Circulating microRNAs as potential biomarkers of chronic kidney disease

Full Text

ОПН - острая почечная недостаточность рСКФ - расчетная скорость клубочковой фильтрации СКФ - скорость клубочковой фильтрации ТСПН - терминальная стадия почечной недостаточности ХБП - хроническая болезнь почек sCr - содержание креатинина в сыворотке крови Введение Хроническая болезнь почек (ХБП) среди причин смерти занимает в мире 12-е, а среди причин инвалидности - 17-е место [1]. Глобальная распространенность ХБП составляет 10-16%, при этом заболеваемость почечной недостаточностью в терминальной стадии резко возросла за последнее десятилетие [2-5]. Таким образом, ХБП представляет значительную проблему для общественного здравоохранения всех стран с серьезными последствиями для развития их экономик [6, 7]. Характерными особенностями ХБП являются прогрессирующее повреждение почечной паренхимы и потеря функционирующих нефронов [8, 9]. Потеря функционирующих нефронов, в свою очередь, вызывает стимуляцию молекулярных и клеточных механизмов, ответственных за компенсаторную гипертрофию и гиперфильтрацию в остальных нефронах [10]. Эти механизмы могут стать патологическими, способствовать дальнейшему прогрессированию повреждения нефронов и привести, в конечном итоге, к развитию терминальной стадии почечной недостаточности (ТСПН) [11, 12]. В настоящее время диагностика ХБП проводится на основании выявления маркеров повреждения почек при клинико-лабораторном обследовании. Критерием нарушения функции почек является снижение показателя скорости клубочковой фильтрации (СКФ), для оценки которого определяют содержание креатинина в сыворотке крови (sCr). Однако, как было показано, sCr не имеет высокой прогностической ценности. Более того, D. Steubl и соавт. [13] продемонстрировали нелинейную зависимость между sCr и расчетной СКФ (рСКФ). Концентрация креатинина в сыворотке крови стойко повышается тогда, когда уже приблизительно 40-50% почечной паренхимы становятся обратимо или необратимо поврежденными. Это способствует тому, что ранние стадии повреждения пропускаются и, следовательно, несвоевременно начинается лечение. В то же время выявление ХБП на ранних стадиях может замедлить ее прогрессирование, отсрочить начало заместительной почечной терапии, своевременно предупреждать сердечно-сосудистые осложнения [14, 15]. В качестве маркеров ХБП могут представлять интерес микроРНК (miRNA) - новый, недавно идентифицированный класс посттранскрипционных регуляторов экспрессии генов, присутствующий в периферической крови. В настоящее время активно изучается возможное влияние микроРНК на ключевые механизмы повреждения почечной ткани при различных нефропатиях. Снижение рСКФ, увеличение экскреции белка и альбумина с мочой, а также более высокие степени тубулоинтерстициальной атрофии и фиброза связаны с более тяжелым прогнозом при ХБП [16]. Развитию тубулоинтерстициального фиброза предшествуют инфильтрация интерстиция воспалительными клетками, активация и накопление пула интерстициальных фибробластов, продуцирующих компоненты внеклеточного матрикса, расширение площади тубулоинтерстиция с разрежением перитубулярных капилляров [16-18]. В настоящее время активно изучается возможное влияние микроРНК на механизмы формирования тубулоинтерстициального фиброза при различных нефропатиях. Развитие дисфункции почек при протеинурических формах нефропатий, независимо от их природы, тесно связано со структурно-функциональным изменением подоцитов и последующей их потерей с мочой, поэтому определение маркеров подоцитарного повреждения и ассоциированных с ним микроРНК может быть полезным для раннего выявления ХБП [19]. Прогрессирование ХБП сопровождается нарушениями фосфорно-кальциевого обмена, которые приводят к ремоделированию сердечно-сосудистой системы, развитию аритмий, сердечной недостаточности и повышению смертности от всех кардиоваскуляярных