Changes in gut microbiota with bronchial asthma

Full Text

Введение

Микробиота человека представляет собой сложную живую экосистему, играющую важную роль в подержании здоровья. Состав кишечной микробиоты варьирует у отдельных индивидуумов, изменяется в течение жизни и зависит от большого количества факторов, в том числе от окружающей среды, образа жизни, диеты, лекарств, стрессов и инвазивных медицинских процедур. Кишечная микрофлора наиболее изучена благодаря применению в последние годы молекулярно-генетических методов исследования. Секвенирование 16S рибосомальной РНК позволяет идентифицировать микробиотические сообщества любой части организма и существенно расширить наши знания о микробиоме [1]. Нарушение в составе микрофлоры и ее метаболической активности может вызывать дисрегуляцию глубокой взаимосвязи функционирования разных органов и систем, способствовать появлению различных, в том числе аллергических, заболеваний [1–6].

Работы, посвященные изучению микрофлоры кишечника при иммунопосредованных заболеваниях, в настоящее время демонстрируют противоречивые результаты, в частности, некоторые исследования свидетельствуют об одновременном снижении уровня лактобактерий и бифидобактерий, другие не находят этому подтверждения, говоря о снижении только бифидобактерий [7, 8]. Типы и соотношения бактерий, которые защищают от бронхиальной астмы (БА), пока остаются неясными. На настоящее время большое значение в развитии аллергической сенсибилизации отводят снижению Faecalibacterium, Lachnospira, Rothia и Veillonella, Lactobacilli, Bacteroidetes, Bifidobacteria и увеличению Сoliform, Clostridia и Enterococci [7–11]. Прослежена взаимосвязь снижения Faecalibacterium prausnitzii и уменьшения уровня короткоцепочечных жирных кислот (бутирата, пропионата) с развитием атопической экземы в разных возрастных группах.

Цель исследования – проанализировать изменения кишечного микробиома при БА.

Материалы и методы

В исследование включены 40 пациентов с БА в стадии обострения и 15 клинически здоровых добровольцев, не курящих как минимум 3 года и не принимавших на протяжении предшествующих 3 мес антибактериальные препараты, а также пробиотики и пребиотики, ингибиторы протонной помпы, сахароснижающие препараты. Все респонденты подписали информированное согласие. Клиническая часть исследования выполнена на базе клиники пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и гепатологии имени В.Х. Василенко ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова». Всем пациентам проведен общепринятый спектр клинико-лабораторных исследований, включавший анализ крови, мокроты и мочи, биохимический анализ крови, исследование уровня иммуноглобулинов (класса A, G, E), С-реактивного белка, функции внешнего дыхания, рентгенологическое исследование легких. В исследование включались только пациенты с объемом форсированного выдоха за 1-ю секунду (ОФВ₁) меньше 80% от должного, что согласно Федеральным клиническим рекомендациям по диагностике и лечению бронхиальной астмы 2016 г. и GINA 2017 (Global Initiative for Asthma) соответствует БА средней степени тяжести и тяжелого течения [12]. Для лечения БА проводилась стандартная базисная терапия комбинированными препаратами, содержащими b₂-адреномиметики длительного действия и ингаляционные глюкокортикоиды (Серетид Мультидиск, Симбикорт Турбухалер и Форадил Комби, Фостер).

Для определения синдрома избыточного бактериального роста (СИБР) в тонкой кишке применяли стандартную методику водородного дыхательного теста (фирма Bedfont, Gastrolyzer). Образцы кала для проведения секвенирования 16S-рибосомальной РНК собирались в чистую одноразовую посуду и сразу же замораживались при температуре -80°С.

