0040-3660/article/view/61664
DOI: https://doi.org/10.26442/00403660.2021.01.200588
ID: 61664

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Aim. To study the effect of oxidative stress and telomere length in the chromosomes of blood leukocytes in patients with coronary heart disease (CHD) on the development of cardiovascular complications.

Materials and methods. In 119 patients with CHD, the level of oxidatively modified low-density lipoproteins (ox-LDL) in blood plasma and the length of telomeres in nuclear blood cells were determined during the examination. After 5 years, a telephone survey of patients (or their relatives) was conducted to obtain data on the presence of cardiovascular complications. Telomere length was determined using quantitative real-time PCR, and the level of ox-LDL was determined by immunochemical method.

Results. It was found that reducing the length of telomeres in patients with CHD increases the risk of subsequent development of cardiovascular complications. A strong negative correlation was found between the level of ox-LDL and telomere length in the group of examined CHD patients who had cardiovascular complications after 5 years.

Conclusion. CHD patients with short telomere length and high levels of ox-LDL have an increased risk of cardiovascular complications during 5 years.

Keywords

telomere length, oxidatively modified low-density lipoproteins, oxidative stress, coronary heart disease

Full Text

ДИ – доверительный интервал

ИБС – ишемическая болезнь сердца

ИМ – инфаркт миокарда

МДА-ЛНП – липопротеиды низкой плотности, модифицированные малоновым диальдегидом

ок-ЛНП – окислительно-модифицированные липопротеиды низкой плотности

ОНМК – острое нарушение мозгового кровообращения

ССО – сердечно-сосудистые осложнения

Важной задачей современной кардиологии является поиск диагностических тестов, а также биомаркеров, позволяющих прогнозировать развитие осложнений сердечно-сосудистых заболеваний. Известно, что при патологиях сердечно-сосудистой системы происходит развитие окислительного стресса [1–3], в качестве одного из маркеров которого можно рассматривать уменьшение длины теломеров в ядерных клетках крови [3, 4]. Действительно, нами и другими авторами показано, что уменьшение длины теломеров происходит как при ишемической болезни сердца (ИБС) [5, 6], так и при сахарном диабете 2-го типа, являющемся фактором риска ИБС и атеросклероза [7, 8].

Теломеры – концевые участки хромосом, представленные высококонсервативными шестинуклеотидными повторами (TTAGGG), которые связаны с белками шелтериновского комплекса, служат главным образом для поддержания стабильности генома. Деление соматических клеток сопровождается естественным укорочением теломеров за счет концевой недорепликации ДНК [9]. При достижении критической длины теломеров клетка вступает в репликативное старение, за которым следует апоптоз [10]. Укорочение длины теломеров выявили при различных состояниях организма, характеризующихся наличием окислительного стресса: при действии неблагоприятных факторов окружающей среды (таких, как загрязнение атмосферы, волны летней жары и т.п.) [11, 12], курении [13], а также при старении и возрастных патологиях [14]. Окислительный стресс сопровождается деструкцией молекул ДНК и накоплением конечного продукта этого процесса – 8-гидроксигуанидина, который обнаруживается в плазме крови и моче больных [15], причем показано, что теломерная часть ДНК наиболее подвержена окислительной деструкции по сравнению с геномной [16, 17]. Исходя из того что укорочение длины теломеров при заболеваниях сердечно-сосудистой системы может быть связано с проявлениями окислительного стресса, цель исследования – исследовать возможности использования такого параметра, как длина теломеров, в качестве биомаркера для прогноза последующих осложнений при заболеваниях сердечно-сосудистой системы.

Материалы и методы

В исследование включены 119 больных ИБС в возрасте от 53 до 67 лет (40% мужчин), проходивших обследование в НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «НМИЦ кардиологии». Диагноз ИБС ставился на основании наличия в анамнезе стенокардии напряжения, перенесенного инфаркта миокарда (ИМ) или реваскуляризации миокарда. В ядерных клетках крови определяли длину теломеров, а в плазме крови – уровень окислительно-модифицированных липопротеидов низкой плотности (ок-ЛНП) в качестве показателя, свидетельствующего о выраженности окислительного стресса. По прошествии 5 лет после окончания исследования проведен телефонный опрос пациентов (или их родственников) о сердечно-сосудистых осложнениях (ССО), возникших у них за эти годы, таких как смерть от сердечно-соcудистых причин, ИМ и острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК).