событий [20]. Кроме того, на продвинутых стадиях ХБП происходит значительное накопление в крови уремических токсинов, в том числе индоксил-сульфата (IS), индол-3-уксусной кислоты (IAA) и p-крезилсульфата (PCS), которые плохо удаляются посредством диализа и также способствуют повышению сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности [21]. Поэтому необходимы новые, высокочувствительные биомаркеры, способные на самых ранних этапах выявлять и более точно стратифицировать прогрессирование ХБП и риски ее осложнений. Эти биомаркеры должны быть специфичными для заболеваний почек, а методы их исследования - обеспечивать возможность проведения быстрых, неинвазивных измерений, хорошо коррелирующих с патологией [14]. В настоящем обзоре представлены в основном результаты исследований иностранных авторов, хотя в последние 3-4 года и в российских научных журналах появились публикации аналогичного характера, посвященные исследованиям связи микроРНК с отдельными заболеваниями почек - диабетической нефропатией, хроническим гломерулонефритом, амилоидозом [22-24]. Циркулирующие микроРНК МикроРНК являются эволюционно консервативными, эндогенными, некодирующими РНК. Они состоят примерно из 21-25 нуклеотидов и регулируют экспрессию гена путем связывания с 3'-нетранслируемой областью таргетных матричных РНК (мРНК). До сих пор определены примерно 3000 человеческих микроРНК, которые регулируют до 30% всех транскриптов мРНК человека [25]. В 2007 г. H. Valadi и соавт. [26] сообщили, что микроРНК могут выделяться из клеток во внеклеточное пространство in vitro, а через год S.S. Chim и соавт. [27] удалось изолировать плацентарную микроРНК из материнской плазмы. Точные роли циркулирующих микроРНК еще предстоит определить, но существует несколько линий доказательств, свидетельствующих о том, что они не просто являются «отработанными» продуктами клеток, но и играют значительную роль в межклеточных взаимодействиях [25]. Так, недавно показано, что у пациентов с почечной недостаточностью сердечно-сосудистая адаптация к физическим нагрузкам опосредуется изменениями экспрессии микроРНК, вовлеченных в процессы ангиогенеза (miR-126, miR-210), воспаления (miR-21, miR-146a), гипоксии/ишемии (miR-21, miR-210) [28], а на модели животных установлено, что эффекты эритропоэтина в почке также опосредуются микроРНК [29]. Циркулирующие микроРНК привлекательны в качестве потенциальных биомаркеров, поскольку содержание их в крови очень стабильное [30], что объясняется защищенностью микроРНК от деградации либо путем включения их в различные типы везикул (например, экзосомы), либо посредством связывания с РНК-ассоциированными белками [25]. Полагают, что профиль экспрессии микроРНК в крови или моче может отражать изменения в клетках, участвующих в конкретном патологическом процессе, так как эти клетки могут выделять определенную популяцию микроРНК, например через секрецию микроРНК-содержащих экзосом [31]. МикроРНК стабильны в различных жидкостях тела и устойчивы к воздействию высоких температур, изменениям рН и циклам заморозки - разморозки [32, 33]. МикроРНК обладают высокой чувствительностью (быстро и в значительном количестве выделяются при развитии патологии) и специфичностью (способны дифференцировать патологию конкретных пораженных органов). Кроме того, экспрессия микроРНК ткане- и клеточноспецифична, изменяется во время патологических процессов и, что наиболее важно, изменения уровней микроРНК в циркуляции коррелируют с изменениями в пораженных тканях. Наконец, получение клинических образцов, которые содержат циркулирующие микроРНК, - малоинвазивный и простой процесс. Роль микроРНК в физиологии и патофизиологии почек Роль микроРНК в физиологии и патофизиологии почек четко продемонстрирована на моделях мышей, нокаутных по гену Dicer, который кодирует одноименный фермент, отвечающий за превращение предшественника микроРНК (mir) в