Метагеномный анализ кала проводился на базе Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Замороженные образцы помещали в контейнер со льдом для разморозки в течение 30 мин. Шпателем отбирали навеску образца массой 10 мкг и помещали в пробирки для гомогенизации, содержащие керамические шарики (MagNA Lyser Green Beads). К навеске образца добавляли 500 мкл лизирующего буфера MagNA Pure Bacteria Lysis Buffer (Roche, Германия) и 20 мкл протеиназы K (QIAGEN, Германия). Пробирки с образцами инкубировали в течение 10 мин при 65°C, затем еще 10 мин при 95°C. Далее образцы гомогенизировали с помощью автоматического гомогенизатора MagNA Lyser (Roche) согласно инструкции производителя, после чего центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 10 мин. Полученный супернатант (400 мкл) использовался для дальнейшего выделения нуклеиновых кислот. Тотальную ДНК выделяли с использованием реагентов MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I (Roche) согласно инструкции производителя в системе для автоматического выделения нуклеиновых кислот MagNA Pure LC. Выделенную ДНК хранили при -20°C. Для качественной и количественной оценки ДНК использовали NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, США). Подготовка 16S-метагеномных библиотек осуществлялся в соответствии с протоколом 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Illumina, США), рекомендованным Illumina для секвенатора MiSeq. Очищенные ампликоны смешивали эквимолярно в соответствии с полученными концентрациями. Качество приготовленного пула библиотек проводили на приборе Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, США) с использованием набора Agilent DNA 1000 Kit. Секвенирование проводили на приборе MiSeq (Illumina) в режиме парно-концевых прочтений (2×150 нуклеотидов) с использованием набора MiSeq Reagent Kit v2. Полученные прочтения были отфильтрованы по качеству и обрезаны с 3’-конца при помощи Trimmomatic 24695404. Дальнейшая обработка данных проводилась в среде R и Python. Для оценки общего числа родов, семейств и др. (индексы Шеннона, Чао1, ACE) использовались пакеты vegan и fossil.

Статистический анализ данных проводился с помощью программы Statistica 10 (StatSoft Inc., США). При сравнении двух групп использовался непараметрический критерий Манна–Уитни, нескольких – критерий Краскела–Уоллиса. Значимость оценивалась как вероятность совершить ошибку первого рода (р): р≤0,05 считалось значимым. Корреляционный анализ проведен при помощи корреляции Спирмена. Учитывалось, если модуль корреляции r≤0,25 – корреляция слабая, 0,25<r<0,75 – умеренная сила корреляционной связи, r≥0,75 – корреляция сильная.

Результаты

Включенные в исследование больные астмой (20 человек с аллергической астмой – АА, 20 человек с неаллергической астмой – НА) и клинически здоровые лица были сравнимы по возрасту (43,6±12,5 года vs 44,1±11,7 года vs 46,7±9,7 года; р=0,64), индексу массы тела (25,0±3,4 кг/м² vs 25,9±2,9 кг/м² vs 26,2±4,5 кг/м²; р=0,28) и полу (мужчины/женщины: 11/9 vs 9/11 vs 6/9; р=0,789). Пациенты групп АА и НА были сравнимы по длительности анамнеза (20,06±10,2 vs 18,8±8,6; р=0,37) и тяжести течения БА. В зависимости от наличия СИБР в тонкой кишке пациенты были распределены на подгруппы по 10 человек каждая: АА СИБР(+) и АА СИБР(-), НА СИБР(+) и НА СИБР(-).

Сравнение кишечного микробиома на разных таксономических уровнях между исследуемыми группами представлено в таблице.

 

Состав кишечного микробиома (%) на разных таксономических уровнях у клинически здоровых лиц, пациентов с аллергической и неаллергической БА