Для выделения ДНК из ядерных клеток крови использовали набор «ДНК-Экстран-1» (ЗАО «Синтол», Россия). Длину теломеров определяли методом количественной полимеразной цепной реакции [16] в реальном времени на амплификаторе BIO-RAD CFX 96 Real-Time System (Сингапур). Исследование каждого образца повторяли 3 раза. Внутренним контролем, относительно которого определяли длину теломерного повтора, служил ген альбумина. Расчет относительной длины теломеров производили на основании формулы 2^(-ΔCt):

ΔCt=Ct_{теломеров} - Ct_{альбумина},

где Ct_{теломеров} – пороговый цикл теломерного повтора, Ct_{альбумина} – пороговый цикл гена альбумина. Результаты представлены как процент к калибратору. В качестве калибратора использовали ДНК, выделенную из клеток линии HeLa. Поскольку во всех группах больных нет достоверных возрастных различий, нормирование длины теломеров по возрасту не проводили. Уровень ок-ЛНП в плазме крови определяли иммунохимическим методом с использованием тест-наборов Mercodia Oxidized LDL ELISA (Швеция); измерения проводили на планшетном спектрофотометре Bio Tek EL808 (США).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы SPSS 22. Результаты представлены в виде среднего значения и ошибки среднего. При групповых сравнениях применяли непараметрический критерий Манна–Уитни. Для выявления корреляции между длиной теломеров и уровнем ок-ЛНП применяли метод корреляционного анализа по Спирмену. Прогностическую значимость оценивали по площади под кривой при ROC-анализе. Статистически значимыми считали различия при значениях р<0,05.

Результаты

В течение 5 лет у 85 участников исследования (71,4% из 119 пациентов исходной группы) не выявили ССО; ИМ перенес 21 человек, ОНМК – 7 человек, сердечно-сосудистая смерть зафиксирована в 6 случаях (см. таблицу). В группе обследованных, у которых через 5 лет выявлены ССО, исходная длина теломеров статистически значимо ниже (на 15%), а исходный уровень ок-ЛНП, напротив, статистически значимо выше (на 11%), чем у тех участников исследования, у которых в течение 5 лет каких-либо ССО не выявили (рис. 1).

Рис. 1. Исходная длина теломерных повторов хромосом (1) и исходный уровень ок-ЛНП (2) в крови обследованных больных ИБС, у которых в течение последующих 5 лет не возникло сердечно-сосудистых инцидентов (светлые столбики, принято за 100%), а также в группе больных ИБС, у которых в течение 5 лет выявлены ССО: ОНМК, ИМ и летальные случаи (темные столбики). *Различия между группами без ССО и с ССО статистически достоверны при р<0,05.

Сравнение исходной средней длины теломеров в группах больных ИБС с отсутствием и наличием ССО в течение последующих 5 лет показало, что в группе с ОНМК исходная средняя длина теломеров короче на 11%, в группе с ИМ – на 15%, а в группе с летальным исходом – на 19% (рис. 2).

Рис. 2. Исходные значения длины теломерных повторов хромосом в группе обследованных с различными сердечно-сосудистыми событиями, возникшими в течение 5 лет: 1 – без осложнений, 2 – ОНМК, 3 – ИМ, 4 – сердечно-сосудистая смерть. *Показатели в группах 2–4 статистически достоверно отличаются от показателя группы 1 (без ССО) при р<0,05.

В то же время такого рода зависимости между исходным уровнем ок-ЛНП при обследовании пациентов и развитием у них ССО в течение 5 лет не установили (см. таблицу).

Ранее нами обнаружена обратная зависимость между уровнем ок-ЛНП и длиной теломеров у пациентов с различным риском сердечно-сосудистых заболеваний и больных ИБС [5]. В данном исследовании в группе пациентов без развившихся через 5 лет CCО отмечена умеренная обратная корреляция между длиной теломеров и уровнем ок-ЛНП (r=-0,36; p<0,05); рис. 3, тогда как у пациентов с зарегистрированными через 5 лет ССО (ОНМК, ИМ и сердечно-сосудистая смерть), напротив, выявлена тесная негативная корреляционная связь между исходной длиной теломеров и исходным уровнем ок-ЛНП (r=-0,71; p<0,05); рис. 4.

Рис. 3. Корреляционная зависимость между исходной длиной теломерных повторов в хромосомах лейкоцитов и исходным уровнем ок-ЛНП плазмы крови у больных с ИБС, у которых в течение 5 лет после обследования не возникло ССО.

Рис. 4. Корреляционная зависимость между исходной длиной теломерных повторов в хромосомах лейкоцитов и исходным уровнем ок-ЛНП плазмы крови у больных ИБС, у которых в течение 5 лет после обследования зафиксированы различные (ОНМК, ИМ, летальный исход) ССО.

Для оценки прогностической значимости определения длины теломерной ДНК и уровня ок-ЛНП в качестве биомаркеров ССО у пациентов с ИБС использован метод построения ROC-кривых для каждого из этих показателей (рис. 5, 6 соответственно).

Рис. 5. ROC-кривая для определения прогностической значимости длины теломеров в развитии ССО. Площадь под кривой 0,66; чувствительность 74,3, специфичность 57,1 при длине теломеров менее 61,4 относительных единиц.

Рис. 6. ROC-кривая для определения прогностической значимости уровня ок-ЛНП в развитии ССО (объяснения приведены в тексте статьи).