зрелую микроРНК (miR). При этом созданы различные нокаутные модели животных, у которых Dicer отсутствовал либо в подоцитах, либо в клетках проксимальных канальцев или юкстагломерулярных клетках. Так, подоцит-специфическая модель нокаута Dicer способствовала развитию массивной протеинурии, тубулоинтерстициального фиброза, сглаживанию ножек подоцитов и гломерулосклерозу уже через 2-4 нед после рождения мышей [34-36]. Мыши, у которых отсутствовал Dicer в почечных канальцах и в собирательных трубочках, характеризовались развитием гидронефроза, гидроуретера и формированием кист [37]. Q. Wei и соавт. [38] создали модель нокаутной мыши с удаленным Dicer в клетках проксимальных канальцев. После индуцирования двусторонней почечной ишемии-реперфузии эти мыши показали устойчивость к развитию острой почечной недостаточности (ОПН). При этом анализ микрочипов, проведенный в течение 12-48 ч реперфузии, выявил некоторые сдвиги в содержании микроРНК (miR-132, miR-362, miR-379, miR-668, miR-687). На другой модели ОПН, индуцированной цисплатином, наблюдалось повышение концентрации miR-34a [39]. Введение пифитрина-α (ингибитор miR-34a) значительно улучшало функцию почек. Дальнейшие исследования смогут выявить различный профиль микроРНК при различных формах острого поражения почек, и тогда микроРНК могут стать потенциальными мишенями для терапевтических вмешательств. M.L. Sequeira-Lopez и соавт. [40] индуцировали делецию Dicer в ренин-секретирующих юкстагломерулярных клетках. Эта мышиная модель демонстрировала острую потерю юкстагломерулярных клеток, уменьшение экспрессии ренина в почках и падение концентрации ренина в плазме, а также снижение артериального давления, сосудистые аномалии и развитие фиброза в почках. На другой модели V.K. Nagalakishmi и соавт. [41] показали, что абляция Dicer играет решающую роль в развитии нефронов и интраренального отдела мочеточников у млекопитающих. Эти различные животные модели с отсутствием Dicer в почечных клетках показывают, насколько важную роль играют микроРНК в регуляции структуры и функции клубочков и канальцев. МикроРНК как потенциальные биомаркеры ХБП Исследования на клеточных и животных моделях. По данным исследований, выполненных как на клеточных, так и на животных моделях, уровни микроРНК ассоциированы с ХБП [42-44]. Так, на мышиной модели ХБП показано, что микроРНК-126, микроРНК-143, микроРНК-145 и микроРНК-223 участвуют в сосудистых осложнениях, развивающихся на более поздних стадиях ХБП [43]. Установлена роль эндотелиальной микроРНК-126 в развитии эндотелиальной дисфункции [45], а микроРНК-143 и микроРНК-145, как оказалось, специфически экспрессируются в гладкомышечных клетках сосудов и играют важную роль при сосудистых заболеваниях [46]. На моделях сосудистой кальцификации in vitro [44, 47] обнаружено, что воспалительная микроРНК-223 модулируется неорганическим фосфатом, а in vivo показано повышение ее экспрессии в аорте мышей с ХБП [43]. Важно отметить, что экспрессия названных микроРНК изменена в сыворотке мышей с ХБП, поэтому можно предполагать аналогичные изменения и у пациентов с ХБП [43]. На экспериментальных моделях показано, что изменения экспрессии микроРНК-145, -143, -126, -223, -155, -125b в тканях, отражаемые их уровнями в плазме, могут быть использованы в качестве неинвазивных маркеров сосудистой кальцификации и сердечно-сосудистых осложнений при ХБП [42, 43]. Кроме того, в эксперименте продемонстрирована эффективность заместительной терапии микроРНК-145 для снижения атеросклеротического повреждения [48]. МикроРНК, по разным оценкам, участвуют в прогрессировании почечной дисфункции и развитии сахарного диабета, который является самой частой причиной ХБП. F. Taibi и соавт. [43], исследовав изменения экспрессии микроРНК (miR-126, miR-143, miR-145, miR-223) в аортах мышей дикого типа с ХБП и без нее, а также у аполипопротеин-E-нокаутных