Таксономическая группа бактерий		Здоровые	АА	НА	р
Филум Firmicutes		78,76	72,07	75,69	0,25
Класс Clostridia		76,40	68,49	66,7	0,2
Порядок Clostridiales		75,17	68,78	67,6	0,27
Род Blautia		7,7	10,6	6,3	0,28
Род Clostridium IV		1,8	1,86	5,4	0,47
Семейство Ruminococcaceae		31,8	29,9	30,8	0,39
Род Faecalibacterium		12,4	7,9	6,64	0,03* **
Род Ruminococcus		2,68	1,73	2,9	0,22
Род Ruminococcus 2		3,00	4,5	5,5	0,16
Семейство Acidaminococcaceae		0,26	0,28	0,59	0,46
Семейство Lachnospiraceae		35,7	31,19	30,40	0,28
Род Anaerostipes		2,9	0,7	0,73	0,05
Род Coprococcus		0,85	1,5	0,87	0,18
Род Dorea		0,8	0,68	0,64	0,29
Род Lachnospira		2,6	1,5	3,6	0,14
Род Roseburia		2,8	2,78	2,1	0,32
Семейство Peptostreptococcaceae		0,61	0,24	0,15	0,15
Класс Bacilli		0,07	1,57	0,23	0,05
Порядок Lactobacillales		0,068	1,53	0,2	0,09
Класс Negativicutes		0,53	0,46	1,05	0,35
Семейство Veillonellaceae		0,24	0,16	0,38	0,27
Класс Erysipelotrichia		1,52	0,72	6,2	0,16
Семейство Erysipelotrichaceae		1,5	0,69	6,05	0,16
Род Holdemanella		0,99	0,3	4,9	0,16
Филум Actinobacteria		0,85	0,96	0,44	0,39
Класс Actinobacteria		0,85	0,95	0,45	0,4
Семейство Bifidobacteriaceae		0,7	0,52	0,12	0,35
Род Bifidobacterium	0,4	0,4	0,05	0,48
Семейство Coriobacteriaceae		0,2	0,26	0,29	0,25
Филум Bacteroidetes		12,98	15,22	10,59	0,37
Класс Bacteroidia		12,54	14,9	10,35	0,3
Семейство Bacteroidaceae		2,9	3,2	2,02	0,43
Род Bacteroides		2,9	3,1	1,92	0,43
Семейство Prevotellaceae		4,5	8,03	5,67	0,28
Род Prevotella		3,9	7,8	4,5	0,25
Семейство Rikenellaceae		2,9	1,94	1,04	0,05**
Род Alistipes		2,6	1,8	0,96	0,05**
Филум Proteobacteria		0,55	5,92	9,90	0,002
Класс Betaproteobacteria		0,06	1,19	0,12	0,05*
Порядок Burkholderiales		0,06	0,2	0,1	0,03*
Класс Grammaproteobacteria		0,33	3,35	9,6	0,04* **
Семейство Enterobacteriaceae		0,3	2,71	8,87	0,04**
Род Escherichia/Shigella		0,16	0,1	6,6	0,05**
Семейство Moraxellaceae		0,02	0,212	0,09	0,04* **
Филум Verrucimicrobia		1,70	2,21	0,29	0,4
Класс Verrucomicrobiae		1,68	2,23	0,28	0,39
Семейство Verrucomicrobiaceae		1,64	2,21	0,28	0,39
Род Akkermansia		1,65	2,15	0,26	0,4
Примечание. Если не указано иное, сравнение проводилось методом Краскела–Уоллиса. *Критерий Манна–Уитни при сравнении больных АА и здоровых лиц; **критерий Манна–Уитни при сравнении больных НА и здоровых лиц.

 

Наиболее распространенный тип бактерий в исследуемых группах представлен Firmicutes. Тип Firmicutes включает в себя большинство аэробных и анаэробных грамположительных бактерий. Внутри этого типа у больных БА отмечены увеличение по сравнению с группой контроля бактерий класса Bacilli (р=0,05) и снижение рода Anaerostipes; р=0,05 (семейство Lachnospiraceae) и рода Faecalibacterium; р=0,03 (семейство Ruminococcaceae). Оба этих рода являются важнейшими продуцентами масляной кислоты (бутирата) в толстой кишке.

Второй по распространенности тип бактерий кишечного микробиома представлен Bacteroidetes, объединяющим грамотрицательные сахаролитические неспорообразующие строгие анаэробы. У пациентов с БА вне зависимости от фенотипа заболевания выявлено снижение (р=0,05) представителей семейства Rikenellaceae (род Alistipes), продуцирующих уксусную кислоту (ацетат), а также изовалериановую и янтарную кислоты.

Доля типа Proteobacteria, куда входит большинство грамотрицательных бактерий, по большей мере представляющих факультативные или облигатные анаэробы, увеличивается у пациентов с астмой (р=0,002). При АА тип Proteobacteria изменяется за счет классов Betaproteobacteria и Gammaproteobacteria, а при неаллергическом фенотипе заболевания – только за счет класса Gammaproteobacteria.

Типы Verrucimicrobia и Actinobacteria выявлены в незначительном количестве как у здоровых лиц, так и у больных БА.

Кишечная микробиота при БА характеризовалась столь же разнообразным таксономическим составом метагеномов, что и микробиота здоровых добровольцев. Индекс Шеннона, демонстрирующий выравненность бактериальных сообществ, составил 1,27±0,2 в группе контроля и 1,23±0,3 у пациентов с БА. Индексы Чао1 и АСЕ, свидетельствующие о видовом разнообразии биотопа, составили 22,32±1,2 и 20,22±1,8 у здоровых лиц, а при БА – 32,58±2,3 и 27,65±4,2 соответственно (р=0,0002 и р=0,001). Увеличение индексов Чао1 и АСЕ связано с увеличением Proteobacteria в группе пациентов, страдающих БА.