Анализ ROC-кривой для определения прогностической значимости такого показателя, как длина теломеров, выявил, что площадь под кривой составила 0,66±0,06 (95% доверительный интервал – ДИ 0,554–0,757; р=0,007). При пороговом значении относительной длины теломеров, равной 61,4 относительных единиц, чувствительность метода составила 74,3% (95% ДИ 56,7–87,5), а специфичность – 57,1% (95% ДИ 43,2–70,3). При этом значении длины теломеров отношение шансов развития сердечно-сосудистых инцидентов составило 3,8 (р<0,05). Таким образом, для лиц в возрасте от 53 до 67 лет при длине теломеров, равной или ниже 61,4, вероятность ССО повышается в 3,8 раза (см. рис. 5). В то же время анализ ROC-кривой для определения прогностической значимости уровня ок-ЛНП показал (см. рис. 6), что уровень ок-ЛНП не может использоваться в качестве прогностического биомаркера ССО у пациентов с ИБС (площадь под кривой 0,52±0,08; 95% ДИ 0,422–0,693; р=0,46). При пороговом значении ок-ЛНП 47,9 ед./л чувствительность метода составила 29,6% (95% ДИ 13,8–80,2), а специфичность – 96,5% (95% ДИ 82,2–99,9).

Обсуждение

Ранее нами показано, что при уменьшении длины теломеров в ядерных клетках крови степень риска сердечно-сосудистой смерти по шкале SCORЕ возрастает [5], причем увеличение риска по шкале SCORЕ ассоциировано также с повышенным уровнем ок-ЛНП, что свидетельствует об интенсификации свободнорадикальных реакций и наличии окислительного стресса при увеличении риска сердечно-сосудистой смерти. В соответствии с этим данные исследования выявили статистически значимую тесную взаимосвязь между длиной теломеров и последующим риском развития серьезных (включая фатальные) сердечно-сосудистых инцидентов (см. рис. 4), тогда как значительной корреляции между уровнем ок-ЛНП у пациентов и последующим развитием у них ССО не выявили (см. рис. 3). В связи с этим следует отметить, что при помощи использованных в наших исследованиях для определения уровня ок-ЛНП тест-наборов Oxidized LDL ELISA фирмы Mercodia, как показано нами ранее [19], можно проводить определение не любых ок-ЛНП, а исключительно ЛНП, модифицированных малоновым диальдегидом (МДА-ЛНП). Именно МДА-ЛНП преимущественно накапливаются при ИБС и атеросклерозе [2, 3], причем нами установлено, что именно МДА-ЛНП могут играть важную роль в молекулярных механизмах атерогенного повреждения стенки сосудов [20]. Очевидно, что реакции, приводящие к интенсивному образованию свободных радикалов, вызывающих окислительные повреждения и деструкцию молекул ДНК, предшествуют накоплению вторичных продуктов окисления, вызывающих модификацию молекул апопротеина В-100 частиц ЛНП, таких как малоновый диальдегид [2, 3]. Кроме того, МДА-ЛНП достаточно быстро элиминируются из кровотока [21], причем уровень МДА-ЛНП может уменьшаться при действии некоторых гипохолестеринемических препаратов [22]. Вследствие этого стационарная концентрация МДА-ЛНП априори не может использоваться для долгосрочных прогнозов, что убедительно доказывают приведенные в статье данные (см. рис. 6). Что касается длины теломеров, то этот показатель, несомненно, может существовать в неизменном виде значительно более длительное время и, следовательно, более пригоден в качестве интегрального теста.

Заключение

Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что определенная длина теломеров в ядерных клетках периферической крови может быть предиктором различных ССО. В частности, уменьшение длины теломеров ниже 61,4 относительных единиц у больных ИБС в возрасте 53–67 лет увеличивает риск развития ССО в 2,4 раза (см. рис. 5), причем уменьшение длины теломеров даже на 19% увеличивает, в соответствии с полученными данными, вероятность сердечно-сосудистой смерти в ближайшие 5 лет (см. таблицу).

Число сердечно-сосудистых инцидентов у больных ИБС (n=119), развившихся в течение последующих 5 лет после определения у них исходных параметров окислительного стресса – длины теломеров в хромосомах ядерных клеток крови и уровня ок-ЛНП плазмы крови
Осложнения	Число больных, абс. (%)	Длина теломеров, относительные единицы	Ок-ЛНП, ед./л
Без осложнений	85 (71,4)	60,8±7,6	65,98±1,9
Все осложнения	34 (28,4)	51,6±6,5*	73,07±4,6*
ОНМК	7 (5,9)	53,9±6,3*	74,33±6,8*
ИМ	21 (17,6)	51,7±6,8*	71,84±2,6*
Сердечно-сосудистая смерть	6 (5,1)	49,4±4*	73,04±3,9*

*р<0,05 по сравнению с группой без ССО.