мышей, продемонстрировали, что микроРНК могут быть вовлечены в механизмы развития эндотелиальной дисфункции и сердечно-сосудистых изменений при ХБП. Результаты исследований других авторов [34, 35, 49] также свидетельствуют о том, что микроРНК играют ключевую роль в физиологии почек. Так, глобальная потеря микроРНК путем селективной элиминации Dicer в почечных подоцитах, наблюдаемая при тяжелых гломерулопатиях и поражениях канальцев, проявлялась протеинурией и прогрессирующей почечной функциональной недостаточностью [34, 35]. Исследования, выполненные на животных моделях, продемонстрировали, что почки у Dicer-нокаутных животных [49] проявляют аномальное морфологическое развитие, гломерулокистозные изменения и почечную недостаточность. Учитывая то обстоятельство, что процессинг микроРНК в почечных клетках, особенно в подоцитах, необходим для поддержания морфологии и функции почек, а также важную роль подоцитов при ХБП диабетической и недиабетической природы [50-52], есть все основания считать, что микроРНК могут оказаться весьма полезными и чувствительными биомаркерами почечной патологии у людей. На животных моделях диабетической болезни почек продемонстрировано, что микроРНК оказывают влияние на прогрессию клеточного цикла, клеточную функцию и повышение резистентности к инсулину [53]. Кроме того, обнаружено, что микроРНК изменяют транскрипцию генов воспалительных цитокинов, стимулируют производство внеклеточного матрикса (коллагена фибронектина), способствуют процессам эпителиально-мезенхимальной трансдифференциации. Также показано, что ассоциированные с ДН микроРНК (miR-21, miR-29, miR-192, miR-200) модифицируют ответ мезангиальных клеток, эпителиоцитов проксимальных канальцев и подоцитов на действие трансформирующего фактора роста β (TGF-β) [54, 55]. Роль микроРНК в патогенезе и прогрессировании ДН подтверждается и другими многочисленными исследованиями [56-58]. Исследования в клинической практике. Онкология стала первой медицинской дисциплиной, которая исследовала микроРНК в плане ее диагностического потенциала. По сравнению со здоровыми контролями, различия в циркулирующих сывороточных уровнях микроРНК-210, микроРНК-155 и микроРНК-21 отмечались у пациентов с большой В-клеточной лимфомой [59], микроРНК-141 - с раком предстательной железы [33], микроРНК-25 и микроРНК-223 - с раком легкого [32]. С тех пор опубликованы многочисленные сообщения о значении микроРНК в качестве биомаркеров и при других заболеваниях - диабете [60], коронарной болезни сердца [61, 62] и хронической болезни почек [63]. В частности, М. Rudnicki и соавт. [64] выполнили количественную полимеразно-цепную реакцию микроРНК и профилирование экспрессии мРНК микрочипов на участках биопсии почек в опытной и контрольной когортах, чтобы дифференцировать стабильные и прогрессирующие случаи ХБП. Авторы показали, что уровни микроРНК-30d, микроРНК-140-3p, микроРНК-532-3p, микроРНК-194, микроРНК-190, микроРНК-204 и микроРНК-206 снижены у пациентов с прогрессирующей ХБП. Указанные микро-РНК также оказались вовлечены в процессы воспаления, межклеточного взаимодействия, апоптоза и внутриклеточной сигнализации. Ранее C.S. Neal и соавт. [63] показали, что у пациентов с тяжелой хронической почечной недостаточностью циркулирующие уровни микроРНК-16, микроРНК-21, микроРНК-155, микроРНК-210 и микроРНК-638 снижены по сравнению с пациентами с легкой степенью почечной недостаточности или нормальной функцией почек. Выявлена сильная корреляция между обнаруженными циркулирующими микроРНК и СКФ и менее значительная корреляция - с другими проявлениями хронического заболевания почек, такими как анемия и гиперпаратиреоз. Х. Chen и соавт. [32] обнаружили в крови 90 пациентов с ХБП снижение уровней трех микроРНК (miR-125b, miR-145 и miR-155), участвующих в пролиферации и дифференцировке сосудистой гладкомышечной клетки (VSMC). Как известно, при почечной дисфункции наблюдается аномальное сосудистое ремоделирование, которое является фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний. Многофакторный анализ, выполненный авторами, показал, что снижение уровней этих микроРНК позитивно коррелирует с падением СКФ. В другой работе В. Brigant и соавт. [65] исследовали уровни микроРНК в контроле и у пациентов с различными стадиями ХБП (ХБП 3-5-й стадий, гемодиализные пациенты и реципиенты почечных трансплантатов). Основываясь на исходных экспериментальных данных, авторы сосредоточились на 5 видах микроРНК (miR-126, miR-143, miR-145, miR-155 и miR-223), провели корреляцию уровней изучаемых микроРНК с уровнями уремических токсинов. У пациентов с ХБП 3-5-й стадий обнаружено, что экспрессия всех пяти микроРНК в сыворотке была повышенной. Напротив, их экспрессия снижена у реципиентов почечного трансплантата по сравнению с контролем; у гемодиализных пациентов уровни miR-143, miR-145, miR-223 повышены, в то время как уровни miR-126, miR-155 снижены. Что касается содержания уремических токсинов, то сывороточные концентрации индоксил-сульфата (IS) и p-крезилсульфата достоверно коррелировали с уровнями микроРНК-126 и микроРНК-143, а концентрация микроРНК-155 - с уровнем IS. Однако содержание индол-3-уксусной кислоты не коррелировало ни с одной из изученных микроРНК, а уровни микроРНК-145 и микроРНК-223 - ни с одним из уремических токсинов. Трансплантация почек улучшает выживаемость и качество жизни и поэтому стала признанным терапевтическим выбором для пациентов с ТСПН [66]. Однако долгосрочные результаты трансплантации остаются неудовлетворительными (~ 50% пациентов с пересаженной почкой нуждаются в диализе через 10 лет после операции вследствие утраты функции трансплантата). Существует потребность в биомаркерах, подходящих для неинвазивного мониторинга функции трансплантата с целью выявления прогрессирования хронической ренальной дисфункции. Согласно опубликованным данным [67], скорость потери почечной функции связана с внутрипочечными микроРНК, интерстициальным фиброзом с атрофией канальцев и появлением микроРНК в моче. Три микроРНК (miR-142-3p, miR-204, miR-211) предложены в качестве конкретных биомаркеров, позволяющих различать с очень высокой точностью пациентов «с» и «без» дисфункции трансплантата [67-69]. Однако их достоверность должна быть подтверждена в дальнейших исследованиях. Согласно данным N.X. Chen и соавт. [42], уровень циркулирующих микроРНК обычно имеет склонность к снижению во время тяжелой ХБП и/или диализа. Как показано, циркулирующая микроРНК-21 связана со шкалой оценки фиброза и обратно коррелирует с рСКФ у реципиентов с почечным трансплантатом [70], в то время как уровни микроРНК-29 и микроРНК-200 снижались в экзосомах мочи у больных ХБП с тяжелой протеинурией [71]. Высказано предположение, что микроРНК мочи отражают степень лабораторных проявлений многочисленных почечных заболеваний, в то время как циркулирующие микроРНК, по-видимому, позитивно связаны с тяжестью ХБП [53]. В связи с тем что почка играет ключевую роль в выведении малых РНК (в том числе микроРНК) из кровообращения, есть основания полагать, что почечная недостаточность, вероятно, связана с изменениями в уровне циркулирующих микроРНК из-за их нарушенного клиренса. Следовательно, микроРНК могут служить не только более хорошими маркерами повреждения фильтрационной способности почек, чем обычные биомаркеры (включая сывороточный креатинин и цистатин-C), но также и более чувствительным биомаркером канальцевой дисфункции, чем β2-микроглобулин, вследствие особенностей механизмов транспорта микроРНК в проксимальных канальцах [53]. R. Khurana и соавт. [16] выполнили анализ всех некодирующих РНК (нкРНК) у пациентов с ХБП 1-4-й стадий и здоровых контролей. Установлено, что на 1-й стадии ХБП значительные различия в экзосомальном содержании по сравнению со здоровыми контролями