Сравнительный анализ таксономического состава метагеномных образцов кала выявил значимые изменения кишечного микробиома с учетом СИБР-статуса пациентов. В группе лиц, имеющих аллергический фенотип заболевания, выявлены достоверные различия на уровне отдельных классов, семейств и родов. Так, у пациентов группы АА СИБР(+) по сравнению с АА СИБР(-) отмечено снижение относительного количества бактерий, относящихся: к классам Negativicutes (77,9 vs 216,9; р=0,0008), Erysipelotrichia (69,5 vs 424,1; р=0,01), Bacteroidia (2521,2 vs 7200,5; р=0,05); к семействам Erysipelotrichaceae (69,5 vs 424,1; р=0,01), Pseudomonadaceae (0,7 vs 7,3; p=0,02), Rhodospirillaceae (0,4 vs 4,5; p=0,04), Bacillaceae (0,2 vs 0,7; p=0,02), увеличению Porphyromonadaceae (177,8 vs 158,8; р=0,02); к родам Barnesiella, Paraprevotella, Pyrolobus, Bifidobacterium, Pseudomonas, Coprobacter, Bacillus (р<0,05).

У лиц с НА в случае СИБР(+) при сравнении с СИБР(-) наблюдалось повышение относительного количества бактерий, относящихся к семейству Bacteroidaceae (1276,6 vs 213,5; р=0,04); к родам Paraprevotella, Odoribacter, Bacteroides, Butyricicoccus, Parasutterella (р<0,05).

Общим параметром, характерным для обеих обследуемых групп, служат выявленные изменения представленности Moraxella (p<0,05); см. рисунок на цветной вклейке.

 

Распределение бактериальных семейств состава микробиоты кишечника в исследуемых подгруппах: а – при наличии СИБР. Примечание. Ширина прямоугольника – межквартильный интервал, отрезки – размах без выбросов (*р<0,05; **р<0,05).

 

Распределение бактериальных семейств состава микробиоты кишечника в исследуемых подгруппах: б – в отсутствие СИБР. Примечание. Ширина прямоугольника – межквартильный интервал, отрезки – размах без выбросов.

 

Проведенный корреляционный анализ изменений таксономического состава бактерий и клинико-лабораторных проявлений БА позволил выявить разной силы положительные и отрицательные корреляционные зависимости. При аллергической БА изменения Anaerostipes имели обратную корреляционную зависимость с анамнезом заболевания (-0,28), уровнем эозинофилов крови (-0,46) и мокроты (-0,45), значениями иммуноглобулина E (0,26) и ОФВ₁ (0,24). Уровень Faecalibacterium демонстрировал обратную корреляцию с длительностью анамнеза (-0,29) и эозинофилами мокроты (0,31) и крови (0,25), уровнем иммуноглобулина E (0,29). Количество Proteobacteria коррелировало с длительностью анамнеза (0,33) и ОФВ₁ (-0,25). У пациентов с неаллергической БА с длительностью анамнеза выявлена обратная корреляция уровня Anaerostipes (-0,27), Faecalibacterium (-0,30), Bacilli (-0,35), Alistipes (-0,46). Получена прямая корреляция анамнеза с Рroteobacteria (0,30) и Moraxellaceae (0,57). Значения ОФВ₁ демонстрировали обратную зависимость от Рroteobacteria (-0,29).

Обсуждение

Сообщество микроорганизмов кишечника у пациентов с астмой характеризуется столь же биоразнообразным таксономическим составом метагеномов, что и микробиота здоровых добровольцев, однако подвергается качественной и количественной модификации. У пациентов с БА отмечено увеличение доли Proteobacteria за счет классов Betaproteobacteria и Gammaproteobacteria при АА, а при неаллергическом фенотипе заболевания – преимущественно за счет класса Gammaproteobacteria. Proteobacteria содержат липополисахаридный комплекс, который обладает способностью активировать воспалительный каскад реакций Th-2-опосредованного иммунного ответа и способствует повышению проницаемости кишки [5, 8].

При БА выявлено нарушение метаболической функции кишечного микробиома: снижается доля таксонов, продуцирующих бутират (Anaerostipes, Faecalibacterium) и ацетат (Alistipes). Бутират и ацетат принимают участие в энергообеспечении эпителия, регуляции пролиферации и дифференцировки эпителиальных клеток, активации местного и системного иммунитета, поддержании ионного обмена, влияют на моторику кишечника, оказывают антибактериальный эффект и многое другое. Установлено, что уменьшение производства короткоцепочечных жирных кислот приводит к сдвигу в сторону Т-хелперов 2-го типа и формированию провоспалительного иммунного ответа [3, 6, 11, 12]. Таким образом, выявленные изменения кишечной микробиоты соответствуют уменьшению доли строгих анаэробов-симбионтов и увеличению доли условно-патогенных факультативных анаэробов в ее составе. Нами впервые были проанализированы изменения кишечного микробиома у больных в зависимости от наличия у них СИБР в тонкой кишке при разных фенотипах заболевания. Полученные различия в представленности таксонов требуют дальнейших исследований. В целом изменения состава микрофлоры согласуются с современными представлениями о роли микробиоты в патогенезе БА [7–11]. Трансформация состава кишечной микрофлоры, вероятно, служит не только следствием прогрессирования заболевания, но и важным фактором, активно вовлеченным в его патогенез, в том числе определяющим выраженность и характер воспаления, а также фенотипические особенности БА, что подтверждается выявленными в ходе исследования корреляционными зависимостями.

