Протеом термического гелиокса. Высокотемпературный гелиокс не вызывает разрушение клеток дыхательной системы человека

Полный текст

Введение

Одним из современных научных направлений является бризомика (breathomica), перед которой стоят задачи поиска новых биологических маркеров болезней органов дыхания в конденсате выдыхаемого воздуха. Совместная работа двух коллективов дала возможность описать изменения спектра белков в конденсате выдыхаемого воздуха при таких заболеваниях, как пневмония, бронхиальная астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), рак легких, а также трансплантация легких. Обнадеживающие данные получены при исследовании протеома конденсата выдыхаемого воздуха при таких близких заболеваниях, какими являются бронхиальная астма и ХОБЛ. Удалось описать биологические маркеры, характерные для ХОБЛ. Особое внимание в цикле исследований уделено оценке эффективности и безопасности проводимых методов лечения.

Высокотемпературная дыхательная смесь гелия и кислорода (термический гелиокс, t-Не/О₂) начинает активно применяться для лечения разнообразных заболеваний, включая ХОБЛ [1], ишемический инсульт [2], некоторые патологии беременности. Актуальным представляется использование термического гелиокса для лечения острых вирусных инфекций, включая поражение коронавирусом [3], а также применение высокотемпературной газовой смеси гелия и кислорода для стимуляции иммунной системы человека [4]. Вместе с тем влияние t-Не/О₂ на организм человека представляется достаточно сложным и требует дополнительных исследований. Ключевой вопрос, на который требуется ответ в первую очередь, – не вызывает ли использование высоких температур (60ºС и выше) существенного разрушительного воздействия на клеточные структуры системы дыхания с появлением в выдыхаемом воздухе белков деструктурированных клеток?

Цель исследования – проведение пилотного исследования по оценке влияния термического гелиокса на состояние респираторного тракта с помощью изучения белкового состава конденсата выдыхаемого воздуха до процедуры термического гелиокса, сразу после и спустя 3 ч релаксации.

Материалы и методы

В нашем пилотном исследовании приняли участие 5 некурящих здоровых доноров (Ж, 25±1). Пробы конденсата выдыхаемого воздуха собирались по традиционной процедуре с помощью портативного конденсора и R-tube (Respiratory Research, США) [5, 6]. Дыхательную процедуру проводили нагретой до 70ºС смесью газов Не/О₂ (70/30) в течение 20 мин на аппарате «Гелиокс-экстрим» (ООО «Медтехинновации», Россия).

Пробоподготовка для масс-спектрометрии включала лиофилизацию пробы и селективный триптический гидролиз, расщепляющий белок по пептидным связям, содержащим лизин и аргинин [7]. Хромато-масс-спектрометрический анализ (ВЭЖХ-МС/МС) проводили на системе, состоящей из хроматографа Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., США) и масс-спектрометра LTQ FT Ultra (Thermo, Германия) в соответствии с ранее опубликованными протоколами [8]. Список из точных масс пептидов и масс их фрагментов использовали для поиска и идентификации белков по базе данных при помощи программы Mascot (Matrix Science, Лондон, Великобритания; версия 2.2.2). Для идентификации белков использовали базу данных Swiss-Prot Human из открытой базы данных последовательностей белков UniProt (Швейцария).

Результаты и обсуждение

Исследование белкового содержания конденсатов выдыхаемого воздуха (КВВ) – эффективный метод диагностики различных респираторных заболеваний. Нами этот метод использовался для ранней диагностики рака легких [9], ХОБЛ [10], астмы [11], биохимических процессов при трансплантации легкого [12]. Российские космонавты, работающие на Международной космической станции, проходят исследование на содержание белков в КВВ до и после космического полета [13].

Исследование влияния термического гелиокса на белковый состав КВВ дало следующие результаты.

1. После процедуры гелиокса объем собираемого конденсата (1–1,5 мл) падает в среднем на 32% и практически восстанавливается после 3-часовой релаксации (рис. 1). Волонтеры отмечают, что после процедуры процесс дыхания облегчается.

 

Рис. 1. Изменение массы образцов КВВ в зависимости от проведения процедуры t-Не/О₂.

 

Особое внимание уделено при анализе полученных данных влаговыделительной функции легких. Количество собранного конденсата после ингаляции термического гелия сокращалось на 1/3. Возникает вопрос об изменении количества жидкости конденсата: редукция конденсата связана с влиянием гелия, кислорода или же термического эффекта? Исходя из опыта ингаляции кислорода в терапевтических целях можно утверждать, что редукция количества конденсата обусловлена синергетическим действием кислорода и повышенной температуры вдыхаемой газовой смеси. Восстановление влаговыделительной функции легких происходило уже к 3-му часу после ингаляции нагретой смеси. Это следует иметь в виду при практическом применении гелия и кислорода, чтобы сочетать ингаляцию газовой смеси с ее увлажнением, как это обычно делается при ингаляции чистого кислорода.

2. В таблице приведены данные по белковому составу КВВ до, сразу после дыхательной процедуры термического гелиокса и после 3-часовой релаксации. Все 3 образца дают общую картину, которую мы наблюдали во всех пробах КВВ, отбираемых у здоровых пациентов [14].