обнаруживают 211 нкРНК, на 2-й стадии - 153 нкРНК, на 3-й стадии - 221 нкРНК и на 4-й стадии - 117 нкРНК. Они полагают, что панель из 100 нкРНК, у которых экзосомальное содержание существенно различалось между пациентами с ХБП 1-й и 2-й стадий и здоровыми контролями, можно использовать в качестве ранних диагностических маркеров ХБП. В свою очередь, у 67 пациентов с поздними стадиями ХБП выявлены 67 перекрывающихся (имеющих общий участок нуклеотидной последовательности) нкРНК. В этом же исследовании R. Khurana и соавт. [16] обнаружили 27 нкРНК, содержание которых в крови у пациентов с ХБП всех стадий различалось по сравнению со здоровыми контролями. Кроме того, они идентифицировали 16 микроРНК, уровни девяти из которых значительно повышены у пациентов с ХБП по сравнению со здоровыми лицами (miR-let-7c-5p, miR-222-3p, miR-27a-3p, miR-27b-3p, miR-296-5p, miR-31-5p, miR-3687, miR-6769b-5p и miR-877-3p), а семи - существенно снижены (miR-133a, miR-133b, miR-15a-5p, miR-181a-5p, miR-34a-5p, miR-181-5p и miR-1-2). Наиболее ценными стали данные о микроРНК-181a, содержание которой в экзосомах оказалось примерно в 200 раз ниже у пациентов с ХБП, чем у здоровых людей. Описанная ранее у пациентов с нефротическим синдромом и реципиентов почечного трансплантата, микроРНК-181a предложена в качестве потенциального биомаркера для ранней диагностики ХБП. Заключение Ранняя диагностика ХБП и идентификация пациентов с прогрессирующей почечной дисфункцией продолжают оставаться одними из важнейших задач клинической нефрологии, поскольку существующие лабораторные тесты, включая уровень креатинина, рСКФ и протеинурию, не имеют высокой диагностической и прогностической ценности. Как следует из настоящего обзора, потенциальную ценность в этом отношении могут представлять микроРНК - небольшие, некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов-мишеней на посттранскрипционном уровне либо путем подавления трансляции, либо вызывая деградацию соответствующего РНК-мессенджера. Имеющиеся сегодня данные, полученные как с использованием клеточных и животных моделей, так и у пациентов с почечными заболеваниями, свидетельствуют о нарушении регуляции ряда микроРНК при ХБП, которые выявляются уже на ранних стадиях болезни. Так, у пациентов с ХБП 3-5-й стадий экспрессия некоторых микроРНК в сыворотке оказалась повышенной и коррелировала с содержанием уремических токсинов. Также показана возможность использования циркулирующих микроРНК в качестве диагностических биомаркеров хронической аллотрансплантационной нефропатии. Безусловно, эти и некоторые другие данные о связи микроРНК с ХБП свидетельствуют о потенциальной ценности применения их для ранней диагностики почечной дисфункции. Но поскольку результаты одних исследований еще носят предварительный характер, а других - являются в некоторой степени противоречивыми, необходимо проведение дополнительных многочисленных исследований с тем, чтобы подтвердить достоверность полученных данных. Возможность воздействия на микроРНК в качестве терапевтических мишеней при ХБП еще нуждается в дальнейшем изучении. И, тем не менее, именно с данным направлением связаны большие надежды, поскольку коррекция нарушенной регуляции микроРНК в почечных клетках позволит замедлить скорость прогрессирования почечной дисфункции и тем самым отдалить время начала заместительной терапии, а также препятствовать развитию сердечно-сосудистых осложнений. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

K. A Aitbaev

Scientific and Research Institute of Molecular Biology and Medicine

Bishkek, Kyrgyzstan

I. T Murkamilov

Akhunbaev Kyrgyz State Medical Academy; Kyrgyz Russian Slavic University named after the First President of Russia B.N. Yeltsin

Email: murkamilov.i@mail.ru
Bishkek, Kyrgyzstan

V. V Fomin

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Moscow, Russia

References

Supplementary files