В связи со сказанным актуальным и интересным представляется вопрос о возможности назначения пробиотических препаратов для коррекции кишечной микрофлоры у пациентов с БА. Результаты нашего исследования, опубликованного ранее, также подтвердили взаимосвязь изменений микробиоты кишечного биотопа, проявляющегося в виде избыточного бактериального роста в тонкой кишке с развитием аллергического фенотипа БА (67%), высокого уровня иммуноглобулина E и эозинофилов мокроты (р<0,001). Добавление к стандартной терапии препаратов, направленных на коррекцию состава кишечной микрофлоры, рифаксимина и пробиотического препарата (Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus rhamnosus) способствовало улучшению иммунологических показателей и функции внешнего дыхания, а также снижению частоты госпитализаций в течение последующего года наблюдения за больными (р<0,01) [13].

Комбинации лактобактерий и бифидобактерий, используемые в современных пробиотиках, оправданы с позиции их потенцирующего действия, хорошо известного и изученного бактериального синергизма. Принципиально важным остается вопрос, какие именно штаммы микроорганизмов обладают максимальным эффектом. Высокоактивные лактобактерии и бифидобактерии представлены в мультиштаммовом препарате Лактобаланс^®. Каждая капсула содержит не менее 3 млрд пробиотических микроорганизмов (3,0×10⁹ КОЕ в капсуле): Lactobacillus gasseri KS-13, Lactobacillus gasseri LAC-343, Lactobacillus ramnosus LCS-742, Bifidobacterium bifidum G9-1, Bifidobacterium longum MM-2, Bifidobacterium longum BB536 Strain M, Bifidobacterium infantis M-63, Bifidobacterium breve M16V тип Т, Bifidobacterium lactis B1-04. Штаммы бактерий пробиотика Лактобаланс^® устойчивы к воздействию желудочного сока, пищеварительных ферментов и желчных кислот, что позволяет сохранить им высокую биологическую активность, создавая оптимальные условия для роста нормальной микрофлоры. Нормализация состава кишечной микрофлоры – важный фактор для поддержания адекватного функционирования кишечного барьера и поддержания иммунологической толерантности, что в случае пациентов с БА оказывает огромное влияние на течение основного заболевания.

Заключение

Результаты нашего исследования свидетельствуют о различиях микробиоты кишечника у здоровых лиц и пациентов с БА, их корреляциях с клинико-лабораторными проявлениями заболевания. Необходимо дальнейшее изучение микробиоты, которое позволит раскрыть новые звенья патогенеза заболевания и разработать новые подходы к терапии и профилактике.

About the authors

O. Yu. Zolnikova

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Author for correspondence.
Email: ks.med@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6701-789X

к.м.н., доц. каф. пропедевтики внутренних болезней лечебного фак-та

Russian Federation, Moscow

N. D. Potskhverashvili

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: ks.med@mail.ru

врач отд-ния пульмонологии клиники пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и гепатологии

Russian Federation, Moscow

A. V. Kudryavtseva

Engelhardt Institute of Molecular Biology

Email: ks.med@mail.ru

в.н.с. лаб. постгеномных исследований

Russian Federation, Moscow

G. S. Krasnov

Engelhardt Institute of Molecular Biology

Email: ks.med@mail.ru

с.н.с. лаб. постгеномных исследований 

Russian Federation, Moscow

Z. G. Guvatova

Engelhardt Institute of Molecular Biology

Email: ks.med@mail.ru

ст. лаборант лаб. постгеномных исследований

Russian Federation, Moscow

A. S. Truhmanov

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: ks.med@mail.ru

д.м.н., проф. каф. пропедевтики внутренних болезней лечебного фак-та

Russian Federation, Moscow

N. I. Kokina

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: ks.med@mail.ru

к.м.н., доц. каф. пропедевтики внутренних болезней лечебного факультета

Russian Federation, Moscow

V. T. Ivashkin

Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: ks.med@mail.ru

акад. РАН, д.м.н., проф., зав. каф. пропедевтики внутренних болезней лечебного фак-та, дир. клиники пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и гепатологии

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files