 

Белковый состав КВВ в зависимости от t-Не/О2
Белок	t-He/O2			Белок	t-He/O2
	до	сразу после	3 ч спустя		до	сразу после	3 ч спустя
Desmoglein-1	+	+	+	Tubulin alpha-1C chain	+	+	-
Cystatin-A	+	+	+	Fibrinogen beta chain	-	+	+
Immunoglobulin heavy constant gamma 1	+	+	+	Hemoglobin subunit alpha	-	+	+
Immunoglobulin gamma-1 heavy chain	+	+	+	Desmocollin-1	-	-	+
Immunoglobulin kappa constant	+	+	+	Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase	-	-	+
Complement C3	+	+	+	Actin, cytoplasmic 2	-	+	-
Desmoplakin	+	+	+	Creatine kinase B-type	-	+	-
Keratin, type I cytoskeletal 17	+	+	+	14-3-3 protein zeta/delta	-	+	-
Keratin, type I cytoskeletal 16	+	+	+	Keratin, type I cytoskeletal 13	-	+	-
Dermcidin	+	+	+	Actin, cytoplasmic 1	-	+	-
Keratin, type II cytoskeletal 5	+	+	+	Apolipoprotein A-I	-	+	-
Small proline-rich protein 3	+	+	+	Calmodulin-2	-	+	-
Keratin, type II cytoskeletal 6B	+	-	-	Calmodulin-3	-	+	-
Calmodulin-like protein 5	+	-	+	Calmodulin-1	-	+	-

 

Это несколько белков иммуноглобулинового ряда, несколько структурных белков кератиновой природы, тубулин, кальмодулин. Такая общая типичная картина наблюдается для проб до процедуры гелиокса, сразу после и после 3-часовой релаксации. Следует обратить внимание на то, что в КВВ устойчиво проявляются белки иммунной системы (иммуноглобулины, белки комплемента). Эти же белки обнаруживаются в КВВ после дыхания смесью Не/О₂ и после 3-часовой релаксации. Как известно, иммуноглобулины, прежде всего иммуноглобулин А, хорошо представлены в слизистой оболочке. Это, по-видимому, является причиной их присутствия в КВВ.

В пробах после термического гелиокса наблюдается появление в небольших количествах дополнительных белков. Это белки мышечного метаболизма (актины и кальмодулины), фибриноген, следы гемоглобина, аполипопротеина, креатинкиназы В типа. После 3-часовой релаксации в КВВ исчезает тубулин.

 

Рис. 2 визуализирует совокупность полученных результатов. Видны зоны пересечения и количество различающихся белков (15 белков до t-He/O₂ процедуры, 24 сразу после и 18 белков спустя 3 ч после t-He/O₂) в образцах до, после и спустя 3 ч после процедуры.

 

Рис. 2. Количество белков в пробах КВВ: до, сразу после и спустя 3 ч воздействия t-He/O₂.

 

Особое внимание привлекают данные о содержании иммуноглобулинов. Иммуноглобулины в КВВ отражают формирование местного (мукозального иммунитета). Полученные данные свидетельствуют о том, что уменьшение концентрации иммуноглобулинов не наступает после ингаляции t-Не/О₂. Эти данные имеют принципиальное значение, дают основание исключить негативное влияние термического гелия и кислорода на продукцию иммуноглобулинов слизистой дыхательных путей. Таким образом, эффект газовой смеси не приводит к нарушению иммунологического барьера слизистых оболочек дыхательных путей.

Проведенные эксперименты демонстрируют тот факт, что драматического разрушения клеток с переносом в выдыхаемый воздух большого количества белков не наблюдается. С заметным разрушением клеток в КВВ должны были бы появляться сотни внутриклеточных белков, осуществляющих весь спектр метаболизма. Как продемонстрировано в наших предыдущих работах, значительная деструкция клеток респираторного тракта и как следствие – появление внутриклеточных белков характерны для протеомов КВВ больных пневмонией (гистоны, изоформа хромосомного белка гибкого шарнирного домена) и ХОБЛ (субъединица ДНК-зависимой РНК-полимеразы, транскрипционный фактор AP-2∆ и др.) [8]. Также мы наблюдали значительное увеличение количества внутриклеточных белков в КВВ космонавтов сразу после продолжительного полета и посадки спускаемого аппарата (центросомальный белок 290, каспаза – индуктор апоптоза, расщепляющий белок гольджин и пр.) [15].

Заключение

Таким образом, большая часть выдыхаемых белков одинакова до, после процедуры и 3-часовой релаксации. Полученные результаты демонстрируют относительную безопасность применения высокотемпературного гелиокса как терапевтического средства.

Масс-спектрометрический анализ образцов конденсата выдыхаемого воздуха проводился при финансовой поддержке гранта РФФИ 18-2909158 МК.

Об авторах

Сергей Дмитриевич Варфоломеев

ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; ФГБУН «Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля» РАН

Email: amryabokon@gmail.com

чл.-кор. РАН, д.х.н., проф., дир. Института физико-химических основ функционирования сети нейронов и искусственного интеллекта; науч. рук.

Россия, Москва

Александр Андреевич Панин

ООО «Медтехинновации»

Email: amryabokon@gmail.com

д.э.н, ген. дир.

Россия, Москва

Анна Монолитовна Рябоконь

ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; ФГБУН «Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля» РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: amryabokon@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9043-9129

к.х.н., науч. сотр. каф. химической энзимологии химического фак-та; ст. науч. сотр.

Россия, Москва

Анна Сергеевна Козырь

ФГБУН «Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля» РАН

Email: amryabokon@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6723-2963

аспирант

Россия, Москва

Алексей Сергеевич Кононихин

ФГБУН «Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля» РАН

Email: amryabokon@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2238-3458

к.ф.-м.н., ст. науч. сотр

Россия, Москва

Людмила Владимировна Шогенова

ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России; ГБУЗ «Городская клиническая больница им. Д.Д. Плетнева» Департамента здравоохранения г. Москвы

Email: amryabokon@gmail.com

к.м.н., доц. каф. госпитальной терапии педиатрического фак-та; врач анестезиолог-реаниматолог отд-ния реанимации и интенсивной терапии

Россия, Москва

Александр Григорьевич Чучалин

ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

Email: amryabokon@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5070-5450
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы